人血清中分离纯化鸡IgG、IgM的实用方法

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Ａ咖 ｃ ａｄＩ ｅ ｒ ａ ｄｆｍ ｔ ｅｒｈｄｅｌ ｅ Ｆｌｂ ｒ ｉｔｉ 柚 ｈ ０ ，３ ３ ％ ｓ ｍ ａ ｄａ￣ ｕ 】 ｔ Ｉ ｎ Ｇ ｗ ｐｅ ｒ ｅ ｅＩ ｎｉ ｅ ｋ ｋｎ￣ ｏｔｙｐ ｅ ｔ ｏ ｇ ｐｅ ｒ ｈ ｃ ｅ ｌ ｅ ｐｍ ｎ ％ ３ ％，３ ｔ ｒ ｅ ｌ ｍ ５ ａ ｔ ｒ 自 ｌ ・ ｆ ｒｉ １ｓｐＢ －Ｂ Ｉ ｒｐｒ ｏ 枷目ｃｔｎ ｏｒｐｅ ｃｎ ｌ 删 ｉ ａ ｏ １ ｅ１瑚ｅ ． Ｇｐｅａａ ｎ ｅ ｌ ｔｎ３ ｔ １ 】 ４ ｇ ｉ ｔ ｈ ｒ ｇａｈｄａｓ ｏｄ曲 ０ Ｅ ＥｃｌＸｅｅｃ ｇ ． ａ ｜ｂ Ｄ － ｏ￣ ｅ ＩａＤ Ａ －ｅｕ ｓ ｘＩ ｅ Ｂ ｙＳ Ｓ ｌ ｌｏ Ｉ
１３ 血清 Ｉ的粗提 ． ｇ
取富集 Ｉ ｅ ， Ｍ鸡血清 ｌＯ． 加 Ｏｍ ， １
人 １０ ｌ ￣ （ １ ｐ ．）逐 滴 加 人 ２０Ｉ 饱 和 ０ｍ ｓｏＯ Ｍ，Ｈ８０ ， Ｐ ０ｒ ｌ Ｉ （ Ｈ ）Ｓ４终浓 度 ５ ％ ）４ｃ Ｎ ４２Ｏ （ ０ ，。过夜 ；５０／ ｉ， 心 ３０ｒｒｎ 离 ａ
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３ － － ７ ）
苹２ 卷 ２ 第５ 期
中 国 预 防 兽 医 学 报
Ｖ ｌ２ ｏ ２， Ｎ ． ｏ５ Ｓｐ ． ２ ０ ｅｔ ００
２Ｏ ＯＯ年 ９ 月
Ｃ ｉｅｅＪｕｎ ｌｏ ｒｖｎｉ ｔ ｎ ｒ ｄｄｎ ｈｎ ｓ ｏｒ ａ ｆ ｅ ｅ ｔ ｅＶｅ ｒ ａｙＭｅ ｉ ｅ Ｐ ｖ ｅ ｉ
２４ 血清 经 ５％ 、３ １％３次 沉淀 ， 淀 部分 经 ． ０ ３ ％、８ 沉
Ｓ Ｄａ ４ ｅｈ 一 Ｂ层 析 ， 同样 得 到三 个 蛋 白峰 ， 第 １峰 但 明显提 高。上 清部 分 经 ３ ％饱 和 硫 酸 铵 再 次 沉 淀 ３
柱， 洗脱 液均 为 Ｔ ｓ Ｉ ０Ｍｎ ８０ ， ６— （ ５ Ｈ ）记录 并收集 ＨＣ ０．
后过 ｓＤａｏ Ｂ得到 的第 １ 白峰显 著 降低 ｅｈｒｅ４ ｓ 蛋 而第 ３ 明显提 高。 峰
２ ５ 一 基乙醇处理前 后凝 集试 验结果见 表 ｌ ２巯 。
铵 粗提 ，ｅｈｒ ｅ４ Ｓｐ ａ ｓ Ｂ层 析收集 到三个 蛋 白峰 。 ｏ ２ ２ 血清 粗 提 物经 Ｓｐ ａｏｓ ４ ． ｅｈｒｅｅ Ｂ层 析 的 第 ３蛋 白 峰 透析浓缩后 过 Ｄ￣ Ｅ纤 维 素 离 子 交换 柱 ， Ｆ Ａ 洗脱 有 两个 蛋 白峰 。
上清部分 加饱 和 （Ｈ ） Ｏ Ｎ ４ Ｓ ，至 ３％ ， 次 沉 淀 ， ３ 再
