不同病毒灭活工艺对脱细胞牛皮基质性能的影响

不同病毒灭活工艺对脱细胞牛皮基质性能的影响鱼园【摘要】为了研究不同病毒灭活工艺对脱细胞牛皮基质(ADM)性能的影响,从而为产品开发或组织工程技术基础研究提供理论依据.采用6种不同病毒灭活工艺对脱细胞牛皮基质(ADM)进行处理,测定经处理后的材料机械性能、体外降解速率以及组织学染色检测胶原纤维破坏程度.结果显示,经不同病毒灭活工艺处理的ADM的机械性能总体强度排序为75％ EtOH＞NaOH≈15 kGy＞25 kGy≈0.1％ PA＞0.2％ PA,体外降解速率由慢至快排序:75％ EtOH＜NaOH≈15kGy＜0.1％ PA＜0.2％ PA＜ 25kGy,组织学染色结果与机械性能及降解速率检测结果相吻合.建议选择病毒灭活工艺时要根据材料特性进行相应选择.【期刊名称】《陕西农业科学》【年(卷),期】2018(064)007【总页数】3页(P33-35)【关键词】脱细胞牛皮基质;病毒灭活;机械性能;降解速率;组织学染色【作者】鱼园【作者单位】西安工程大学,陕西西安710048【正文语种】中文脱细胞基质是一种生物相容性良好的组织工程支架材料，目前在国内外广泛应用于组织工程技术研究及临床修复产品开发[1]，该类材料一般来源于动物或人体，所以病毒风险的控制尤为重要。

但病毒灭活工艺通常为强酸强碱或各种灭菌方法[2～4]，对材料本身破坏较大。

故确定不同病毒灭活工艺对脱细胞牛皮基质(ADM)的破坏程度尤为重要。

目前有少数学者研究胶原蛋白或透明质酸的病毒灭活工艺，但仅限于病毒灭活的效果，未报道各种工艺对于材料理化性能的影响[5～8]。

另外也有较多研究脱细胞基质制备技术报道[1]，但尚未有系统性对比研究病毒灭活工艺的报道。

通过体外及体内试验研究确定不同病毒灭活工艺对脱细胞牛皮基质机械性能、降解性能等的影响，从而为产品开发或组织工程技术基础研究提供理论依据。

1 材料与方法1.1 试验材料胎牛皮，采购自陕西秦宝牧业；氢氧化钠、TritonX-100、氯化钠、过氧乙酸、乙醇等均为试剂级。

蛋白酶K采购自Solarbio，P9460。

1.2 试验方法1.2.1 ADM制备取新鲜离体胎牛皮，削去表皮及皮下脂肪，清洗干净后，采用2%TritonX-100浸泡24 h，再经过高低渗5个循环清洗，高渗为1 mol·L-1氯化钠溶液，低渗为纯化水，浸泡及清洗震荡频率均为150转·min-1。

1.2.2 病毒灭活样品制备取上述制备得到的ADM，分别经过1 mol·L-1NaOH室温浸泡1 h，0.1%过氧乙酸(PA)室温浸泡1 h，0.2%过氧乙酸室温浸泡1 h,75%乙醇(EtOH)室温浸泡1 h及15kGy、25kGyγ射线辐照灭菌。

1.2.3 机械性能测定主要有:(1)拉伸强度及拉伸伸长率。

将样品(n=6)裁剪成10 mm宽，50 mm长，测定厚度后将试样拿夹具固定，夹持距离为10 mm，样品检测长度为30 mm，试验拉伸速度为100 mm·min-1，取试样断裂时拉伸强度及拉伸伸长率的最大值。

(2)撕裂力。

将样品(n=6)裁切成30 mm宽，50 mm长，并在宽边中点处切割出长20 mm的切口，切口应整齐，与长边方向平行。

将试样拿夹具固定，夹持距离10 mm，试验拉伸速度为100 mm·min-1，对试样进行拉伸，直至试样断裂，取试样撕裂力的最大值。

(3)顶破力。

将样品(n=6)裁切成50 mm×50 mm规格，将试样固定在夹持器上，保证试样平整，钢球直径为10 mm±0.1 mm，设定试验机的速度为100 mm·min-1，取试样被顶破的最大力值。

1.2.4 体外降解速率测定将样品真空干燥后，裁切称取形状大小相近的工艺样品各200 mg(n=3)，置于10 mL离心管中，加入相同体积的0.1%蛋白酶K溶液后密封，放入50℃水浴锅进行酶解。

