花生四烯酸.1doc

花生四烯酸(arachidonieaeid:AA)即全顺一5,8,11,14一二十碳四烯酸,它是一种具有20碳4烯酸的多价不饱和脂肪酸,因此也可称为5,8,一z,14一花生酸,其分子式为CZoH32O2.,结构式为
花生四烯酸在室温下是液体,其熔点是一49.5℃其物理和化学特性见表1.1:
花生四烯酸在生物体内的代谢途径
AA是ɯ一6系多价不饱和脂肪酸，是细胞的重要成分。

花生四烯酸主要以磷脂的形式存于机体各种组织的细胞膜磷脂上,花生四烯酸在细胞中浓度通常是少于10一6M，细胞膜磷脂在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下释放出花生四烯酸，花生四烯酸是细胞膜的主要成分,决定着细胞膜的生物活性。

在哺乳动物中花生四烯酸只能通过亚油酸代谢得到，然而亚油酸(linoleicaeid)在哺乳动物中不能合成,只能通过膳食资源得到然后再代谢成为花生四烯酸,通过花生四烯酸再代谢成许多重要的生物活性分子.因此,现在有人将花生四烯酸!、亚麻酸和亚油酸称为VitmaniF，其在体内的代谢途径是亚油酸先经脱饱和转化成ɤ一亚麻酸,再经延长碳链变成二十碳烯酸(eicosartineoicacid),然后再经脱饱和最终变成花生四烯酸。

花生四烯酸在细胞内的生成有三个途径,即PLA(磷脂酶C)一DG途径,pLC一pA(磷脂酸)途径和pLA2即磷脂酶A2途径。

花生四烯酸的功能
GeorgetMlidrdeBurr在1929年提出了必需脂肪酸的概念,即脂肪的特殊成分可能对动物和人的正常生长发育是必需的,但人体和动物不能合成,只能从膳食中直接获得.他们提出,有三种脂肪酸应被认为是必需的,即亚油酸!花生四烯酸和a一亚麻酸.其实花生四烯酸及其它多
不饱和脂肪酸的必需性早在1920年就被发现了,当时科学家发现喂食完全不含脂肪饲料的老鼠的皮肤损害可以通过亚油酸治愈.这些早期的观察结果已被很多新的发现证实,而且这些新的发现还进一步显示这些ɷ一6和ɷ一3系列多不饱和脂肪酸在许多其它方面对人体有重要作用.很多证据表明多不饱和脂肪酸在预防湿疹、类风湿关节炎、肿瘤及糖尿病方面的积极作用,然而具结论性的干扰性试验还没有,而且进一步的研究也在不断积累中.目前最具结论性的数据来自心血管疾病的研究"花生四烯酸(AA)及其代谢产物具有很强的生物活性,能调节多种细胞功能如平滑肌收缩、神经兴奋性和血小板聚集等.对于婴幼儿和老年人以及某些代谢素乱的成年人来说,其体内的Δ6一脱饱和酶往往活性较低或受到抑制,从而造成体内前列腺素的缺乏,导致种种疾病的产生.Bostock等还报道了花生四烯酸是一种植物抗毒
素的诱发剂。

花生四烯酸的应用
花生四烯酸、Y一亚麻酸和EPA等在细胞内达成一种平衡,一旦这种平衡破坏就会导致许多疾病例如,闭塞性动脉硬化心脏病,动脉血压过高,血胆固醇过多,慢性炎症自体免疫系统混乱,过敏性湿疹,及其它特异性混乱.花生四烯酸和其他多不饱和脂肪酸广泛应用于化妆品、医药、食品和饲料等领域。

