滤纸片十字交叉法
土木香内生真菌YIGZ-3抗菌活性及菌种鉴定
土木香内生真菌YIGZ-3抗菌活性及菌种鉴定阿塞木古丽·热音拜克;吾鲁木汗·那孜尔别克;恩特马克·布拉提白【摘要】采用组织分离法从药用植物土木香根、茎和叶片中分离出32株内生真菌,通过纸片扩散法测定20株土木香内生真菌,筛选出1株具有较强抑菌活性的菌株,命名为YIGZ-3.用薄层层析法(TLC)法和高效液相色谱法(HPLC)法检测其发酵液中的土木香内脂,通过形态学特征观察和rRNA基因内转录间隔区(ITS)序列分析对菌株进行鉴定.结果显示:菌株YIGZ-3对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均有较强的抑菌活性,其发酵液中检测到与土木香内脂相似的化合物,根据真菌形态特征和ITS序列同源性鉴定表明菌株YIGZ-3为塔宾曲霉菌(Aspergillus tubingensis).【期刊名称】《吉首大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(038)005【总页数】6页(P71-76)【关键词】土木香;内生真菌;抑菌活性;土木香内酯;鉴定【作者】阿塞木古丽·热音拜克;吾鲁木汗·那孜尔别克;恩特马克·布拉提白【作者单位】吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首416000;伊犁师范学院生物与地理科学学院,新疆伊宁835000;伊犁师范学院生物与地理科学学院,新疆伊宁835000【正文语种】中文【中图分类】R285.5植物内生真菌(Endophyte fungus)是指在植物宿主中度过部分或全部生活周期而不使宿主植物表现明显病理症状的一类真菌.[1]根据Strobel提出的“内共生理论”，内生真菌除了可产生与宿主植物次生代谢产物相同或者相似的物质外，还可以产生其他的活性物质，它们对宿主植物生长发育、对外界环境的应激耐受性、有效活性成分的产生与积累等方面有重要影响[2].1993年Stierle等[3]从短叶红豆杉的韧皮部分离得到一株产紫杉醇的内生真菌安德氏紫衫霉(Taxomyces andreanae)后，国内外学者从多种药用植物中陆续分离得到产活性物质的内生真菌[4-5].因此，药用植物内生真菌已成为活性天然产物的重要资源.土木香(Inula helenium L.)属于菊科旋覆花属的多年生草本植物，主要分布于河南、河北、浙江、四川、山西、陕西、甘肃及新疆等地.土木香具有健脾和胃、调气解郁、止痛安胎的功能，临床常用于治疗脘腹胀痛、呕吐泻痢、胸胁挫伤、岔气作痛、胎动不安等症状.[6]土木香中主要的化学成分是倍半萜内酯类，包括土木香内酯、异土木香内酯、土木香醇、土木香酸、二氢土木香内酯等，其中含量较高的为土木香内酯和异土木香内酯[7-8].研究结果证实土木香内酯和异土木香内酯具有抑制肿瘤、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降血糖和利胆等作用[9-11]，土木香的乙醇提取物还具有镇痛作用[12].按照“内共生理论”推测土木香内生真菌也可能产生具有类似活性的次生代谢产物.为此，本课题组深入挖掘了土木香内生真菌资源，发现了具有较强抑菌活性的菌株YIGZ-3.本试验对菌株YIGZ-3发酵液的抑菌活性进行评价，检测其代谢产物并对菌株进行鉴定，旨在筛选出能产生土木香内酯的内生真菌，为发酵生产土木香内酯及土木香的综合开发奠定基础.1.1 材料1.1.1 菌株内生真菌YIGZ-3分离自新疆伊犁尼勒克县唐布拉草原野生土木香根部，15%甘油管置于-80 ℃冰箱保存.大肠杆菌CGMCC1.1103、枯草芽胞杆菌CGMCC1.769、金黄色葡萄球菌CGMCC1.8721和白色念球菌ATCC10123均由伊犁师范学院微生物资源保护与开发利用重点实验室保存.1.1.2 试剂与培养基薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)；乙晴(天津市福晨化学试剂厂)；土木香内酯对照品(上海原叶生物科技有限公司)；真菌基因组提取试剂盒、PCR试剂和DNA marker(大连宝生物工程公司).PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；牛肉膏蛋白胨培养基用于指示菌的培养；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基用于真菌的活化和培养.1.1.3 仪器设备 UltiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；IKA-RV10旋转蒸发仪(德国IKA集团/艾卡广州仪器设备有限公司)；KQ5200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AG22351梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；NIKON801荧光正置显微镜(日本三洋科研医疗设备厂)；GelDoc-It TS2凝胶成像分析系统(北京赛百奥科技有限公司).1.2 方法1.2.1 真菌发酵液的制备将菌株YIGZ-3接种于PDA固体液体培养基中28 ℃活化6 d后，转接至50 mL的PDB液体培养基中28 ℃、180 r/min摇床培养7 d.