人血清IgG分离纯化方法探讨
医学免疫学：血清免疫球蛋白的纯化
实验原理
• 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水 基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带 有电荷的情况决定的。
• 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化 膜层减弱乃至消失;同时，中性盐加入蛋白质溶液 后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大 量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质 分子之间聚集而沉淀,这个过程叫做盐析。
• 边加PBS，边关注核酸蛋白检测仪的数值变化， 当数值到达5时收集核酸蛋白检测仪出水口的液体， 当数值下降到10时，停止收集。
• 将收集到的蛋白质液体用OD280和OD260测蛋 白质浓度。
实验结果
• 用紫外分光光度计测全血清和纯化后蛋白质溶液 的吸光度值，并求出蛋白质浓度。
蛋白质含量(mg/ml)= (1.45×OD280－0.74×OD260) ×稀释倍数
1.45和0.74是常数
注意事项
• 实验步骤中，用红色标出的地方。
实验原理—盐析
• 不同性质的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐 而分阶段从溶液中沉淀出来。
• 分离提纯IgG最常用的中性盐是硫酸铵。 • 30～50%的硫酸铵可以沉淀IgG。
实验原理—分子筛层析
• 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。它的突出优 点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温 度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成 分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质 有很好的分离效果。
液。置室温15min，离心3500rpm×10min，弃 上清。 沉淀物用2mlPBS重悬。
IgG的分离、提取与鉴定
IgG 分离、纯化与鉴定操作步骤：1、取2.5ml 血清，加pH7.0PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH 4）2SO 4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH 4）2SO 4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。
2、3000r/min 离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加（NH 4）2SO 4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH 4）2SO 4溶液，充分混合，静置20min。
4、3000r/min 离心20min，弃上清，以除去白蛋白。
5、于沉淀中加5ml PBS ，使之溶解，再加（NH 4）2SO 4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH 4）2SO 4溶液，充分混合后，静置20min。
6、3000r/min 离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。
7、用1ml PBS 溶解沉淀，装入透析袋。
8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。
8、SephadexG50除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。
9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml 量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE 的体积。
根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE 的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。
抽干，改用0.5mol/L NaOH 溶液浸泡1h 以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH 至8左右（用pH 试纸检查）。
再改用0.5mol/L HCl 溶液浸泡1h 以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。
本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
10、装柱用0.0175mol/L,pH6.7,磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。
IgG的分离、提取与鉴定
IgG分离、纯化与鉴定实验原理操作步骤：1、取2.5ml血清，加pH7.0 PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。
2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置20min。
