酸解后色氨酸破坏

蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸,实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6mol／I盐酸溶液中将蛋白质在110℃加热大约20h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。

酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L—氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。

酸解后色氨酸破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺基，基本也算破坏了,碱水解不破坏色氨酸，其他氨基酸基本完了。

一般的酸水解是用限制水解时间，减低温度，和控制酸的强度来进行的，稀酸条件下，肽链中的天冬氨酸羧基端比较容易断裂，浓酸条件下，含有羟基氨基酸的氨基端比较容易断裂，

酸法水解：(通常以5-10倍的20%HCl煮沸回流16h-20h，或加压于120摄氏度水解12h,可将蛋白质水解成氨基酸）优点：水解彻底，水解的最终产物是L-氨基酸，没有旋光异构体的产生。缺点：营养价值较高的色氨酸几乎全部被破环，而与含醛基的化合物（如糖）作用生成一种黑色物质，称为腐黑质，因此水解液呈黑色。此外，含羟基的丝氨酸、苏氨酸、洛氨酸也有部分被破坏。此法常用于蛋白质的分析与制备。

碱法水解：（可用6摩尔每升NaOH或4摩尔每升氢氧化钡煮沸6小时即可完全水解得到氨基酸。优点：色氨酸不被破坏，水解液清亮。缺点：水解产生的氨基酸发生旋光异构作用，产物有D-型和L-型两类氨基酸。D-型氨基酸不能被人体分解利用，因而营养价值减半；此外，丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、胱氨酸等大部分被破坏，因此碱水解法一般很少使用。

蛋白酶法水解，优点：条件温和，常温（36-60摄氏度)\常压和PH值在2-8时，氨基酸完全不被破坏，不发生旋光异构现象。缺点：水解不彻底，中间产物较多。根据水解的程度分（蛋白质--膘--胨--多肽--二肽--氨基酸）蛋白质煮沸时可凝固，而膘、胨、肽均不能：蛋白质和膘可被饱和的硫酸铵和硫酸锌沉淀，而胨以下的产物均不能；胨可被磷钨酸等复盐沉淀，而肽类及氨基酸均不能，借此可将产物分开。

柱前衍生相当是样品处理后进色谱柱，柱后衍生是样品经色谱柱分离后进行反应

简单的说，当检测物质不容易被检测时，如无紫外吸收等，可以将其进行处理，如加上生色团等，生成可被检测的物质。

柱前衍生法和柱后衍生法各有其优缺点。柱前衍生法的优点是：相对自由地选择反应条件；不存在反应动力学的限制；衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰；容易允许多步反应的进行；有较多的衍生化试剂可选择；不需要复杂的仪器设备。缺点是：形成的副产物可能对色谱分离造成较大困难；在衍生化过程中，容易引入杂质或干扰峰，或使样品损失。柱后衍生法的优点有：形成副产物不重要，产物也不需要高的稳定性，只需要有好的重复性即可；被分析物可以在其原有的形式下进行分离，容易选用已有的分析方法。缺点是：需要额外的设备，对仪器要求比较高；反应器可造成峰展宽，降低分辨率；有过量的试剂会造成干扰。

有两种情况：

一是由于待测物质在HPLC条件下不能分离，比如用RP-HPLC分离氨基酸，由于氨基酸在极性流动相中解离，不能保留，所以用柱前衍生使其成为弱极性的衍生物，就可以分离了。二是由于待测物质在常用的检测器（比如：UV-VIS）上响应比较弱，用柱前衍生加上发色团，使其产生紫外吸收。不过这种情况不常见，一时想不到例子了。相应的柱后衍生倒是比较常用，比如用离子交换柱做氨基酸分析（就是经典的氨基酸分析仪）。

另外在GC上的柱前衍生类似于“一”的情况。

衍生的原理都一样，柱前衍生是在进样前样品就已经衍生完全，柱后衍生的意思就是样品先经过色谱柱的分离，出了色谱柱后再衍生，最后进入检测器，所以柱后衍生要有一个衍生装置来输送衍生试剂溶液，据说柱后衍生的精密度比较好，但也多了一个装置，多花点钱。我认为柱前的衍生侧重于分离，柱后衍生侧重于检测

1. 紫外衍生化反应

液相色谱使用最多的是紫外检测器，为了使一些没有紫外吸收或紫外吸收很弱的化合物能被紫外检测器检测，往往是通过衍生化反应在这些化合物的分子中引入有强紫外吸收的基团，这些衍生物可被紫外检测器检测。

大多数紫外衍生反应来自经典的光度分析和有机定量分析，新的衍生化反应和衍生化试剂是随液相色谱发展而发展，这些反应的原理都来自有机合成，所以就要求操作者对有机合成有所了解。但是，由于柱前衍生化是为色谱分析准备样品，处理样品的量（mg 级）和所用的反应器皿（小型和微型）又不同于常量的有机合成，而是类似于近年来发展的微量有机合成。紫外衍生化反应要选择反应产率高，重复性好的反应。过量试剂和试剂中的杂质如果干扰下一步的色谱分离和检测，则在色谱进样前要进行纯化分离。还要注意反应介质对紫外吸收的影响。