发酵液经9 000 r/min离心15 min，取上清备用.1.2.2 指示菌制备将大肠杆菌，枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中37 ℃恒温箱培养24 h，将白色念球菌接种于PDB液体培养基28 ℃培养48 h，经离心收集菌体后，将菌体悬浮于5 mL的生理盐水制备菌悬液.1.2.3 抑菌活性测定采用纸片扩散法测定土木香内生真菌YIGZ-3发酵液的抑菌活性.用生理盐水分别对各指示菌菌悬液进行梯度稀释，稀释至约1 × 106 CFU/mL.取100 μL指示菌菌液接种涂抹于PDA固体培养基上，用无菌玻璃环充分涂布后，在适当位置贴上已灭菌的滤纸片(φ=5 mm)，然后吸取发酵上清液20 μL点在滤纸片上，同时以发酵培养基作阴性对照.将带有白色念球菌的平板置28 ℃恒温培养箱培养24 h，其余带菌平板置37 ℃恒温培养箱培养24 h.平行试验重复3次，十字交叉法测量抑菌圈直径.1.2.4 标准对照品的制备精密称取1 mg土木香内酯标准品，加甲醇溶剂定容至10 mL，摇匀，得土木香内酯质量浓度为100 mg/L的标准对照品溶液.1.2.5 土木香内酯的提取将菌株YIGZ-3接种于PDB液体培养基中，28 ℃，180r/min摇床培养7 d后过滤.取过滤后的发酵液50 mL用旋转蒸发仪浓缩挥干，加甲醇少量，再移入10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，超声波处理45 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清，用0.45 μm的过滤器过滤，作供试品溶液.同时将菌株YIGZ-3菌丝体在60℃干燥箱中烘干至恒重，研磨成粉末.称取菌丝体粉末2.0 g，加甲醇溶剂定容至50 mL，超声处理45 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清，用0.45 μm过滤器过滤，作供试品溶液.1.2.6 土木香内酯的TLC检测吸取上述供试品溶液、标准品溶液分别点样于薄层硅胶板上，石油醚-苯-乙酸乙酯(15∶2∶2)为展开剂展开，置层析缸内，待溶剂前沿到达距薄层板上端1～2 cm时取出，然后迅速晾干，把薄层硅胶板放入5%硫酸-乙醇显色液中，110℃显色.比较供试品与标准对照品斑点的颜色、位置及其Rf 值，可初步筛选出产土木香内酯的菌株.1.2.7 土木香内酯的HPLC检测色谱柱Hypersil GoldTMRP18 4.6 nm×150 nm，5 μm保护柱；流动相乙腈和0.1%磷酸水溶液(体积比60∶40)；流动相流速1.0 mL/min；检测波长194 nm；柱温30 ℃；进样体积20 μL.通过高效液相色谱检测可确定菌株YIGZ-3能否产土木香内酯.1.2.8 真菌形态学观察采用真菌插片培养法对菌株YIGZ-3的菌落、菌丝体和孢子等特征进行显微镜观察，参照文献[13]和文献[14]进行鉴定.1.2.9 rRNA基因ITS序列测定及分析用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株YIGZ-3的基因组DNA.用通用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′)经PCR从菌株YIGZ-3基因组DNA中扩增出ITS序列.PCR反应体积50 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min.PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司完成测序.依据测序结果，在NCBI数据库中用Blast软件进行菌株rRNA基因ITS序列对比.选取相似性较高菌株序列，用ClastalX和MEGA4.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析系统进化树构建，拓扑结构分析采用1 000次重复取样.2.1 菌株YIGZ-3抑菌活性抑菌试验结果显示，菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的抑菌圈直径分别为18.3，6.32，7.21，19.4 mm(图1).表明菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌和白色念球菌有较强的抑菌活性，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性较弱.2.2 菌株YIGZ-3次生代谢产物的TLC检测TLC检测结果显示，用硫酸-乙醇显色液显色后，在菌株YIGZ-3发酵液、菌丝体甲醇提取液中出现与土木香内酯标准品颜色和Rf值相同的蓝色斑点(图2)，初步确定菌株YIGZ-3可能产生土木香内酯，而菌株YIGZ-3菌丝体甲醇提取液中还出现2～3个未知的化合物(斑点).2.3 菌株YIGZ-3次生代谢产物的HPLC检测HPLC检测显示，土木香内酯标准品在11.6 min出现峰值.菌株YIGZ-3发酵液和菌丝体提取液以及土木香根提取液与标准品在相同的时间处出现相同的吸收峰(图3).结合TLC检测结果，可确定菌株YIGZ-3的发酵液和菌丝体提取液中均含有土木香内酯.2.4 菌株YIGZ-3的形态学学鉴定菌落特征：菌株YIGZ-3菌落在28 ℃培养基上7天后，其菌落的直径可达到40～45 mm，菌落颜色从起初的黄色随着时间渐渐变为黑白圈状(图4)，而菌落反面呈黄色(图4).显微镜观察结果显示，菌株YIGZ-3的气生菌丝较分散，菌丝分枝，长稍弯曲，有些像树枝，分生孢子呈球状.