4、3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。
5、于沉淀中加5ml PBS，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置20min。
6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。
7、用1ml PBS溶解沉淀，装入透析袋。
8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。
8、SephadexG50 除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。
9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。
根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。
抽干，改用0.5mol/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。
再改用0.5mol/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。
本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
10、装柱用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。
然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约11mL处左右为止，在床面上放一张圆形滤纸片。
IgG的分离与提纯
IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。
血清IgG的分离
血清IgG的分离
引言
血清IgG的分离是一种常见的实验操作，用于从血清样品中纯化和分离出IgG抗体。
IgG作为一种免疫球蛋白，在研究和诊断中具有重要的应用价值。
本文将介绍一种简单的方法来实现血清IgG 的分离。
实验材料
- 血清样品
- 柱层析试剂盒（例如，Protein A/G柱）
- 洗涤缓冲液
- 结合缓冲液
- 洗脱缓冲液
- 分离缓冲液
操作步骤
1. 准备工作：
- 将柱层析试剂盒按照说明书准备好，确保所有的缓冲液和试剂适当配置。
- 样品处理前，将血清样品离心以去除杂质。
2. 结合IgG抗体：
- 将血清样品加入结合缓冲液中，根据比例稀释适量的样品。
- 在离心前，静置样品与结合缓冲液的混合物反应一段时间（例如，30分钟）。
3. 柱层析操作：
- 将混合物通过装有填充物的柱层析柱。
- 打开流量，并在结合完毕后关闭。
- 使用洗涤缓冲液进行洗脱，以去除非特异性结合物。
4. 洗脱和收集：
- 使用洗脱缓冲液进行洗脱，以从柱层析柱上洗脱结合的IgG 抗体。
- 收集洗脱液中的纯化的IgG抗体。
5. 质量检测：
- 通过测量IgG抗体的浓度或使用其他质量检测方法来确认分离的IgG抗体的纯度和活性。
结论
血清IgG的分离是一种简单且常用的实验方法，可以用于纯化和分离血清样品中的IgG抗体。
通过选择适当的柱层析试剂盒和正确操作步骤，可以高效地获得纯化的IgG抗体。
分离的IgG抗体可以用于各种研究和诊断应用中。
第五组血清IgG的分离纯化及鉴定
Байду номын сангаас样缓冲液
甘油：蛋白质沉到样品孔底部，不漂浮 β-巯基乙醇：切断二硫键，是蛋白质分 为两单条链 SDS:是蛋白质带负电荷并呈棒状
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（四）SDS-PAGE测IgG分子量结果
猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下：
1标准蛋白
2 血清
3 纯化的IgG样品
8
活性鉴定
琼脂扩散
开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的
设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节
上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展 提供了有力的基础。
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Contents
材料与方法 结果与讨论
总结与感想
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一、材料与方法
（一）试验材料 1、试剂和材料
血清、饱和硫酸铵、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH=7)、 吸管、高速冷冻离心机
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方法及步骤
方法 通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中 的各个成分分步盐析出来，达到目的蛋白质。 不同饱和度硫酸铵浓度：V=V0（C2-C1)/(1-C2) V 应加入饱和硫酸铵溶液的体积 V0 蛋白质溶液的原始浓度 C1 原来溶液的硫酸铵饱和度 C2 所要达到硫酸铵饱和度
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步骤