为研究鸡 Ｉ 、￣打下了坚实基础。 Ｉ Ｓ １ 材料 和方 法 １１ 材料 和主要 试 剂 ． ＳＦ鸡 血清采 自哈尔滨 兽 Ｐ
后配制成 ７ ｖ Ｖ ， ％（／ ）７ ０日龄 ｓ 鸡翅静脉接种绵羊红 Ｐ 细胞 ｌｌ只。４天后， ｍ／ 心脏采 血 ， 离血清 ， 分 测血凝 价 ， 凝集价 ６ 倍 上者合并一起 ， ｃ ４ ． 保存 。 ∞。
淀溶于 Ｔ ｓＨ ｌ ．５ Ｈ ． ）４ ｃ ｉ ｆ ． Ｃ（ ０ Ｍ ｐ ８ ０ ， 。 透析 ４ Ｏ ８小时 ， 其
收稿 日期 ： 姗
一０ —２ ２ １
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第 ５期
孙 建 宏 ． ． 从 血 清 中分 离纯 化 鸡 ＩＧ Ｉ 的 实 用 方法 等 ｇ 、Ｍ ｇ
３０ ｒｒｎ离 心后 收 集 沉 淀 ， 解后 透 析 、 ５０／ ｉ ａ 溶 浓缩 。将 溶 解 的 １ ％和 ３ ％ 沉 淀 部 分 分 别 过 Ｓｐ ａ ｓ ４ ８ ３ ｅ ｈｒ ｅ Ｂ ｏ
２３ 血清粗 提物用 去离 水透析后 经 ￣ ｈｔｓ ４ ． ａ ｅ Ｂ层 ｏ
析 ， 获的第 １ 量 明显 提高 。 收 峰
从血清中分离纯化鸡 ＩＧ、 Ｍ的实用方法 ｇ Ｉ ｇ
／
孙 宏，殿 刘 欣 闰 辉， 建 膏 军 ，培 ，丽 臣
（国 业 军 中农科 面 兽医 物 木国 重 宴 宣．尔 ｔｃｔ 再 生 挂 家 点 验 啃 滨 ｓｏ ｃ ）
擅蔓 本 试验 用锦羊红细胞免疫鸡 ， 免疫 后 ５天采 血 ， 制备 膏集 Ｉ 血 清。应 用硫酸愤粗提 、￣ｌｔ ． Ｓｔｕ， ４ ：ｔ ￣ Ｂ分 子筛 层析方
Ｐ Ｅ ａ ｄＷｔｔ ｎ ｂｏ ｏ＆ｒ ｄ Ｂ ｅｅ ＡＧ ｎ ￣ｃ －ｌ ｅｒ ｍｅ ｕ ｅ￣ ｎ０ ｋｃ ｅ ｓ ａ ｄＩ ． ｈ ｔｏ ｓｉｅ ｐｎｉｅａｄ ｍ ｕｉ ａｉ ｆ ｌｋｎ ＩＭ ｎ ｓ Ｔ ｅｍｅｈｄ ｉ ｎ ｘｅ ｓ ｎ ｉ ｆ ｏ ｃ Ｇ ｖ
２ ５分钟 ； 淀溶 于 ２０ ｌ Ｂ ， 入 １０ ｌ 和 硫 酸 沉 ０ ｍ Ｓ 加 Ｐ ０ｍ 饱
基盘珥 目： 国家 自然科 学基盎重大项 目（９９２０４ 资助 ３８３９－）
＊通讯 作者
铵 （ 浓度 ３ ％）４ｃ 置 ２ 时 ；５０／ａ 终 ３ ，ｏ放 小 ３（ ｒｒｎ离心 ２ ３ ｉ ５ 分钟 ， 上清， 弃 再用 ３ ％饱 和 硫 酸 铵沉 淀 一次 。沉 ３
法， 从膏集 Ｚ ｇ Ｍ的鸡血清一次性分离提 取高纯度的 ｌ 及纯度较高 的 Ｉ 并经 Ｄ ，Ｅ５ ｓ ￣． Ｆ －２奸维 索离子交换屡析进 一步纯 化 ， Ｋ 获
年 电爿 吨的 Ｉ ． ｃ 。经鉴定该方法制备的 Ｉ Ｉ 完全可以满足免疫学实 验要求 、 ｇ Ｇ， 从一 份血清样 品中 罔时纯化 ＺＭ、 两种免 ｇ Ｉ
疰球
冀调硫铰 ｐ ； ； 鸡血墒 粥 怒Ｊ ■ 酸； Ｉ ∥ ｊ 【 化