菌株YIGZ-3菌落、菌丝体和分生孢子的形态特征相似于曲霉菌属.2.5 菌株YIGZ-3的分子生物学鉴定琼脂糖凝胶电泳结果显示，通过PCR从菌株YIGZ-3基因组DNA中扩增出大小约为550 bp的DNA条带(图5)，与预期值相符.DNA测序结果表明，菌株YIGZ-3的ITS序列大小为577 bp，其GenBank登录号为KY552623.将测定的核苷酸序列与GenBank中的已知序列进行Blast比对分析，结果显示，菌株YIGZ-3与Aspergillus tubingensis strain GX1-5E(登录号GU595290)ITS序列的相似性为99%.由菌株YIGZ-3的ITS序列与其他种属菌种的相应序列构建系统进化树(图6)，结果显示菌株YIGZ-3与Aspergillus是同一个属.结合形态学分类结果，将菌株YIGZ-3鉴定为曲霉菌属有效发表种Aspergillus tubingensis的一个菌株.土木香是我国传统的中药，其主要成分土木香内酯和异土木香内酯是常用抗菌药物，并具有抑制肿瘤、驱虫、抗菌、抑制平滑肌、降血糖、利胆和镇痛等药理作用，在临床上用量很大.但土木香生长周期长、产量低，因盲目开采，导致大部分野生土木香处于濒危或渐危状态，人们试图通过其他途径获得土木香的有效成分土木香内酯和异土木香内酯，但目前有关土木香内生真菌的研究国内外尚未见报道.为此，本课题组采用组织分离法从药用植物土木香根部分离得到32株菌落形态特征有差异的内生真菌，其中菌株YIGZ-3具有较强抑菌活性.本研究采用纸片扩散法测定菌株YIGZ-3发酵液对4种指示菌的抑菌活性，运用TLC和HPLC检测菌株YIGZ-3次生代谢产物中的土木香内酯，并对其进行形态学和分子生物学鉴定.抑菌试验结果显示，菌株YIGZ-3发酵液对大肠杆菌和白色念球菌有较好的抑菌作用，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用较弱，表明菌株YIGZ-3发酵液对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌抑菌活性可能有一定的差异.通过TLC和HPLC从菌株YIGZ-3发酵液和菌丝体提取液中检测到类似于土木香内酯的次生代谢物，表明该菌株可能合成与宿主植物土木香相似的土木香内酯.采用形态学和分子生物学相结合的方法将菌株YIGZ-3鉴定为塔宾曲霉菌(Aspergillus tubingensis).本研究结果为发酵生产土木香内酯及土木香的综合利用提供了科学依据，同时也为药用植物内生菌的研究提供了新资料.此外，本研究是定向筛选能产生土木香内酯的真菌，此过程容易导致其他重要的有效成分，如异土木香内酯、土木香醇和土木香酸等成分不能被发现，因此，还需要研究来探索土木香内生真菌是否还产生其他有益的活性成分.【相关文献】[1] STURZ A V,NOWAK J.Endophytic Communities of Rhizobacteria and the Strategies Required to Create Yield Enhancing Associations with Corps[J].Applied SoilEcology,2000,15(2):183-190.[2] STROBEL G A.Rainforest Endophytes and Bioactive Products[J].Critical 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[4] YANG Kai,LIANG Jie,LI Qinfan,et al.Cladosporium Cladosporioides XJ-AC03,an Aconitine-Producing Endophytic Fungus Isolated from Aconitum Leucostomum[J].World Journal Microbiology Biotechnology,2013,29(5):933-938.[5] 厉秀秀,方玉鹏,赖毕,等.黄连产小檗碱内生真菌的分离鉴定[J].草地学报,2013,21(5):1 005-1 011.[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典，一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：253.[7] HUO Y,SHI H,LI W,et al.HPLC Determination and NMR Structural Elucidation of Sesquiterpene Lactones in Inula Helenium[J].Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,2010,51(4):942-946.[8] 张嫚丽,霍长虹,刘丽,等.土木香药材HPLC指纹图谱研究及土木香内脂和异土木香内酯测定[J].中草药,2010,41(9):15-39.[9] DORN D C,ALEXENIZER M,HENGSTLER J G,et al.Tumor Cell Specific Toxicity of Inula Helenium Extracts[J].Phytotherapy Research,2006,20(11):970-980.[10] LI Y,NI Z Y,ZHU M C,et al.Antitumour Activities of Sesquiterpene Lactones From Inula Helenium and Inula Japonica[J].Zeit schrift Für Naturforschung C,2012,67(7/8):375-380. 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十字交叉法化学