1、取5mL血清和5mL0.01mol/L磷酸盐缓冲 液于小烧杯中，混匀，滴加饱和硫酸铵 溶液，使溶液浓度达到20%，4℃静置 15min 2、4℃ 3000r/min离心10min,弃沉淀（沉淀 为纤维蛋白原） 3、向上清中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液 浓度达到50%，4℃静置15min
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4、4℃ 3000r/min离心10min,弃上清液（上 清为清蛋白，沉淀为球蛋白） 5、向沉淀中加5mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲 液，重悬沉淀，滴加饱和硫酸铵溶液， 使溶液浓度达到35%，4℃静置20min 6、4℃ 3000r/min离心15min,弃上清液（上 清为α、β球蛋白）沉淀为IgG
人血清IgG分离纯化方法探讨
人血清IgG分离纯化方法探讨2 IgG的纯化方法根据IgG的不同特性，IgG的纯化方法主要有以下几种：2．1 饱和硫酸铵盐析法盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一．因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高．但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出．硫酸铵是盐析最常用的无机盐，其主要特点是溶解度大，随温度变化小；对蛋白质有保护作用，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性；溶解于水时不产生热量，价格低廉，但在碱性环境中不能用硫酸铵作为沉淀剂进行盐析反应．在血清中加入硫酸铵，当饱和度为28 ～33 时，优球蛋白析出；33 ～55 时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%后，白蛋白析出，这是硫酸铵分析沉淀血清蛋白的一般规律[3]．2．2 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法是利用有机溶剂能破坏溶质分子周围形成的水化层，使溶质分子脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度；而且有机溶剂的介电常数比水小，随着有机溶剂的加入，整个溶液的介电常数降低，带电溶质分子之间的库仑引力逐渐增强，于是发生相互吸引而聚集．一般来说，溶质分子量越大，越容易被有机溶剂沉淀，发生沉淀所需要的有机溶剂浓度越低[7]．在这主要介绍辛酸法．2．3 聚乙二醇(PEG)置换法水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇(PEG)及右旋糖酐．水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制还不清楚，大致有如下解释：聚合物与蛋白质形成共沉物；聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；聚合物与蛋白质形成复合物．此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等．PEG在浓度为3 ～4时可沉淀去除了蛋黄脂磷蛋白及脂质，6 ～7可沉淀IgM，8 ～12 沉淀IgG，12 ～15 沉淀其他球蛋白，25 则沉淀白蛋白．在10mL人血清中加入等量0。
实验四 血清IgG的分离制备—盐析法
实验四 血清IgG 的分离制备—盐析法实验类型：验证型目的和要求掌握盐析法的原理及操作。
原理IgG 是免疫球蛋白（Immunoglobulin ，简称IgG ）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s 。
IgG 是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG ，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG 。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in ）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out ）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster 首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L 的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L ，即767g/L ，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L ，即676g/L 。
实训 血浆中IgG的分离纯化
实训血浆中IgG的分离纯化［任务描述］IgG是免疫球蛋白（简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万～16万。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，是利用各种蛋白质所带电荷不同、相对分子质量不同，致使在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此一个含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉析下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。
