人血清IgG分离纯化方法探讨

?2 IgG的纯化方法
根据IgG的不同特性，IgG的纯化方法主要有以下几种：
2．1 饱和硫酸铵盐析法
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一．因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高．但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出．硫酸铵是盐析最常用的无机盐，其主要特点是溶解度大，随温度变化小；对蛋白质有保护作用，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性；溶解于水时不产生热量，价格低廉，但在碱性环境中不能用硫酸铵作为沉淀剂进行盐析反应．在血清中加入硫酸铵，当饱和度为28 ～33 时，优球蛋白析出；33 ～55 时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%后，白蛋白析出，这是硫酸铵分析沉淀血清蛋白的一 般规律[3]．

2．2 有机溶剂沉淀法
有机溶剂沉淀法是利用有机溶剂能破坏溶质分子周围形成的水化层，使溶质分子脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度；而且有机溶剂的介电常数比水小，随着有机溶剂的加入，整个溶液的介电常数降低，带电溶质分子之间的库仑引力逐渐增强，于是发生相互吸引而聚集．一般来说，溶质分子量越大，越容易被有机溶剂沉淀，发生沉淀所需要的有机溶剂浓度越低[7]．在这主要介绍辛酸法．
2．3 聚乙二醇(PEG)置换法
水溶性非离子型聚合物沉淀法 常用的聚合物为聚乙二醇(PEG)及右旋糖酐．水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制还不清楚，大致有如下解释：聚合物与蛋白质形成共沉物；聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；聚合物与蛋白质形成复合物．此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等．PEG在浓度为3 ～4时可沉淀去除了蛋黄脂磷蛋白及脂质，6 ～7可沉淀IgM，8 ～12 沉淀IgG，12 ～15 沉淀其他球蛋白，25 则沉淀白蛋白．
在10mL人血清中加入等量0。025MpH7．8的磷酸盐缓冲液(PBS)后，再加入分子量为1000的PEG溶液，终浓度为16 ，将试样分别置旋涡混合器上混匀，置冰箱(4℃)过夜，次日离心5～10min(2500rpm)，弃上清，沉淀用0．025MpH7．8的PBS溶解，直接上DEAE纤维素柱层析，以0．0175MpH6．3的PBS洗脱．在此条件下分离人IgG其比活性为0．95mg／mg蛋白质，活性回收率为95%．
2．4 ProteinA亲合膜色谱法
膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质，连接配基，利用膜配基与蛋白质等目标作用进行分离纯化，当料液以一定流速流过膜的时候，目标分

子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来．ProteinA能与人IgG分子的Fc段结合，但只结合其中的IgG1，IgG2和IgG4亚类，不能结合IgG3亚类．
2．5 聚酰胺复合膜亲和膜法
用三氯三嗪键合法制备20张直径为47mm带苯丙氨酸配位基的亲和膜，装配在碟式亲和膜分离器中，用0．05mol／LNaHzPO 溶液稀释4mL人血浆，将血浆稀释液以1mL／min的流速泵入亲和膜分离器，先用1mol／LNaC1溶液50mL在2mL／min流速下洗脱膜上残留的杂蛋白，再改用1mol／L氯化钠／乙二醇(等体积)，在同样流量下洗脱膜上亲和吸附的IgG，收集洗脱液，透析后收集样品，所得IgG纯度为83．5 ，回收率为78 ．
3 各种IgG纯化方法比较
盐析法是最早使用的生化分离手段之一．由于其经济、不需特殊设备，操作简便、应用范围广，至今仍为最常用的生化分离纯化手段；有机溶剂法的分辨率高于盐析，而且因溶剂沸点较低，除去及回收方便；但有机溶剂沉淀法比盐析法易使蛋白质变性失活．非离子聚合物沉淀法的沉淀效率很高，反应时不需要使用很多的聚乙二醇；液相层析则在各种下游纯化工艺中应用最为广泛的技术；膜色谱则由于以多孔膜作为基质材料，故具有很多的潜在优势．然而，在应用膜色谱技术时应注意料液对膜的堵塞与污染，以防造成膜吸附的功能下降[2]．各种LgG分离纯化方法的比较见表2．




盐析法
具有成本低、设备简单、对被分离物可保存其生物活性
需时较长，降低效价，产品的纯度不高，沉淀离心过程的损耗较大

亲和膜色谱法
较有效的生物活性物质纯化方法，蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，活性回收率提高；纯化步骤简单，适用于不稳定蛋白纯化
吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体会脱落进入分离体系；载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，配基与载体耦联条件激烈等