十字交叉法化学
十字交叉法是一种常用的化学实验方法，用于确定化合物的化学式和结构。
它是通过观察和分析化合物在不同条件下的性质和反应来推断其组成和结构的。
在进行十字交叉法实验时，我们首先需要准备一系列反应试剂和实验设备。
然后，我们将待测化合物与不同试剂进行反应，观察其产生的沉淀、气体、颜色变化等现象。
根据这些观察结果，我们可以初步判断化合物中可能含有的元素和官能团。
接下来，我们可以进一步利用其他试剂和方法对化合物进行进一步的测试和分析。
例如，我们可以使用酸碱滴定法来确定化合物的酸碱性质，使用氢氧化钠溶液来检测是否含有酸性官能团，使用银镜反应来测试是否含有醛基等。
在进行实验过程中，我们还可以利用红外光谱、质谱、核磁共振等仪器来对化合物进行进一步的表征和分析。
这些仪器可以提供更加详细和准确的化合物结构信息，帮助我们确定化合物的分子式和结构。
十字交叉法的优点是简单易操作、经济实用，可以在实验室中常规使用。
它可以快速提供化合物的初步信息，为后续的进一步分析和研究提供基础。
然而，十字交叉法也有一些局限性，例如对于复杂的化合物或含有多个相似官能团的化合物，可能需要更加复杂的实
验和分析方法来确定其结构。
总结起来，十字交叉法是一种常用的化学实验方法，通过观察和分析化合物在不同条件下的性质和反应来推断其组成和结构。
它可以为化学研究和分析提供有价值的信息，是化学实验中不可或缺的一种方法。
在进行实验时，我们需要仔细记录观察结果，并结合其他分析手段进行综合判断，以确保结果的准确性和可靠性。
桑枝活性成分的提取及其抑菌和抗氧化作用
冯馨慧，刘志明，王海英．桑枝活性成分的提取及其抑菌和抗氧化作用［Ｊ］．江苏农业科学，２０２０，４８（７）：２１７－２２１．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２０．０７．０４１桑枝活性成分的提取及其抑菌和抗氧化作用冯馨慧１，刘志明２，王海英１（１．东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨１５００４０；２．东北林业大学材料科学与工程学院，黑龙江哈尔滨１５００４０） 摘要：以桑枝作为原料，研究其乙醇提取物的抑菌活性和抗氧化活性。
气相色谱－质谱分析结果表明，桑枝乙醇提取物的挥发性组分，主要由酯类（４７．７６％）、烷烃类（２０．２７％）、芳香烃类（１５．８４％）等化合物组成，ＧＣ含量最高的化合物是邻苯二甲酸二丁酯（４１．２０％），ＧＣ含量较高的化合物为十一烷（２０．２７％）。
桑枝乙醇提取物的抑菌活性研究结果表明，桑枝乙醇提取物对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）具有较好的抑菌活性，抑菌圈直径为（１１．７７±０．５４）ｍｍ。
桑枝乙醇提取物的抗氧化活性研究结果表明，桑枝乙醇提取物５０％ＤＰＰＨ自由基清除率质量浓度（ＩＣ５０）为１．５７０ｍｇ／ｍＬ，维生素ＣＩＣ５０为０．００１ｍｇ／ｍＬ。
桑枝乙醇提取物５０％羟基自由基清除率质量浓度（ＩＣ５０）为６８．４３７ｍｇ／ｍＬ，维生素ＣＩＣ５０为７．０８２ｍｇ／ｍＬ。
桑枝乙醇提取物对ＤＰＰＨ自由基具有较好的清除作用。
关键词：桑；气相色谱－质谱；乙醇提取物；抑菌活性；抗氧化活性 中图分类号：Ｒ２８４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２０）０７－０２１７－０４收稿日期：２０１９－０３－１１基金项目：国家重点研发计划（编号：２０１６ＹＦＤ０６００８０５－０１）；省级财政林业科研专项经费（编号：２０１５１４）；技术开发项目企业横向课题（编号：０７０４３２１５００３）。
作者简介：冯馨慧（１９９４—），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事植物资源开发利用研究。
植物生理学实验
实验名称：植物含水量的测定实验目的：掌握测定植物组织的含水量的方法实验原理：利用水遇热蒸发为水蒸汽的原理，可用加热烘干法来测定植物组织中的含水量。
植物组织含水量的表示方法，常以鲜重或干重 % 表示，有时也以相对含水量 % （或称饱和含水量 % ）表示。
后者更能表明它的生理意义。
实验材料与设备：（一）材料：植物鲜组织。
（二）仪器设备：天平（感量1/1000g）；烘箱；干燥器；剪刀；搪瓷盘；塑料袋；纸袋；吸水纸等。
实验步骤：⒈鲜重测定迅速剪取植物材料，装入已知重量的容器（或塑料袋）中，带入室内，用分析天平称取鲜重（FW）。
⒉干重测定提前把烘箱打开，温度升至100~105℃。
把称过鲜重的植物材料装入纸袋中，放入烘箱内，100~105℃杀青10min，然后把烘箱的温度降到70~80℃左右，烘至恒重。
取出纸袋和材料，放入干燥器中冷却至室温，称干重（DW）。
⒊饱和鲜重测定将称过鲜重的植物材料浸入水中，数小时后取出，用吸水纸吸干表面水分，立即称重；再次将材料放入水中浸泡一段时间后，再次取出，吸干表面水分，称鲜重，直到两次称重的结果基本相等，最后的结果即为饱和鲜重（SFW）。
若事先已知达到水分饱和所用的时间，则可一次取得饱和鲜重的测量定值。
⒋取得以上数据后，按公式计算组织含水量、相对含水量。