其中最常用的盐析剂是硫酸铵，本实训任务利用硫酸铵饱和溶液沉淀并分离目的蛋白质。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集硫酸铵盐析血浆中的IgG工作中的必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备新鲜动物血清（2）试剂饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g，加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50～60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100％饱和度，使用时用浓NH4OH调至PH7.0。
0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）其配制方法如下：①配A液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液（称取磷酸氢二钠5.37g加去离子水定容至100mL）②配B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（称取磷酸二氢钠3.12g加去离子水定容至100mL）③取A液约72mL，取B液约28mL，然后将这两种溶液边混合边用高精度pH试纸检测，调配成约100mL浓度为0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液备用。
（3）器具离心机、烧杯（500mL和250mL）、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。
全人源抗人红细胞RhD全分子IgG的制备与纯化方法探讨
全人源抗人红细胞RhD全分子IgG的制备与纯化方法探讨引言：红细胞RhD抗原是与RhD血型相关的一个重要血型抗原。
全人源抗人红细胞RhD全分子IgG的制备与纯化是研究RhD抗原相关药物和疫苗的重要基础。
本文将介绍制备全人源抗人红细胞RhD全分子IgG的一种常见方法，并探讨其纯化方法。
一、全人源抗人红细胞RhD全分子IgG的制备方法：1. 材料准备：- 人源红细胞RhD阳性血液样本- 分光镜下可见的无杂质RhD阴性人红细胞样本- 磷酸缓冲液（PBS）- 20％聚乙烯醇（PEG）溶液（含有0.2 M NaCl和0.02 M EDTA）- 抗人免疫球蛋白（IgG）分离柱- 尿素- 丙酮- 富含氯化铵的缓冲液2. 制备方法：- 从人源RhD阳性血液样本中分离红细胞，并用PBS洗涤两次，去除血浆和其他杂质。
- 通过与RhD阴性红细胞进行混合后，在37°C下进行鸡胚纤维蛋白原（EDTA）吸附。
- 用磷酸缓冲液稀释混合样本，然后将其与20% PEG溶液混合，以10倍体积，用冷藏室保存过夜。
- 离心混合物，并收集红细胞上清液。
- 将上清液通过IgG分离柱，纯化出抗人红细胞RhD全分子IgG。
- 沉淀纯化后的IgG并保存。
二、全人源抗人红细胞RhD全分子IgG的纯化方法探讨：1. 使用尿素进行纯化：- 尿素是一种常用的变性剂，能够部分去除IgG溶液中的杂质。
- 在纯化过程中，将IgG与适量尿素混合，进行适当的搅拌和洗涤，然后通过透析去除尿素。
2. 使用丙酮进行纯化：- 丙酮是一种有机溶剂，可以使IgG沉淀并去除溶液中的杂质。
- 在纯化过程中，向IgG溶液中逐渐加入丙酮，使IgG沉淀，然后通过离心去除沉淀物。
3. 使用富含氯化铵的缓冲液进行纯化：- 氯化铵是一种盐溶剂，可以沉淀IgG并去除杂质。
- 在纯化过程中，将IgG溶液与富含氯化铵的缓冲液混合并洗涤，然后通过离心去除沉淀物。
结论：全人源抗人红细胞RhD全分子IgG的制备对于研究RhD血型相关药物和疫苗具有重要意义。
血清IgG的分离、鉴定(2011.11)
本上是相同的。
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成 正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率 不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取 决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基 分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD—200KD之
（四）凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质 的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选 择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不
带有烷基化作用的还原SDS处理： 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护 SH基团，而得到窄的电泳带。
（三）三大效应
A浓缩效应
•缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲 液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品 及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。 电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有 效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离 子完全电离，有效迁移率大，称为快离子； 蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始 后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区， 产生高电位梯度（电位与电导率成反比）， 使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间 而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的 厚度。
1. 标准曲线的制作及样品测定
在20～200µ g/ml范围内其峰值与RNA含量成正比 RNA标准溶液：40ug/mL
试管 标准RNA 蒸馏水 浓度 （ug/mL） 1 0 2.0 2 0.4 1.6 3 0.8 1.2 4 1.2 0.8 5 1.6 0.4 6
mL
样品 样品 1 2 2.0 2.0 2.0 0
40/1.1980
实验方案_低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白
实验方案_低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白的实验方案：实验目的：通过低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白，获取纯度较高的免疫球蛋白样品。
实验原理：低温乙醇法是一种常用的蛋白质沉淀方法，其基本原理是在低温下，添加适量的乙醇，使蛋白质发生沉淀，从而实现分离纯化目的。
实验步骤：1.实验前准备：1.1.预先配制10%的乙醇溶液，使用冷藏保存。
1.2.准备人血清样品。
1.3.准备离心管和离心机。
2.实验操作：2.1.取一定体积的人血清样品，将其转移到离心管中。
2.2.在离心管中加入等体积的10%乙醇溶液。
2.3.混匀溶液，并在4℃下静置20-30分钟，使免疫球蛋白发生沉淀。
2.4.将离心管放入离心机中，以1500-2000g的速度离心15分钟，沉淀免疫球蛋白。
2.5.将上清液倒掉，并用凉蒸馏水轻轻洗涤沉淀2-3次，以去除杂质。
2.6.加入一定储存缓冲液（如磷酸盐缓冲液）重悬沉淀，得到免疫球蛋白样品。
2.7. 可进一步使用其他方法（如电泳、Western blot等）检测免疫球蛋白的纯度和活性。
3.结果分析：通过低温乙醇法提取的免疫球蛋白样品，可以通过其他实验方法来检测其纯度和活性。
同时，实验中的收率和纯度也可以根据实验结果进行分析和评估。
注意事项：1.实验操作要在低温下进行，以避免免疫球蛋白的降解和失活。
2.实验过程中离心操作要平稳，避免产生气泡和颗粒。
3.在操作过程中要小心避免受到污染，以确保提取的免疫球蛋白的纯度。
4.提取的免疫球蛋白样品可以进一步保存、分析和应用于实验研究中。
总结：低温乙醇法是一种简便、经济、有效的免疫球蛋白提取方法，适用于从人血清等样品中提取纯度较高的免疫球蛋白样品。
通过该实验方案，可以得到稳定、纯度较高的免疫球蛋白样品，为后续实验研究提供基础数据和支持。
需要注意的是，在实验过程中要严格控制实验条件，以确保实验结果的可靠性和有效性。
RhD全分子IgG的分离纯化方法及其纯度鉴定
RhD全分子IgG的分离纯化方法及其纯度鉴定RhD抗原是人体红细胞表面的重要抗原之一，与Rh血型系统密切相关。
RhD 抗原的存在与否在输血、妊娠等方面具有重要意义。
因此，对RhD抗原的研究具有重要的临床意义。
RhD全分子IgG是RhD抗原在人体内产生的特异性抗体，分离纯化RhD全分子IgG并判断其纯度是研究RhD抗原的关键步骤。
分离纯化RhD全分子IgG的方法一般可以通过几步骤实现：血浆收集、蛋白质分离、特异性亲和层析和纯度鉴定。
首先，血浆收集是获得RhD全分子IgG的最初步骤。
可以从RhD阳性的健康捐赠者的血浆中获得较高纯度的RhD全分子IgG。
在获得血浆后，需要对其进行初步处理，如离心、过滤等，以去除杂质和红细胞。
接下来，蛋白质分离是RhD全分子IgG分离纯化的关键步骤。
可以使用不同的蛋白质分离方法来提取血浆中的IgG。
常用的方法包括酸性混合物沉淀法、硫酸铵盐析法和氯化铵盐析法。
这些方法可以将血浆中的蛋白质按照它们的溶解度和电荷特性分离出来，从而分离得到RhD全分子IgG。
特异性亲和层析是获得高纯度RhD全分子IgG的有效方法。
可以利用RhD抗原与RhD特异性抗体之间的特异性结合来分离纯化RhD全分子IgG。
这种方法可以选择性地将RhD全分子IgG从其他蛋白质中分离出来，提高纯度。
纯度鉴定是确定获得的RhD全分子IgG样品纯度的重要步骤。
可以使用多种方法来鉴定纯度，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting、ELISA等。
这些方法可以检测RhD全分子IgG在样品中的存在，并判断其纯度。
总的来说，分离纯化RhD全分子IgG是研究RhD抗原的重要步骤。
通过血浆收集、蛋白质分离、特异性亲和层析和纯度鉴定等步骤，可以获得高纯度的RhD 全分子IgG。
这为进一步研究RhD抗原的生物学功能以及临床应用奠定了基础。
需要注意的是，从RhD阳性血浆中分离纯化RhD全分子IgG的过程中应遵循严格的生物安全操作规程，以确保实验操作安全，防止污染和交叉感染的发生。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
血清IgG的分离纯化及测定