微生物脂肪酸构成的质量和数量都受环境因素的影响,培养基的组成、通气、温度和培养时间对大多数微生物的不饱和脂肪酸合成和积累起主要作用。

花生四烯酸是人体前列腺素合成的重要前体物质，具有广泛的生物活性和重要的营养保健作用。

但由于花生四烯酸分子含有四个不饱和双键，因此与外界空气氧接触，极易被氧化降解、丧失生理功效。

本研究就是为了解决花生四烯酸在食品工业领域中所遇到的氧化变质等问题，通过采用微胶囊技术，将花生四烯酸被制成固体颗粒状粉末，增强了其稳定性，延长了货架期。

采用喷雾干燥微胶囊技术，是最为经济有效的方法，极大地扩大了花生四烯酸的应用范围。

微胶囊技术原理
所谓微胶囊技术(Microencapsulation)，就是将微小的芯材物质，多指固体，液体，甚至还有气体的芯材物质，利用天然的或合成的高分子包囊壁材，将芯材包埋形成微小的粉末状态，直径一般在1μm～5000μm 范围内，形成的微型胶囊具有半透性或密封性[24]。

微胶囊技术的原理是根据物质理化性质的差异，用一种性能较稳定的物质作壁材，一定的条件下将性能不稳定的心材物质在包覆起来，当壁材被破坏时，心材便从中释放出来，被人体有效的利用。

微胶囊技术遵循这样的原则：针对不同心材物质及其用途选用一种或几种复合的壁材对其进行包覆。

一般情况下，水溶性壁材适合油溶性心材，而油溶性壁材大多适合水溶性心材使用。

微胶囊技术的功能特点
微胶囊化后的微粒，由于外表有保护层，因此可以避免光照、加热、氧接触等外界环境的影响，极大地保持了芯材原有的味道和生物活性，延长贮存期[29~32]。

（1）改变芯材的的物质存在状态
物料经微胶囊后，其液体或半固体状的芯材即转变成细小的可流动的固体粉末颗粒，虽然在使用上它具有固体特征，但其内部相仍然是液体，故具有保持良好的液相反应性特性。

在贮存、运输和使用方面使其稳定，且方便使用。

（2）保护敏感性活性成分
在食品体系中，由于配料品种繁多，各成分间易发生碰撞而发生反应。

通过微胶囊技术不仅可以使易发生作用的配料相互隔离，阻止化学反应的发生，而且提高了各自的稳定性和产品货架期。

同时微胶囊技术还有效的防止了外界环境因素对芯材的破坏，因此对敏感芯材的活性起到了保护作用。

3）屏蔽味道和气味
有些食品添加剂类，如某些维生素、矿物质等, 由于本身存在明显的异味或不佳的色泽，或者在加工过程中容易产生不良风味，这些都会严重影响食品的质量。

若将这些添加剂进行微胶囊，不仅可掩盖和降低它们所带的不良风味与色泽，同时又可减少易挥发的食品添加剂在加工贮藏中的挥发。

（4）控制心材的释放
利用微胶囊技术可对心材的释放时间和释放速率进行调节控制，人为有效地控制芯材的释放程度，使芯材得到最大限度地发挥其原有的效能，如在食品的防腐剂、酸味剂、膨松剂方面等，微胶囊后不仅避免其不良反应，还有效的改善了食品的品质、延长了贮存期。

（5）其它作用
微胶囊化能降低食品添加剂的毒理作用，降低风味物质的损失，提高风味物质的利用率，降低产品的成本等。

高山被抱霉产花生四烯酸发酵条件的研究
菌体生物量的测定
摇瓶发酵后的培养物,抽滤,并用蒸馏水洗涤菌丝3次,抽干,60℃烘干至恒重,测得生物量(干重)。

油脂抽提
菌体用研钵磨成粉末后用Soxhlet法(索氏提取法)[s〕提取,50℃减压干燥至恒重。

（利用溶剂回流和虹吸原理，使固体物质每一次都能为纯的溶剂所萃取，所以萃取效率较高。

萃取前应先将固体物质研磨细，以增加液体浸溶的面积。

然后将固体物质放在滤纸套内，放置于萃取室中。

如图安装仪器。

当溶剂加热沸腾后，蒸汽通过导气管上升，被冷凝为液体滴入提取器中。

当液面超过虹吸管最高处时，即发生虹吸现象，溶液回流入烧瓶，因此可萃取出溶于溶剂的部分物质。

就这样利用溶剂回流和虹吸作用，使固体中的可溶物富集到烧瓶内。

由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而索氏提取法测定的结果只能是粗脂肪。

）
酵液还原糖的测定
DNS定糖法
发酵液蛋白质的测定
Folin一酚法
脂各组成含量的测定
气相色谱分析法
碳源对发酵产物的影响
很多研究表明葡萄糖是被抱霉利用的适宜碳源,但不同的被抱霉菌株所需的葡萄糖浓度不同。