思考题：测定饱和含水量时，植物材料在水中浸泡时间过短或过长会出现什么问题？实验名称：植物组织水势的测定（小液流法）实验目的：学会用小液流法测定植物组织的水势实验原理：将植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，当找到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。
因溶液的浓度是已知的，可以根据公式算出其渗透压，取其负值，为溶液的渗透势（ψπ），即代表植物的水势（ψw）。
ψw＝ψπ＝－P＝－iCRT实验材料与设备：（一）材料：小白菜或其它作物叶片（二）仪器设备：1.带塞青霉素小瓶12个；2.带有橡皮管的注射针头；3.镊子；4.打孔器5.培养皿。
墨旱莲提取物抑菌活性初步研究
墨旱莲提取物抑菌活性初步研究欧阳蒲月;梁永枢;莫小路;陈功锡;沈龙强【摘要】Through the bacteriostatic test of extract from Eclipta prostrata, one of medical plants in the west of Hunan, the results are as follows. (1) The antibacterial substance only exists in the petiole and rhizome. (2) The minimal inhibitory concentration of the extract on Staphylococcus aureus, Escheichia coli, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus are 0.6, 2.0, 0.8, 1.0g/mL respectively; the minimal bactericidal concentration all are 1.0g/mL;but it is ineffective on Aspergillus niger. (3) In order to get the extract that has the optimum antibacterial effect, the solvent should be alkaline 65%ethyl alcohol. The bacteriostatic test by different polar solvent shows that the antibacterial substance easily dissolved in non-polar solvent such as petroleum ether, ethyl ether. (4) The extract may be flavone substance.%对药用植物墨旱莲Eclipta prostrata提取物的抑菌活性物质进行研究。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
香樟材气味成分抗菌保健性能
价值工程1抗菌材料1.1菌种、培养基及洗脱液菌种：①大肠杆菌（Escherichia coli ）NICPBP 44113-5，购自中国药品和生物制品检定所。
②鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella ）NICPBP50115，购自中国药品和生物制品检定。
③金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus)26003，购自中国医学细菌保藏管理中心。
④痢疾（Dysentery ）购自中国医学细菌保藏管理中心。
⑤苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）购自中国医学细菌保藏管理中心。
试验采用的培养基为细菌培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌培养基采用PDA 培养基.菌种和培养基配方由华南农业大学食品学院微生物教研室提供。
用0.1mol/L 的NaOH 溶液或者0.1mol/L 的HCI 溶液调节使灭菌后pH 值为7.0-7.2。
试验采用的洗脱液为0.8%生理盐水。
1.2抗菌样品①微波法萃取香樟材挥发油；②超声法萃取香樟材挥发油；③超临界CO 2萃取法萃取香樟材挥发油。
在进行抗菌试验前，所有试验样品、培养基、培养液、pH 值调节液、洗脱液都经121℃压力蒸汽灭菌30min 。
(1)仪器与设备①恒温培养箱（37±1）℃，RH ≥90%；②超净工作台；③压力蒸汽灭菌器；④真空干燥箱：ZK-82B 型；⑤灭菌平皿、灭菌移液管、接种环、酒精灯、电热干燥箱；⑥精密pH 计。
2方法2.1菌种保藏将各菌种接种于营养琼脂培养基面上，在（37±1）℃下培养24h 后，置于（0-5）℃下保藏（不得超过1个月，若超过一个月则重新接种），作为保藏菌。
2.2菌种活化将用接种环从前面菌种平板培养基上取少量（刮1-2环）新鲜细菌加入到平板营养琼脂培养基上，在（37±1）℃下培养备用。
2.3样品处理分别将微波萃取香樟材挥发油、超声萃取香樟材挥发油、超临界CO 2萃取法萃取香樟材挥发油三种样品，加入丙酮分别稀释成90%、80%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%、0.35%（体积分数）的供试样溶液，每个样品做3个平行。