SPA-sepharose亲合层析法
• protein A上柱
•
• •
血清与protein A结合
清洗掉杂蛋白 洗脱下所需IgG
IgG浓度测定
• 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法 (Folin-酚法)， BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法Βιβλιοθήκη 体分离多抗纯化方法有很多种：
• • • • • 盐析法 辛酸-硫酸铵沉淀 冷酒精沉淀 离子交换层析 Protein A,G亲和层析
盐析法
• 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分 子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的 水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质 溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电 荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，导 致蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1000—10000 540 20—500 750 595
考马氏亮蓝G-250 50—500
BCA
20—200
562
紫外吸收法测蛋白质含量
• 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm处具有最大吸收量，且各种蛋白质的这三 种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液 在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
• 葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG 分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力 有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPAsepharose 柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯 化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
SPA-sepharose亲合层析法
• • • • • Protein A — 葡萄球菌A蛋白 Buffer A — PH8.6 磷酸盐缓冲液 Buffer B1 — PH5.5 枸橼酸缓冲液 Buffer B2 — PH4.0 枸橼酸缓冲液 Buffer C — PH8.6 Tris缓冲液
血清免疫球蛋白IgG提取
此处添加副标题内容免疫球蛋白IgG提取原理；
熟悉血清免疫球蛋白IgG提取操作过程和方法
原理 1
IgG是血清中主要的免疫球 蛋白，占全部抗体含量的70 ％－75％，在临床免疫学检 验技术中常用到的第二抗体 就是通过用纯化人IgG作抗 原免疫动物而来
结果判断
效价可用免疫双扩散试验判断 特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察
1
思考题
2
盐析法提取免疫球蛋白的实验 原理？
盐析法提取免疫球蛋白时，主 要的影响因素有哪些？
注意事项
蛋白质的浓度、盐的浓度、PH值、 温度对盐析的效果有影响
饱和硫酸铵溶液的滴加方式
盐析后放置时间、离心操作的速度、 时间
透析袋的使用
01 方法评价
02 硫酸铵水中溶解度高，受温度影响小，不易使蛋白质变性，操 作简单，为盐析中常用的中性盐
硫酸铵中含有氮，会干扰蛋白质的测定，且溶液的缓冲能力差， 故多用于大量蛋白的粗提。若要获得纯化的免疫球蛋白，必须 经过凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析进一步提纯
分在此时不易沉淀，通过离心可将两者分离。
原理
02
材料
样本 正常人血清
试剂
○ 生理盐水、饱和硫酸铵溶液、 ○ 透析缓冲液
主要器材 离心机 冰箱 透析 袋 紫外分光光度计等
操作步骤
1.25ML血清＋1.25ML生理盐水 滴加饱和硫酸铵溶液2.5ML
室温静置30min, 离心4000rpm,10min
弃去上清液（含清蛋白）
沉淀溶于生理盐水,使体积达1.25ML 滴加饱和硫酸铵溶液0.625ML
室温静置30min,
重
离心4000rpm,10min
igg分离纯化和鉴定
igg分离纯化和鉴定分离纯化和鉴定是在生物技术领域中常用的实验技术，用于提取目标物质并确定其纯度和特性。
下面以IGG为例，介绍分离纯化和鉴定的步骤和方法。
分离纯化IGG的第一步是蛋白质提取。
可以选择适当的提取缓冲液，将IGG所在的样品（如血浆或细胞培养液）与提取缓冲液进行适当的混合，使细胞或组织中的蛋白质释放出来。
提取后，可以使用离心等方法去除杂质。
将混合物进行离心，使得IGG和其他蛋白质分离。
离心后，可以将上清液取出，其中含有较高纯度的IGG。
为了进一步提高IGG的纯度，可以使用亲和层析等技术。
亲和层析是利用IGG与特定配体之间的亲和力进行分离的方法。
可以将配体固定在柱子上，然后将提取的上清液通过柱子，IGG会与配体结合，其他蛋白质则流过。
最后，通过改变柱子的条件，如改变pH值或添加特定溶剂，可以使IGG与配体解离，从而获得纯净的IGG。