Ｓ ａｏ －Ｂ ｅｈ ￣ ４ ； Ｉｉ ； ｒ ． ｇ
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中 田分蜒 —ｉ ２ — — ＿ 丽 码— 写 了 —
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文章 埔母 ｌ ８５ （ｏ） ．７０ Ｏ －８ ２ ｏ ５３８３ ＯＯ ９ ｏ ｏ０ －
医研究所 ＳＦ鸡房 。兔抗 鸡 Ｉ 由哈 尔滨 兽 医研究 Ｐ ｓ Ｇ 所 李海燕 博士惠 赠 。酶标 抗 鸡 ＩＧ单 抗 为 Ｓｅ ａ产 田 ｉｎ 品 ． 尔 滨兽医研 究 所王 笑 梅 副研 究 员 赢赠 。 绵羊 哈 红 细胞采 自哈尔滨 兽医研 究所 马传贫课题 组 的健康 绵 羊。 Ｄ Ａ ，２纤 维 素 系 Ｗｈｔｔ 产 品。 琼 脂 糖 Ｅ Ｅ５ ａ ｍ ｍ （ｅｈｍ ｅ４ Ｓｐａ ｓ）Ｂ为 Ｐａ ｍｃ 产 品。（ Ｈ ）Ｓ４ 北 京 ｈｍ ＇ａ ｉ Ｎ ４ ２Ｏ ， 化工 厂制造 。电泳 及 电转 移 试 剂按 分 子 克隆 配 制 。
Ｎ Ｃ 和含 ０ ５ ａ ｌ Ｔ ｓ １ｐ ８ ０ 线性 洗 脱 ， ａ１ ．Ｍ Ｎ Ｃ 的 ｎ． （ Ｈ ． ） ＨＣ 记录 并收集 各蛋 白峰 。 １ ５ ＩＧ ． ｇ 、 的鉴 别与 纯度鉴 定
出后充 分洗 涤 ， 放人 适 当稀释 的酶 标兔 抗 鸡 Ｉ ｇ Ｇ中 ，
３。作用 １ ７ Ｃ 小时。膜放人 新配制的 ４氯一 奈酚底物溶 ＿ ｌ 一 液中，７ ｌ ～１ 分钟 ， ３℃， ０ ５ 放入水中终止反应。
３９ ７
间换 液 ５— ６次 。
２， ］配制 １％的分离胶 ，％积层胶。电转移完毕 ， ２ ４ 取出
１４ ．
血 清 、＃ｔ 纯化 Ｉ 的
将 上 述 富集
血
膜浸于含 １％牛血清的 Ｐ３ ０ Ｉ Ｔ中 ， ￣ 作用 １ 时。取 Ｓ ３Ｃ ７ 小
清粗 提物 ， Ｐ Ｇ浓缩 至 １ｍ ， ５ ｌ经 ｓｐ ｒ ｅ 用 Ｅ ０ ｌ取 ｍ ， ｅ｝ ０ ｍ ｓ ４ Ｂ柱 （ｍ×２ｍ） １ ｅ 层析 ， ０ ０Ｍ，Ｈ ． ｆ．Ｃ 洗 用 ．５ ｐ ８０Ｔ ｓ １ ｉＨ 脱， 流速 ０ ２ｍ／ ｉ。分 别 收集 各蛋 白峰。经 鉴定 ．５ ！ｍｎ 将 Ⅲ峰浓 缩后过 Ｄ Ａ Ｅ Ｅ纤 维 素离 子 交 换 柱 ， 不 含 用
小时 后 ，５Ｏ／ ｉ ， ３０ ｒｒ ｎ 离心 ２ ａ ５分钟 ， 分别 收集上 清和沉 淀部分 。 沉 淀 部分 用 ０ ０ Ｍ ｐ ８ ０Ｔ ｓＨ Ｉ 解 ； ．５ Ｈ ． ｆ — Ｃ 溶 ｉ
２ 结
果 的血清 经 ５ ％、 ３ ３ ％饱 和硫 酸 ０ ３ ％、 ３
２ １ 富集 ．
各蛋 白峰 。
１５３ 二 巯 基 乙醇 试 验 ， 照 文 献 ［ ］ 法 ， 按 ．． 参 Ｉ方 将