本文研究了葡萄糖浓度对被孢霉M20产AA的影响,结果见图1。

随着葡萄糖量增加,菌体、油脂量及AA也增加,但当糖浓度大于150g/L时,菌体开始显著下降,这可能是由于培养基的渗透压太高,影响了菌丝的生长。

虽然单位菌体的油脂量不受影响,但总油脂却因生物量减少而呈下降趋势,因此对于本实验菌株而言,葡萄糖浓度应保持在
150留L左右比较理想。

在此基础上用玉米粉糖化液作为碳源(200g玉
米粉加IL水再加2ml高温淀粉酶,混匀,95℃保温lh,过滤,滤液测定葡萄糖浓度,并调至150g/L。

以下简称玉米糖)。

进行被抱霉发酵产AA的研究,结果见图2。

玉米粉糖化液作碳源时,尽管单位菌体油脂含量基本不变,但生物量大大提高,从而总油
脂产量随生物量增加而大大提高。

这可能是由于玉米粉糖化液中有促进被抱霉生长的其他因子如生长素、维生素等。

由于玉米粉是农副产品,价廉物美,以含糖150g/L的玉米粉糖化液为碳源,不仅提高AA产量,而且大大降低成本,是工业发酵生产AA的良好碳源。

氮源对花生四烯酸发酵生产的影响
在发酵基本培养基中,分别以10g/L酵母粉、8.3g/L蛋白脉、2.1g/L尿素、2.g/L硝酸按、6.1g/L 硝酸钠、4.g/L硫酸按(按相同总氮量计算),摇瓶培养,测得菌体干重、油脂产量及AA含量,其结果见表1。

磷酸盐浓度对花生四烯酸发酵生产的影响
以150以L玉米粉糖化液葡萄糖及10g/L酵母粉为培养基中,加磷酸盐,结果见图3。

实验结果表明,磷酸盐的浓度对AA发酵也有一定的影响,3.0g/L的KHZP认对油脂及AA的合成最为有利。

优化培养基的确定
以上实验结果表明,葡萄糖浓度、酵母粉及KH2PO4的浓度对菌体生长及了AA合成有较大影响,此外由于初始pH对菌体生长及AA合成也有较大影响,因此选取这四个因素进行场(34)正交实验，结果表明，玉米粉糖化液葡萄糖150g/L、酵母粉15g/L、NaNo33.0g/L,KH2PO43.0g/L,MgSO47H2O0.5g/L,Ph6.5
2.5温度对发酵产物的影响
在发酵培养期间,温度对菌丝生长及AA的形成有很大影响。

在确定了最佳培养基及pH值后, 对温度进行调控,发现降低温度,有利于油脂的形成。

不同温度条件下菌丝的生物量、油脂及AA的产量变化如表3所示。

实验表明,温度控制在25℃时,菌丝生长旺盛;当温度超过35℃,菌丝死亡;温度在4℃低温下仍能缓慢生长。

从表3中还可看出,随着温度降低,单位重量的菌丝出油率及AA增高,但温度过低,生物量下降,油脂及AA产量也随之下降,故总油脂及AA均在20℃时最高。

总之,从表3的总体分析最适温度的选择应该是前三天温度最好控制25℃,
有利于菌丝的大量繁殖,以后温度适当下降(20℃),有利于油脂及AA的积累。

溶氧量对被抱霉的AA合成的影响
提高溶氧量,可促进被抱霉合成AA。

油脂中脂肪酸含
量的检测方法主要是气相色谱法。

脂肪酸的极性较强，因此需要将脂肪酸衍生成脂肪酸甲酯进行分析，以得到更为可靠和重复性的数据。

常用的方法有三氟化硼法、三甲基氢氧化硫法、酯交换法等，本文使用氢氧化钾甲醇法对油脂进行甲酯化处理，并使用内标法进行检测研究，计算花生四烯酸的含量，此法具有操作简便、快速，重现性好等优点。