获得纯净的IGG后，需要对其进行鉴定。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE和Western blotting。
SDS-PAGE可以将蛋白质按照分子量分离出来，可以通过与已知分子量的标准蛋白进行比较，确定IGG的分子量。
Western blotting则可以通过与特异性抗体的结合来确认IGG的存在。
除了分子量和存在性，还可以使用其他方法对IGG进行鉴定，如免疫荧光和ELISA等。
免疫荧光可以通过特异性抗体与IGG结合后的荧光信号来检测IGG的存在。
ELISA可以通过与特异性抗体的结合来定量IGG的含量。
总的来说，分离纯化和鉴定IGG是一个复杂的过程，需要使用多种技术和方法。
通过合理的实验设计和操作，可以获得高纯度的IGG，并对其进行准确的鉴定。
这些技术的应用不仅可以用于IGG的分离纯化和鉴定，还可以应用于其他蛋白质的研究和应用中。
抗人红细胞RhD全分子IgG的纯化方法研究及其在妊娠期RhD阴性患者预防HDN中的应用前景
抗人红细胞RhD全分子IgG的纯化方法研究及其在妊娠期RhD阴性患者预防HDN中的应用前景HDN（Hemolytic Disease of the Newborn，新生儿溶血病）是一种常见而严重的妊娠并发症，妊娠期RhD阴性患者与RhD阳性胎儿的血型不兼容是其主要原因之一。
本文将针对抗人红细胞RhD全分子IgG的纯化方法进行研究，并探讨其在预防妊娠期RhD阴性患者HDN中的应用前景。
首先，为了纯化抗人红细胞RhD全分子IgG，我们可以选择从人血清中提取抗体进行纯化。
一种常用的方法是采用亲和层析技术，通过对抗体与融合蛋白或人重组RhD蛋白的特异亲和结合进行分离纯化。
另外，也可以利用柱层析、离子交换层析和凝胶过滤等方法对抗体进行纯化。
通过以上方法可以获得较高纯度的抗人红细胞RhD全分子IgG。
其次，对于妊娠期RhD阴性患者预防HDN而言，抗人红细胞RhD全分子IgG 可以起到重要的作用。
这是因为妊娠期RhD阴性患者在初次妊娠期产生抗RhD抗体后，再次患有RhD阳性胎儿时，由于已经存在抗体，会导致抗原抗体反应和胎儿红细胞破坏，从而引发HDN。
抗人红细胞RhD全分子IgG的注射可以抑制RhD 阳性胎儿红细胞与母亲体内产生的抗体结合，减少HDN的发生。
研究表明，在妊娠期RhD阴性患者中，合理应用抗人红细胞RhD全分子IgG 可以显著降低HDN的发生率。
根据欧美等地的临床数据显示，适当的抗体药物注射可以让大部分妊娠期RhD阴性患者免受HDN的病痛困扰。
这种注射通常在妊娠期28周进行，以确保药物充分发挥作用。
然而，虽然抗人红细胞RhD全分子IgG在HDN预防中发挥着重要作用，但仍然存在一些问题需要加以关注。
首先，注射抗体药物需要考虑母婴安全性，确保药物的剂量和使用方法合理，以避免潜在的不良反应。
其次，需要进一步研究抗体注射的最佳时间，以提高预防效果。
此外，长期使用抗人红细胞RhD全分子IgG是否会产生耐药性和免疫抑制等问题也需要进一步研究。
低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白
低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白一、实验目的利用低温乙醇法从人血清中分离出免疫球蛋白（Ig），并获得副产物血清白蛋白。
二、实验原理（1）低温乙醇法Cohn6法：美国哈佛大学Ｅ·Ｊ·COHN教授研究组，在短短两年建立了低温乙醇分段提取法。
方法原理：往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂，如乙醇、丙酮等，主要是降低水分子的活度，降低溶液的介电常数，从蛋白分子周围排斥水分子，使蛋白分子之间通过极性基团的相互作用，在范德华力作用下，发生凝聚。
不过由于有机溶剂存在，降低了蛋白分子表面憎水基团的作用，因而引起蛋白分子聚集的主要极性基团的相互电荷之间的引力。
（文献20）分离过程中，二法通过五个因素的变动(五变系统)，使很多血浆蛋白质得以分离。
这五个因素及其各自的作用是；①乙醇：使蛋白质分子“脱水”；⑦pH值；蛋白质在等电点时易于沉淀；②电解质浓度：在低离子浓度下，对蛋白质溶解度有较大影响；④蛋白质浓度：浓度越低，其沉淀作用越小；⑥温度：在低温下，可避免乙醇对蛋白质的变性作用。
同时，蛋白质溶解为吸热反应，溶解度随温度上升而增高。
经实验得知，利用低温乙醇法能将血清蛋白分成六个组分（Ⅰ~Ⅵ），其中免疫球蛋白IgG主要存在于Ⅱ+Ⅲ中，白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。
(2) Cohn氏9法；该法对Cohn氏6法的组分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离和提纯，可获得组分Ⅱ—l，2，3(Y—G)，组分Ⅲ一1(同种凝集素)，组分Ⅲ—2(凝血酶原)，组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。
其工艺流程见图:第1 / 8页乙醇法生产中所用的乙醇是通过予冷、慢速搅拌滴入的。
其体积可按下式计算：式中V＝所需乙醇体积；V0＝原来溶液体积；C 1＝原来溶液乙醇浓度；C2＝所需达到乙醇浓度；C3＝加入乙醇的浓度。
三、材料和试剂3.1 血清：100 mL3.2 相关试剂：95%乙醇，pH4. 0醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液Ⅰ，磷酸盐缓冲液Ⅱ，3 mol/L NaCl溶液，1 mol/L NaHCO3 ，生理氯化钠溶液，麦芽糖，3.3 实验仪器：四、方法与步骤基本思路：第2 / 8页血清的初处理——利用Cohn6法得到组分Ⅱ+Ⅲ——利用Cohn9法得到IgG——IgG沉淀的保存（浓缩蛋白液或冻干品）——Ig 物理性状及生化检定（蛋白含量、纯度、免疫活性、稳定性）4.1 血清的初处理（文献[4]，名词.txt中关于血清的部分）（1）将血清从冷冻箱（-5C至-20℃）取出后，先置于2-8℃冰箱使之溶解（2）在室温下使之全溶。