实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法work Information Technology Company.2020YEAR实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法一、实验目的学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。
二、实验原理抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。
在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。
其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出结果。
但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。
根据药剂施加在琼脂培养基表面方式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。
三、实验材料供试药剂：速克灵或扑海因。
供试病原菌：番茄灰霉病菌。
实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。
四、实验方法采用管碟法。
将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般为外径8 mm，内径6 mm，高10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。
1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7个浓度。
灭菌蒸馏水为对照。
2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。
在培养好的菌种上倒入10 mL灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动5 min，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。
用低倍（15×20倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野80-100个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。
6种酚类化合物及胡桃醌的体外抑菌活性
6种酚类化合物及胡桃醌的体外抑菌活性杨光;包晓玮;陈勇;吴莹;马菁菁【摘要】核桃青皮提取物具有较好的抑菌作用,本试验以核桃青皮及叶片中含量较高的7种植物次生代谢物为研究对象,评价其抑菌活性,为解析核桃青皮提取物的抑菌活性及开发新的饲用抗生素替代品提供参考.以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌,将7种植物次生代谢物——绿原酸、鞣花酸、丁香酸、芦丁、单宁酸、对羟基苯甲酸和胡桃醌分别稀释至1.0000、0.5000、0.2500、0.1250和0.0625 mg/mL,采用滤纸片扩散法,以培养24 h后抑菌圈直径大小反映植物次生代谢物的抑菌活性.结果显示:除大肠杆菌对羟基苯甲酸和单宁酸不敏感外,其他植物次生代谢物对3种受试菌均有不同程度的抑制作用.对大肠杆菌抑制作用的顺序为鞣花酸>胡桃醌>芦丁=丁香酸>绿原酸>对羟基苯甲酸=单宁酸;对枯草芽孢杆菌抑制作用的顺序为鞣花酸>绿原酸=对羟基苯甲酸>丁香酸>单宁酸>芦丁>胡桃醌;对金黄色葡萄球菌抑制作用的顺序为胡桃醌>丁香酸>芦丁>单宁酸>鞣花酸>对羟基苯甲酸>绿原酸.由此得出,绿原酸、鞣花酸、丁香酸、芦丁、单宁酸、对羟基苯甲酸和胡桃醌对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用,其中鞣花酸对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用,胡桃醌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2018(030)009【总页数】10页(P3710-3719)【关键词】酚类化合物;黄酮类化合物;胡桃醌;抑菌活性【作者】杨光;包晓玮;陈勇;吴莹;马菁菁【作者单位】新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐 830052;新疆农业大学食品与药学学院,乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐830052【正文语种】中文【中图分类】R285作为生产和使用抗生素的大国，我国每年有近一半的抗生素被用于畜牧业，由此引发的耐药性威胁也越发受到公众关注。
综合设计性实验-化学抑杀菌剂的效果评价
5.贴浸有药剂的滤纸片
含药剂滤纸片贴到涂菌的平板表面，每浓度浸泡至少5min，每平板贴7片，中间 为对照37℃培养16~20h
6.测抑菌圈直径
大于滤纸片直径1mm以上的最低浓度视为最低抑杀菌浓度。
实验结果
消毒剂
龙胆紫 碘酒 氨苄青霉素 链霉素
抗生素
卡那霉素 四环素
中药
清 热 解 毒 口 服 液
浓度
（二）实验讨论
4．接种细菌时涂布的注意事项 涂布棒一定要提前灭好菌，先将同一菌种涂布完了，再涂布另一菌种。 涂布另一菌种前先用酒精灯将涂布棒灭菌，待涂布棒冷却后再进行涂布， 以免涂布棒温度较高将细菌烫死。涂布一定要均匀，且每次取菌前应将菌 液摇匀，取相同量的菌液进行涂布，以确保不同培养基表面菌台厚薄相同。 5．注意各个环节无菌操作的规范