菌种
高山被孢霉(Mortierella sp.) 菌株由中科院等离子体研究所经离子束注入法诱变育种获得, 菌丝体干重可达2.88%, 总脂可达50.6%, AA质量分数可到55.6%。

工艺流程
工艺条件
斜面培养: 安瓿管菌种接种于试管斜面, 温度28 ℃, 湿度60%～70%, 培养8～9 d, 转接至茄子瓶斜面温度28 ℃, 湿度60%～70%, 培养8～9 d即得。

种子培养: 分别将100 mL种子培养基装入500 mL三角瓶中, 120 ℃灭菌30 min, 冷却后, 按5%接种量接入孢子悬液, 置于摇床(200 r/min) 温度28 ℃, 湿度60%～70%, 培养48 h。

发酵过程: 将摇瓶种子液接入一级发酵罐(1.5 m3)培养2 d后, 接种至二级发酵罐(10 m 3)培养2 d, 接种至三级发酵罐(40 m3) 进行发酵, 通气量1︰0.5( 体积比), 整个过程对pH值和溶氧进行调节并控制发酵过程中产生的泡沫, 降温培养7d至发酵终点放罐。

菌体干燥: 将发酵液经过板框压滤得菌丝体, 通过振动流化床干燥得到干菌体, 再用溶剂萃取, 经脱溶得到AA毛油。

精炼: 毛油经过溶剂混合后进行水化、碱炼、脱色、脱溶、脱臭得到成品油。

脲包法富集微生物油脂中花生四烯酸
脲包法是分离、提纯或富集某种脂肪族化合物的一种重要手段，在脂类技术中脲包法得到了较为广泛地应用，尤其是在分离和富集不同饱和度的脂肪酸时应用更多。

脲包法分离混合脂肪酸，主要是基于脂肪酸的不饱和程度和碳链长度不同的特点而进行的。

脲本身是具有四方晶系的充实结晶，不具有可让它种分子包入的自由空间，但当脲溶解于甲醇等有机溶剂中，遇到有直链脂肪酸、酯、醇等有机物时，脲分子之间通过强大的氢键力以右旋方式，在有机物分子的周围沿六棱柱边螺旋上升，形成宽大的六方晶体，饱和脂肪酸易与脲形成稳定的脲包物，低不饱和脂肪酸的脲包物一般是短而粗的晶体，且很不稳定，而三烯和三烯以上的多不饱和脂肪酸较难形成脲包物。

因此，利用这一性质可将多烯酸与直链饱和脂肪酸及它们的一、二烯酸分开。

该方法工艺较成熟，设备简单，操作简便，成本较低；尤其是不在高温下进行，能较完全地保留其营养和生理活性，同时脲包物形成后即可保护双键不受空气氧化，尤其适宜富含PVFAs的油脂进行富集。