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用三氯三嗪键合法制备20张直径为47mm带苯丙氨酸配位基的亲和膜，装配在碟式亲和膜分离器中，用0．05mol／LNaHzPO 溶液稀释4mL人血浆，将血浆稀释液以1mL／min的流速泵入亲和膜分离器，先用1mol／LNaC1溶液50mL在2mL／min流速下洗脱膜上残留的杂蛋白，再改用1mol／L氯化钠／乙二醇(等体积)，在同样流量下洗脱膜上亲和吸附的IgG，收集洗脱液，透析后收集样品，所得IgG纯度为83．5 ，回收率为78 ．
2 IgG的纯化方法
根据IgG的不同特性，IgG的纯化方法主要有以下几种：
2．1 饱和硫酸铵盐析法
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一．因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高．但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出．硫酸铵是盐析最常用的无机盐，其主要特点是溶解度大，随温度变化小；对蛋白质有保护作用，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性；溶解于水时不产生热量，价格低廉，但在碱性环境中不能用硫酸铵作为沉淀剂进行盐析反应．在血清中加入硫酸铵，当饱和度为28 ～33 时，优球蛋白析出；33 ～55 时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%后，白蛋白析出，这是硫酸铵分析沉淀血清蛋白的一 般规律[3]．
在10mL人血清中加入等量0。025MpH7．8的磷酸盐缓冲液(PBS)后，再加入分子量为1000的PEG溶液，终浓度为16 ，将试样分别置旋涡混合器上混匀，置冰箱(4℃)过夜，次日离心5～10min(2500rpm)，弃上清，沉淀用0．025MpH7．8的PBS溶解，直接上DEAE纤维素柱层析，以0．0175MpH6．3的PBS洗脱．在此条件下分离人IgG其比活性为0．95mg／mg蛋白质，活性回收率为95%．
2．2 有机溶剂沉淀法
有机溶剂沉淀法是利用有机溶剂能破坏溶质分子周围形成的水化层，使溶质分子脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度；而且有机溶剂的介电常数比水小，随着有机溶剂的加入，整个溶液的介电常数降低，带电溶质分子之间的库仑引力逐渐增强，于是发生相互吸引而聚集．一般来说，溶质分子量越大，越容易被有机溶剂沉淀，发生沉淀所需要的有机溶剂浓度越低[7]．在这主要介绍辛酸法．
2．3 聚乙二醇(PEG)置换法
水溶性非离子型聚合物沉淀法 常用的聚合物为聚乙二醇(PEG)及右旋糖酐．水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制还不清楚，大致有如下解释：聚合物与蛋白质形成共沉物；聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；聚合物与蛋白质形成复合物．此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等．PEG在浓度为3 ～4时可沉淀去除了蛋黄脂磷蛋白及脂质，6 ～7可沉淀IgM，8 ～12 沉淀IgG，12 ～15 沉淀其他球蛋白，25 则沉淀白蛋白．
2．4 ProteinA亲合膜色谱法
膜色作用进行分离纯化，当料液以一定流速流过膜的时候，目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合，而杂质则透过膜孔流出，待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来．ProteinA能与人IgG分子的Fc段结合，但只结合其中的IgG1，IgG2和IgG4亚类，不能结合IgG3亚类．
盐析法
具有成本低、设备简单、对被分离物可保存其生物活性
需时较长，降低效价，产品的纯度不高，沉淀离心过程的损耗较大
亲和膜色谱法
较有效的生物活性物质纯化方法，蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，活性回收率提高；纯化步骤简单，适用于不稳定蛋白纯化
3 各种IgG纯化方法比较
盐析法是最早使用的生化分离手段之一．由于其经济、不需特殊设备，操作简便、应用范围广，至今仍为最常用的生化分离纯化手段；有机溶剂法的分辨率高于盐析，而且因溶剂沸点较低，除去及回收方便；但有机溶剂沉淀法比盐析法易使蛋白质变性失活．非离子聚合物沉淀法的沉淀效率很高，反应时不需要使用很多的聚乙二醇；液相层析则在各种下游纯化工艺中应用最为广泛的技术；膜色谱则由于以多孔膜作为基质材料，故具有很多的潜在优势．然而，在应用膜色谱技术时应注意料液对膜的堵塞与污染，以防造成膜吸附的功能下降[2]．各种LgG分离纯化方法的比较见表2．
吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体会脱落进入分离体系；载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，配基与载体耦联条件激烈等