10、 8、 18、 27、 12、 9、 13、 10、 14、 16、 11、 15、 14、 7、 7、 9、 10、 18、 25、 10、 10、 12、 11、 13、 16、 8、 14、 17、 7、 7、 10 8 18 29 15 10 13 11 14 15 10 13 16 6 7 10 9 低 18 高 27 高 12 中 10 中 13 中 11 中 14 中 16 高 10 中 14 中 16 高 7 低 7 低
杀菌效果。龙胆紫、大于50ug/ml的氨苄青霉素、卡那霉素、四环素度白色葡萄球 菌有强效的杀菌效果。 进一步筛选出，大于50ug/ml的氨苄青霉素、卡那霉素对大肠杆菌和白色葡 萄球菌都有很强的杀菌效果。
（二）实验讨论
双黄连口服液：
金银花、黄芩、连 翘。辅料为蔗糖、 香精 等
清热解毒口服液主要成 分： 石膏 、知母 、金银花、 连翘 、黄芩、 栀子、 龙 胆、 板蓝根 、 甜地丁、 玄参 、地黄 、麦冬。辅 料为蔗糖。
贝类体液免疫机制的研究进展_黄硕芩
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福建轻纺 ２０１１年６月第６期
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银耳多糖抑菌效果研究
银耳多糖抑菌效果研究宋 洋，潘丽秀，陈 洁，郭淋凯，宋东晓，黄训瑞*（宁德市食品药品检验检测中心，福建宁德 352100）摘 要：采用抑菌圈试验检测古田银耳多糖对5种常见致病菌的抑菌效果，结果表明，1.87 µg·mL-1银耳多糖溶液对铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌均有一定的抑制作用，但是1.87～151.42 µg·mL-1银耳多糖溶液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均无明显的抑制作用。
关键词：抑菌圈试验；古田银耳；致病菌；抑菌效果Research on the Antibacterial Effect of Polysaccharides fromTremella fuciformisSONG Yang, PAN Lixiu, CHEN Jie, GUO Linkai, SONG Dongxiao, HUANG Xunrui*(Ningde Center for Food and Drug Control, Ningde 352100, China)Abstract: The antibacterial effect of Gutian Tremella fuciformis polysaccharides on five common pathogenic bacteria was tested using the antibacterial circle test. The results showed that a 1.87 µg·mL-1Tremella fuciformis polysaccharide solution had a certain inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa, Salmonella paratyphi B, and Escherichia coli, but a 1.87～151.42 µg·mL-1Tremella fuciformis polysaccharide solution had no significant inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Candida albicans.Keywords: antibacterial circle test; Gutian Tremella fuciformis; pathogenic bacteria; bacteriostatic effect银耳（Tremella fuciformis），也称白木耳、雪耳等，是担子菌门真菌银耳的子实体，颜色多为白色或淡黄色，呈叶状、凝胶状，分布广泛，特别是在热带地区，常见于阔叶树的腐木上，在我国福建省、浙江省、广东省、安徽省、四川省和江苏省等地多有分布[1-2]。
龙眼核提取物的抑菌活性研究
中分离、发现新的抑菌活性物质或开发为食 品防腐剂提ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ实验依据．
２ 材 料与方法
收稿 日期： ０ １１—３ ２ １－０２ 基金项 目：福建省 自然科学基金项 目（０ ０ ０ ２ Ｏ； ０ １ ２ １Ｊ １４ ） ２ １ 年福建省大学生科研创新项 目 作者简介 ： 邹金美（９３ ， １７－ 女， ） 福建省浦城县人， 讲师．
每年全世界的废弃量高达几十万吨¨． 龙眼核含有丰富的营养物质，如高达 ６ ． ０ ％的淀粉、１－ 还原糖、 ９ ４３ ％ 蛋白质和脂类等Ｌ ２ Ｊ ，还有较高含量的黄酮 一 和多酚类［－物质． Ｉ８ ，］ ５ 龙眼核的药理研究发现其提取物具有很好 的降血糖作用 ’ 、 Ⅲ 抗氧化作用和酪氨酸酶抑制活性 Ｊ Ｊ ， ，对龙眼核抑菌活性的研究［１ 见报道． １尚少 ２ 本研究 用８ 种病原菌和 ４ 种食药用丝状真菌为测试菌株检测了龙眼核乙醇提取物的抑菌活性，为进一步从龙眼核