脲包过程的反应是放热反应，升温不利于脲包物的形成，因此反应一般在低温下进行，而高不饱和脂肪酸及其酯则要在-30~-40℃方能形成脲包物。

脲包反应中一般用尿素的醇饱和溶液，若溶剂过量，达不到结晶浓度，脲包反应将逆转，酸碱条件会使脲包物分解，不同脲酯（酸）之比，将影响反应的选择性。

因此，影响脲包反应的因素主要有温度、脲酯（酸）比、酸碱条件，脲包客体型式（酯型或酸型）等。

本文就这些因素对该方法应用于富集微生物油脂中花生四烯酸时的影响作了一些探索和研究，为脲包法富集微生物油脂中多不饱和脂肪酸的研究提供了实验依据。

葡萄糖是被孢霉发酵生产花生四烯酸的碳源,其浓度直接影响菌体生长和产物合成。

低糖浓度下细胞生长处于营养缺乏状态,菌体生长缓慢;高糖浓度下环境渗透压升高,细胞的生长受到抑制。

在葡萄糖总量一定的情况下,将葡萄糖分二次等量加料,
菌体老化是将由发酵液中离心收集的菌丝体在低温下贮存的过程。

被孢霉利用葡萄糖为碳源,在胞内系列酶的作用下合成花生四烯酸,产物常以油脂的形式在菌体内贮存。

在老化过程中,菌体内油脂含量及组成会发生变化。

实验结果表明,菌体老化是提高花生四烯酸产率的有效方法。

老化5 d后,花生四烯酸产率随时间变化不大。

老化温度对花生四烯酸产率影响不大,但低温下更有利于菌体贮存。

花生四烯酸生产及应用
武汉烯王生物工程有限公司
原材料
发酵所采用的原料主要为葡萄糖、蛋白陈、酵母粉和花生粉,原料的质量标准为通用发酵用(药用)标准,实验表明,原材料的产地和质量对发酵有较大影响。

原材料的确定除了其化验指标外,摇瓶实验结果是极为重要的依据。

生产工艺
AA高产菌经三级发酵罐放大培养(IT一6T一SOT),总发酵周期为8一9天,发酵在好氧条件下进行,通风量在不同时期有所不同,在对数生长期应保持足够的通风量,后期AA的积累过程中则应适当降低通风量,以提高AA含量及菌体含油量,减少AA的氧化分解。

温度的控制对AA的产生有着重要意义,一般来说,较高的温度有利于菌体的生长,但不利于菌油的积累和AA含量的提高;而较低的温度是提高AA产率的重要条件,但温度过低不利于菌体繁殖,从而降低AA的总收率。

故一般采取分步控制的方法,即在前期以较高温度尽快产生大量菌体,期
降温以利于AA的积累,从而得到较高的生物量和AA含量。

在三级培养中,前二级主要是了扩大生物量,其AA含量及含油量等为非控制指标,但进人主发酵的菌体的AA含量对主发酵的发酵控制有一定影响。

AA高产菌经三级发酵罐放大培养(IT一6T‘50T),总发酵周期为8一9天,发酵在好氧条件下进行,通风量在不同时期有所不同,在对数生长期应保持足够的通风量,后期AA的积累过程中则应适当降低通风量,以提高AA含量及菌体含油量,减少AA的氧化分解。

温度的控制对AA的产生有着重要意义,一般来说,较高的温度有利于菌体的生长但不利于菌油的积累和AA含量的提高;而较低的温度是提高AA产率的重要条件,但温度过低不利于菌体繁殖,从而降低AA的总收率。

故一般采取分步控制的方法,即在前期以较高温度尽快产生大量菌体,后期降温以利于AA的积累,从而得到较高的生物量和AA含量。

在三级培养中,前二级主要是为了扩大生物量,其AA含量及含油量等为非控制指标,但进入主发酵的菌体的AA含量对主发酵的发酵控制有一定的影响。

培养基的碳氮比是影响AA产率的关键因素,氮源促进菌体的生长,发酵液中氮源的量应刚好满足菌体繁殖所需,在达到一定的菌体量后,应使发酵液中的氮源处于较低的水平,同时维持适当含量的碳源(葡萄糖),作为脂肪酸合成的原料,以提高菌体含油量,因此,在主发酵中必须进行碳源的流加补充。

菌体的含油量应控制在合适的水平(约30%干重),含油量过低将使总的AA收率下降,但过高的含油量会降低油脂中AA的含量,不易获得高含量的AA油脂,AA的总收率也会较低。

菌体发酵成熟后,经板框过滤、菌体洗涤,滤饼进行挤压造粒经流化床低温干燥,得到含水量8%左右的干菌体;干菌体经过溶剂浸提得到菌油,菌油中AA含量在45%以上,过氧化值不大于4Omeq瓜g,酸价不大于7,为合格粗油。

粗油需经过油脂精炼工艺,以降低油脂的色泽及过氧化值、酸价等指标,脱去不良气味,得到成品AA油脂。

成品AA油脂的质量指标如下表:。