１３粗提后 过 Ｓｐ￣ ． ｃｈ －Ｂ的 Ｉ、 ４ Ⅲ峰分 别经 ２巯 基 一 乙醇处理 后 ， 行血凝试 验 。 进
１５４ Ｓ ＳＰ Ｃ 电泳 及 Ｗｅ ｅ －ｌ 分 析 ， 照 文 献 ． Ｄ －Ａ Ｅ ｓｒ ｂ ｔ ｔ ｎ ｏ 参
１５ ５ 琼 脂扩散试 验 ， ．． 参照 文献 ［ 法 ， ３方 配制
０８ ％琼脂 。 中间孔 为适 当稀 释 的兔 抗 鸡 ＩＧ 周 围 ｇ，
孔为被检样 品 ： 血清粗提 物经 Ｓｐ ａ ｓ ４ ｅｈｒ ｅ Ｂ分 过的第 ｏ
１ ３峰 。 、
１５１ 按 １２２ ．． ．．方法粗提 ， 粗提物用去离 子水透析 ４ ８ 小时 ， 问换液 ３ 次 ， 其 —４ 之后低速离心 ， 沉淀部分再用 ＴｓＨ ａｐ ８０溶解后过 ｓＤａ Ｂ层析柱 。 ｆ—Ｃ（Ｈ ．） ｅｈｒ ４ ∞ｅ １５２ ５ｍ 富集 Ｉ 的 血 清 ， 经 ５ ％、３ ．． ０ ｌ 先 ０ ３ ％饱 和 硫酸 铵沉 淀 后 ， 用 １％ 饱和 硫 酸 铵 沉 淀 ， 用 ２ 再 ８ 作
Ａ ｍｏｌｌ ｓｌｈｔ； Ｓ ｐ ｍｏｅ４ ｎ ｌｔ ｕｐａｅ ｉｍ ｅ ｈ － －Ｂ； Ｉ ； ｓ
０ｍ Ｉ ｏ－ｉｇ ａ ｔｏ ｐ ｒ “ ｕｈ ｒ ｄ
Ｅ．Ａ方法 因其 特异 、 感 、 性好等优点而成 ＩＳ ， Ｉ 敏 重复 为 目前 研 究 免 疫球 蛋 白应 用 最多 的 方 法。为 建 立
Ｗｅｔ ｌ 底 物 ：． １ ． 酚 ， ｒ ｓ ｍｂｏ ｅ ｔ ４Ｃ． 萘 １ Ｍｅ ｋ公 司 产 品 。封 ｃ
Ⅱ凸Ａ 方法， 必须有高纯度的免疫球蛋白制备相应的二
抗或单抗 ， 因此免疫球 蛋 白的 纯化具有重要 意义 。随 着人们对免疫球蛋白性质认识 的深入 及蛋 白质检测 技术的发展 ， 免疫球 蛋白纯化 技术也在不 断改进 。因 鸡 Ｉ 、 的分子大小、 Ｓ Ｉ ￣ 物理化学性质及其在体内分布 不 同， 纯化方法不尽相 同。鸡 Ｉ ｇ Ｉｕ一般从血清 中 Ｇ和 提取。但 Ｉ 在体 内含量很 低 ， 因而要想 获得一定 量 的较纯的 ， 必须采取一定措施使 富集 。我国鸡
Ａ Ｍｅ ｏ ｏ ｕ ｆ ｆ ｈｃｅ ，ｇ Ｆ ｏ ｔｅＳ ｍｅｓ ｔ ｄｆｒＰ ｄ ｙｏ Ｃ ｉ ｎＩ ｈ ｋ ＩＧ ｒｍ ｈ ａ ｅ
；三 ／一
ＳＮＪｘ ，Ａ ｉ ｌ ＬＵＰｉｎＹ ＮＨ ｕ， Ｕ ａ ｉ￣ Ｃ ＯＤ 珊 Ｉ ｅｉ，Ａ ｈｉ ， ｘ ｆ
（日０ Ｋｙ￣ ｏ ｔｙ ｆ ｕ Ｎｔ ｅ Ｉｂｍｏ ｏ ‰ ｒ ｉ ｒ ． Ｌ ｄ
闭液 为含 ｌ％（ ／ 牛 血清 的 Ｐ ｓ。 Ｏ ｖ、 ） Ｂ Ｔ
１２ 富集 训 血清的制备
无菌采绵羊血 ４ ｌ ｍ， 洗涤
Ｉ ｇ Ｇ制备应用的较多 ， Ｉ 研究却十分有限。我们根 鸡 据实验室现有的条件， 采用适当的纯化方法， 从富集 的 鸡血 清一次性 分离 提取 ＧＩｕ 可达 电泳纯。 、 ，