ｓ ｃ ｓ ｌ ｕ ｏ ｕ ｅ ｓｅ ａ ｕ ｎ ｅ ｙ ｇ ｉ ａ ｔ ｏ ｇ ｒｔ ａ ｗｏ ｍｅ ｉ ｉ ａ ｕ ｇ ｕ ｈ ａ ｎ ｄ ｒ ｕ ｉ ｕ ａ ｄ ｕ ｈ ａ ｅ ｒ ｔ ｓｇ ｅ ｔ ｒ ｎ ｓａ ｄ Ｐ ｒ ｎ ｉｗ ｓｓ ｒ ｎ ｅ ｈ ｎ ｔ ｄ ｃｎ ｌ ｎ ｉ ｃ ｓＧａ ｏ ｅ ｍａ ｌ ｃｄ ｍ ｎ ｆ ｓ
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化学十字交叉法原理
化学十字交叉法原理
化学十字交叉法是一种经典且实用的实验技术，其优点是可节约实验时间、节省材料以及提高回收效率。
它具有两个关键组成部分：用作参考的原始试剂，以及一些约束的测试剂，以及一种标准的实验程序。
编写试验报告时，它借助应用层次分析法（ALS），结合所选原始试剂和测试剂的使用，来构建有关反应的实验路线图，以及在化学十字交叉法中利用质量平衡来计算所需试剂的量值。
首先，在化学十字交叉法中，需要计划存在两个或两个以上原始试剂，并形成一个实验表，其中应输入所有实验参量和解释，以及测试剂的细节，如配置原料的来源和试剂的最终分析结果。
其次，在实验过程中，运用分析方法来测试所给反应，形成ALS。
实验机制的多种性质（如pH值、温度等），可以被用来监测反应进程情况，从而获得更好的实验数据，来及时校正试验参数。
在实验完成后，可以将
数据统一，计算出各原始试剂及测试剂所需量值，最终完成质量平衡，即计算出需要以及节约的物质、药物量。
最后，化学十字交叉法的核心内涵是它的实验步骤的可控性。
在进行实验过程时，可以被运用到正确地使用标准材料，以便于解释和检验结果。
意义在于，在之后某一次实验条件下，可以使用它们来解释实验参数，一定程度上保证了实验结果的价值可靠性。
总而言之，化学十字交叉法可能被广泛地用于样品的实验测试，它的优点在于可节约实验时间以及节省材料，而且效率也很高，便于实验结果的仪器验证，以及实验的重复校准，更加能够提高实验的重复性和稳定性，为其他实验技术提供参考。
十字压片法的原理是什么
十字压片法的原理是什么
十字压片法是一种常见的细菌培养方法，它的原理是将液态培养基和待检测的微生物样品滴在玻璃片上，然后使用另一块玻璃片垂直于第一片压在上面，使两片玻璃片交叉形成十字形，然后将压片放在恰当的条件下孵育，观察并记录生长情况以及可能的微生物菌落，以便进行鉴定和检测。
十字压片法能够对微生物菌落进行分离，促进其快速生长和传播，便于观察和检测，同时也可以保证对微生物的控制和检测的准确性。
十字压片法的原理及应用
十字压片法的原理及应用1. 原理介绍十字压片法是一种常见的实验手段，用于研究物质的结晶结构和晶体学性质。
这种实验方法采用了X射线衍射技术，通过照射样品，观察衍射光的空间分布，从而推导出晶体结构的信息。
2. 实施步骤Ten Steps to Conduct the Cross-Sectional Method:1.准备样品：选择适合该方法的晶体样品，准备一个干净的载玻片。
2.制备样品：将晶体样品放在载玻片上，并使用细针或夹子轻轻固定。
3.准备入射光：将X射线源放置在适当的位置，并调整参数以获得合适的入射光。
4.调整角度：通过调整样品和入射光的角度，确保X射线能够正确定向样品。
5.收集数据：使用X射线探测器记录从样品中衍射出的光的强度和角度。
6.数据处理：使用计算机软件将收集到的数据进行分析和处理。
7.解析结果：从处理后的数据中推导出晶体的结构和参数。
8.验证结果：将推导出的晶体结构与已知信息进行比对，验证结果的准确性。
9.记录实验：将实验过程和结果记录下来，包括详细的实验条件和推导过程。
10.结论和展望：总结实验结果，讨论其意义和潜在应用，并展望进一步的研究方向。
3. 应用领域十字压片法在材料科学、化学和地质学等领域具有广泛的应用。
3.1 材料科学在材料科学中，十字压片法常用于研究金属、合金、陶瓷等材料的晶体结构和相变行为。
通过分析晶体结构的变化，可以揭示材料的性能改善机制，为材料设计和制备提供理论依据。
3.2 化学在化学领域，十字压片法被广泛应用于有机和无机化合物的结构研究。
通过确定化合物的晶体结构，可以了解分子的空间排列和键的性质，为确定化合物的性质和反应机理提供重要线索。
3.3 地质学在地质学中，十字压片法可用于研究地壳中的矿物组成和构造。
通过分析晶体结构和衍射图案，可以确定矿物的晶胞参数、晶体对称性以及矿物的成因和演化过程。
4. 实验优势十字压片法具有以下优势：•非破坏性测试：样品在实验过程中不受损伤，可以多次进行检测。
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方法总结
注意：1、药剂的剂量以推荐剂量就好 2、滤纸条润湿程度不宜太干 3、孢子悬浮液配制挑菌丝洗涤就行 4、孢子悬浮液每ML1*106个就可。 5、不可忘记标示a、b药剂的名称
实验十五 杀菌剂混合毒力测定
一、试验目的 学习滤纸条交叉放药法判定杀菌剂混用对生物的影响 了解杀菌剂混合后的生物效应
二、试验原理
相加
药剂 A + 药剂 B
增效
拮抗
本实验通过滤纸条交叉放药法，来简易地判别任何 两种不同药剂混合对病菌生长药法对生物的影响
拮抗 互不干扰
三、操作步骤 (一) 孢子悬浮液配制
(二) 带菌培养板制作
水浴加热融化 44-45℃
加孢子悬浮液 混匀,迅速倒入培养皿中
带菌培养板
(三) 带药滤纸条放置
将4 条滤纸条放入药液（单剂或混剂）中浸泡一定时间后沥去多 余的药液，垂直交叉放入带菌平板，置于一定温度下培养，观察 菌落抑制区域的生长形状，并测定大小。