菌种的使用和管理

著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克
维尔市。收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物 等共计16000株以上的微生物种株。
菌种保藏
菌种保藏方法 不同的微生物受不同的环境条件影响其特性会发生改变， 故需要确保菌种在合适的储存条件下保藏。
药典要求:试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证
大肠埃希菌
Escherichia coli
白色念珠菌
[CMCC（B）44 102]
Candida albicans
黑曲霉
[CMCC（F）98 001]
[CMCC（F）98 003]
Aspergillus niger
菌种保藏
样品分离菌库
环境监控菌库 标准菌种菌库 CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）或 CMCC（B） B — 代表细菌、F —代表真菌 ATCC ——美国标准菌种收藏所
文件和记录
文件
申请
申请
需要有详细的贴合实际的SOP，但必须保证符合相应 法规要求。
记录
菌种的接收、储存、领用及复苏记录 工作菌悬液的配制、储存、稀释及领用记录
试验菌株的生物学特性。
一般的保藏方式如下：
冷藏 冷冻 冻干保藏
菌种保藏
冷藏
2-8℃冰箱保藏，是一种短期、有效储藏方法。 工作菌悬液和稀释液均用此方法保藏，储藏时间需要进行 相关的验证，但必须符合法规要求。 保藏方式可以选择如下形式：
肉汤---营养肉汤等
穿刺--- 一般用于厌氧菌的保藏 斜面---营养琼脂 、改良马丁培养基 划平板--- 一般为了得到单颗菌落
菌种的质量控制
文件管理
SOP 记录 能够证明菌种的整个传代过程。
包括接收、传代、使用、销毁。
菌种的质量控制
注意事项：
必须小心处理 使用前确认菌种身份 根据生产商说明书复苏菌种 使用接种技术；不要重复从菌种包装瓶中移取菌种或重 新冷冻菌种。
传代代数（每接种一次即为一代）
菌种的使用过程
Bacillus subtilis
金黄色葡萄球菌
[CMCC（B）63 501] [CMCC（B）26 003]
Staphylococcus aureus
生孢梭菌
Clostridium sporogenes [CMCC（B）64 941]
铜绿假单胞菌
Pseudomonas aeruginosa [CMCC（B）10 104]
所有过程均需要有相 应的记录， 无记录表示无任何活 动！
菌种的使用过程
—冻干菌种的恢复 冻干菌种的恢复（原始菌种或叫0代菌种）
冻干菌种处于一种深度休眠状态，生理特性受到抑制，代谢处于较低状态， 必须经过恢复后才能使用，即将冻干菌种溶解后将其接种于新鲜的营养培 养基上，在一定的温度下培养一段时间。 冻干菌种的恢复一般情况下按照说明书的要求进行，如无说明可以参考以 下进行： 细菌类/酵母类： 菌种管外表面消毒（75%酒精）打开，吸取0.3-0.4m营养肉汤溶解后全部 吸出，加入适量营养肉汤培养（细菌30-35℃18-24h；酵母菌20-25℃2448h） 霉菌: 打开后，加入适量的无菌水溶解后全部吸出，加入适量的无菌水于2025℃恢复2-12小时，将菌悬液接种几个改良马丁琼脂斜面上（一般用三角 瓶，生长的孢子较多）， 于20-25℃7-14天，用含有0.05％吐温80氯化钠 胨水洗刷到其他无菌试管中。
菌种的采购 菌种的接收和储藏 冻干菌种的恢复 非冻干菌种的恢复 储备管制备 工作菌悬液的制备 质量控制及菌种编码 菌种传代示意图
菌种的使用过程
—菌种的采购
所有接收的菌种应保证其传代代数 （药典要求使用时不能超过5代）
菌种的使用过程
—菌种的接收和储存
菌种接收时应对以下项目进行检查: 包装完整性 菌种名称 菌种编码 批号 效期 菌种的储存 严格按照说明书的要求进行储藏。
申请 菌液的制备：细菌和酵母菌用氯化钠蛋白胨水进行稀释；霉菌用 0.8％ 生理盐水稀释）
申请
标识（唯一性，可以追溯） 效期：按照药典要求，菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用，若保存 在2～8℃可在24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证 过的贮存期内使用。 各实验室可以根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制 备标准程序。
菌种的使用过程
—非冻干菌种的恢复
非冻干菌种的恢复
申请
申请
接种斜面----适用于短期保藏，一般细菌为3个月；真菌为4 个月。 如果为第一代的菌种，参考冻干菌种进行恢复后制备储备 管进行冷冻保藏。（或仅接种斜面进行传代）。
菌种恢复
干菌种(安瓿)的开启：
菌种的使用过程 —菌悬液的制备
菌悬液的制备
菌种为第0 代）。
代的定义：每接种一次即为一代（有在新鲜的培养基上生长过程) 传代示意图：
原始菌种
第一代
QC
S1
S2
S3
菌种的质量控制
菌种鉴别
通过一系列的检查来确认菌种的纯度和活性。
鉴别方法:
传统的鉴别方法：菌落形态、个体形态、孢子形态、生化特征等。
菌种的质量控制
培养形态 微观分析 生化鉴定 DNA鉴定
菌种的使用和管理
内容提要：
菌种保藏
菌种的质量控制和鉴定
菌种的使用过程 文件及记录
菌种保藏意义
目的：保证检验中有准备好的菌悬液可以使用。
一般需要使用菌悬液的试验如下： 防腐剂效能试验 方法验证 培养基质量控制
鉴别系统的质量控制
阳性对照
菌种保藏
药品微生物检验常用标准菌株
枯草芽孢杆菌
菌种的使用
质量控制百度文库
申请
申请
质量控制贯穿于整个传代过程，只要有传代发生，则必须有质量控 制 过程。 所有的过程均需要有记录。
菌种编码
编码必须具有唯一性，且可以追溯。例如： 冻干菌种编码ATCC8739/01----ATCC8739表示菌种编码；01表示接收 的第一支。 菌悬液编码D8739/01/18/1-5-20090501----5代表稀释度；20090501表示 2009年5月1日制备。
菌种保藏
冷冻
一般在低于-70℃冰箱内保藏，是一种有效的长期储藏方 法。 需要加入保护剂，例如甘油，可以减少冷冻对菌种的伤害。
储藏时间同样需要进行相关的验证。
菌种保藏
冻干法保藏
是一种长期保藏菌种的方法。 一般情况下购买的冻干菌种即为此种方法。使用时需要进 行溶解、复壮、冷藏。
菌种的质量控制
菌种的质量控制
斜面接种时 的无菌操作
平板划线 分离法
菌种的质量控制
标签
每一支菌种或菌液在储存期内均需要有明确的标识。标签 的内容应包括以下内容： 冷藏、冷冻日期 菌种名称和编码 批号、效期、传代代数
菌种名称：沙门氏菌 储藏时间：2009.01.01 批号：601844，传代2：2009.01.01 培养基批号：0081230， 效期：2012.01.01
效期
传代 鉴定
标识
文件管理
菌种的质量控制
效期
确保所有的菌种应当在有效期内。
标签
菌种名称：沙门氏菌 储藏时间：2009.01.01 批号：601844，传代2：2009.01.01 培养基批号：0081230， 效期：2012.01.01
菌种的质量控制
传代
试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