每隔一定时间(10～15 min)观察样品降解情况，直至样品基本完全降解，记录降解时间。

1.2.5 组织学染色将各工艺样品进行常规HE组织学染色，研究各工艺对ADM微观胶原纤维的破坏程度。

2 结果2.1 不同病毒灭活工艺对ADM机械性能测定及体外降解速率测定结果表1 不同病毒灭活工艺对ADM机械性能及体外降解速率测定结果拉伸强度/MPa 拉伸伸长率/%撕裂力/N顶破力/N体外降解速率/minNaOH7.7±1.2MPa47.1±5.3%105±12N178±21N90±5min0.1%PA6.8±0. 8MPa60.2±4.2%89±9N165±15N80±3min0.2%PA5.4±0.7MPa65.3±3.3%71±11N155±11N73±4min75%EtOH8.8±1.3MPa49.3±4.7%109±15N198±19N 104±5min15kGy7.4±0.6MPa53.6±3.9%98±8N180±12N95±3min25kGy7.0±0.8MPa52.1±7.6%101±13N166±13N65±4min2.2 组织学染色结果图1 不同灭活工艺得到的样品组织学染色结果3 讨论3.1 机械性能测定NaOH为强碱，具有较强蛋白消化能力，且1 mol·L-1的浓度为世界卫生组织推荐的疯牛病病毒灭活方法。

PA为灭菌级消毒剂，具有较强氧化性，对细菌繁殖体、芽孢、病毒、霉菌均有杀灭作用，常用浓度为0.05%～1%。

75%乙醇为常规消毒剂，医疗常用于表面创伤消毒处理。

伽马射线辐照具有极强穿透能力，一定剂量的辐照即可有效杀灭各类细菌病毒。

从各项机械性能结果来看，0.2%PA处理后的材料机械性能最低，然后为0.1%PA，可能与PA的强氧化性有关。

75%乙醇由于消毒机理为蛋白失水变性，破坏相对较小，所以机械性能较高。

NaOH由于是强碱，对材料还是有一定破坏，经过NaOH处理的材料机械性能优于PA组，差于75%乙醇组。

伽马射线辐照对于材料也有一定破坏，25 kGy辐照对材料的破坏程度比NaOH处理较大，15 kGy辐照对材料破坏程度与NaOH组相当。

总体强度排序为75%EtOH>NaOH≈15kGy>25kGy≈0.1%PA>0.2%PA。

3.2 体外降解速率各组样品经蛋白酶k体外降解，降解速度快慢基本与机械性能相吻合，除了25 kGy辐照灭菌，对材料降解性能影响显著，经此工艺处理的样品降解速率最快。

总体降解速率由慢至快排序：75%EtOH<NaOH≈15 kGy<0.1%PA<0.2%PA<25 kGy。

3.3 组织学染色各组样品HE染色结果显示，经0.1%PA(图A)及0.2%PA(图B)处理后的ADM胶原纤维形态改变，孔洞增加，破坏较大；经75%EtOH(图C)处理的ADM胶原纤维形态正常，基本无孔洞；经25 kGy(图D)辐照处理的ADM胶原纤维有断裂，孔洞增加，而15 kGy(图E)处理的ADM则形态正常，基本无孔洞；经NaOH处理(图F)的与15 kGy处理的胶原纤维形态相近，结果与机械性能及降解速率检测结果相吻合。

4 结论各类病毒灭活方法对ADM破坏程度有所不同。

PA作为优良的消毒剂，可能对ADM破坏较大，应慎重选择该方法。

75%EtOH基本对ADM无影响，可推荐使用。

NaOH为牛源性材料常用的病毒灭活方法，也可选择应用，但应用时也建议严格控制温度及时间。

25 kGy辐照相比15 kGy辐照，前者强度较大，应慎重选择，后者破坏较小，可推荐应用。

不同的病毒灭活工艺具有不同的病毒灭活效果，理论上对材料破坏越大的，病毒灭活效果也越好，故建议选择病毒灭活工艺时要根据材料特性进行相应选择。

参考文献：【相关文献】[1] PeterM.Crapo,ThomasW.Gilbert,StephenF.Badylak.Anoverview of tissue and whole organ decellularization processes.Biomaterials，2011,(32)：3 233-3 243.[2] 史新立,张东刚,陈冰.动物源性医疗器械的病毒灭活进展[J].中华损伤与修复杂志(电子版)，2009，4(03)：52-54.[3] F.C.Thomas，等.Gamma RayInactivationof SomeAnimalViruses[J]p.Med.1981(45):397-399.[4] D.M.TAYLOR.Inactivationof Transmissible Degenerative EncephalopathyAgents：AReview.TheVeterinaryJournal,2000,159,10-17.[5] 蒋丽霞.胶原蛋白海绵病毒灭活/去除工艺的研究[J].中国修复重建外科杂志，2013，27(07)：885-888.[6] 马平,周锡鹏,梅芳,等.胶原蛋白海绵生产中的病毒灭活工艺效果观察[J].中国消毒学杂志，2011，28(03)：286-288.[7] 任彩霞,范素俊,侯永泰.透明质酸钠原料病毒灭活/去除工艺的研究[J].安徽医药，2010，14(10)：1 126-1 128.[8] 方哲翔,王建华,袁平,等.医用胶原修复膜病毒灭活/去除工艺的验证和评价[J].中国生物制品学杂志，2016，29(12):1 341-1 344.。