2020秋季 基因工程 第9章 基因工程抗体 第2部分
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 最早由加州湾区的Cell Genesys公司开发，其于1996年 将XenoMouse技术平台分离出来成立了Abgenix公司。
• Abgenix是硅谷最成功的故事之一。Abgenix公司成立 于1996年，于1998年成功上市。
• 在2005年底，Amgen公司以22亿美元的价格收购了 Abgenix。
• XenoMouse® • HuMAb® Mouse • KM™ mouse • Kymouse™
转基因小鼠原理：
• 把小鼠编码Ig基因（重链、Hale Waihona Puke Baidu 链）的基因剔除。
• 制备表达人的Ig重链、轻链的 转基因小鼠。
• 当用抗原免疫后，小鼠可产生 完全人源抗体。
鼠胚胎干细胞 囊胚
XenoMouse®
• 为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，克隆出鼠源抗体中与抗 原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。 由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为 CDR移植抗体（CDR grafted antibody）或人源化抗体 (humanized antibody) 。这种抗体在人体内免疫性大为降低。
• 基于XenoMouse开发的第一个单抗药物是Abgenix与 Amgen 共 同 开 发 的 抗 EGFR 单 抗 panitumumab （Vectibix），FDA于2006年批准Panitumumab上市， 其是第一个基于转基因小鼠的全人源性单抗药物，也是 批准得的第一个全人源单抗药物，而来自噬菌体呈现抗 体库技术的全人源单抗药物Humira于2008年由FDA批 准上市。
人源化方案一：鼠单抗人源化
• 杂交瘤单抗为鼠源性，应用于人体 产生人抗鼠抗体及毒副作用→对鼠 源性的单抗进行人源化改造。
①恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 (Chimeric Antibody)
②可变区人源化——人源化抗体 （humanized antibody or Reshaped Antibody ）
骨架区（FR）的某些氨基酸可与CDR有相互作用或影响 分子构象，简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的
亲和力。→使用与鼠FR较大同源性人FR
三、全人抗体的实现途径：转基因小鼠
• 为了开发全人源的抗体药物，在上世纪90年代，随着转 基因基因的发展，多个生物技术公司成功构建了转入人 抗体基因的小鼠。如，
生物制药专业《基因工程，Genetic Engineering》教学计划
第一章 基因工程的研究内容和应用（2学时）第1周 第二章 基因工程的工具酶（4学时）第2，3周 第三章 基因工程的载体系统（4学时）第4，5周 第四章 克隆基因的原理与方法（2学时）第6周 第五章 重组DNA分子的构建、导入受体细胞及筛选 （2学时）第7周 第六章 大肠杆菌基因工程 （4学时）第8，9周 第七讲 真核生物基因工程 （6学时）第10，11，12周 第八章 转基因动物与转基因植物 （4学时）第13，14周 第九章 基因工程抗体（4学时）第15，16周
共转染细胞
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠VL
人CL 人CH
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
人 鼠 嵌 合 抗 体
人-鼠嵌合抗体
MabThera（美罗华，通用名：rituximab，利妥昔单抗）： for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
二、人源化抗体（CDR移植抗体）
基因工程抗体的基本原理
1. 从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA 2. PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因 3. 构建表达载体 4. 在宿主细胞中表达并折叠 5. 筛选出高表达细胞株 6. 亲和层折等手段纯化抗体片段
• 单克隆抗体药来自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗体在给病人 服用过程中常常遇到一些问题:
人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
PCR 鼠抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
人抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
嵌合轻链
嵌合重链
IgG
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
→ 人体把这些单抗药当作异体蛋白，会产生免疫排斥； → 免疫排斥使单抗药很快从病人体内被清除掉，大大降低了它
们应有的疗效； → 少数病例中，鼠源抗体会引起严重的过敏反应，甚至导致了
个别病人的死亡。
• 如何解决这个问题？
• 单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床， 经历了一段曲折 的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
The fact that nearly half of all US Food and Drug Administration (FDA)approved therapeutic mAbs are humanized antibodies testifies to their safety and tolerance by humans.
FV regions CDRs from from mouse mouse
Mouse antibody
Chimeric antibody
(66%)
Humanized Fully antibody human (90%) antibody
(100%)
方案二：全人源单抗 （Fully human mAbs）
• 转基因小鼠（transgenic mice） • 人抗体展示技术（Human
antibody-display libraries） • 人B细胞永生化 • 单B细胞RT-PCR技术
一、人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
• 从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性V 区基因，并与人抗体C区基因按一定的方式重组，克隆到表达载体中构 建鼠－人嵌合的轻重链基因表达载体，再转入宿主细胞表达，经筛选 后制备成特异性的嵌合抗体。
• 鼠单抗的可变区+人抗体的恒定区 =嵌合抗体 Chimeric Antibody
• 在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起，所产生 的抗体含有70-80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少了单克隆 抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-30%的鼠源成分，在实际应用过 程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。
• Abgenix是硅谷最成功的故事之一。Abgenix公司成立 于1996年，于1998年成功上市。
• 在2005年底，Amgen公司以22亿美元的价格收购了 Abgenix。
• XenoMouse® • HuMAb® Mouse • KM™ mouse • Kymouse™
转基因小鼠原理：
• 把小鼠编码Ig基因（重链、Hale Waihona Puke Baidu 链）的基因剔除。
• 制备表达人的Ig重链、轻链的 转基因小鼠。
• 当用抗原免疫后，小鼠可产生 完全人源抗体。
鼠胚胎干细胞 囊胚
XenoMouse®
• 为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，克隆出鼠源抗体中与抗 原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。 由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为 CDR移植抗体（CDR grafted antibody）或人源化抗体 (humanized antibody) 。这种抗体在人体内免疫性大为降低。
• 基于XenoMouse开发的第一个单抗药物是Abgenix与 Amgen 共 同 开 发 的 抗 EGFR 单 抗 panitumumab （Vectibix），FDA于2006年批准Panitumumab上市， 其是第一个基于转基因小鼠的全人源性单抗药物，也是 批准得的第一个全人源单抗药物，而来自噬菌体呈现抗 体库技术的全人源单抗药物Humira于2008年由FDA批 准上市。
人源化方案一：鼠单抗人源化
• 杂交瘤单抗为鼠源性，应用于人体 产生人抗鼠抗体及毒副作用→对鼠 源性的单抗进行人源化改造。
①恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 (Chimeric Antibody)
②可变区人源化——人源化抗体 （humanized antibody or Reshaped Antibody ）
骨架区（FR）的某些氨基酸可与CDR有相互作用或影响 分子构象，简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的
亲和力。→使用与鼠FR较大同源性人FR
三、全人抗体的实现途径：转基因小鼠
• 为了开发全人源的抗体药物，在上世纪90年代，随着转 基因基因的发展，多个生物技术公司成功构建了转入人 抗体基因的小鼠。如，
生物制药专业《基因工程，Genetic Engineering》教学计划
第一章 基因工程的研究内容和应用（2学时）第1周 第二章 基因工程的工具酶（4学时）第2，3周 第三章 基因工程的载体系统（4学时）第4，5周 第四章 克隆基因的原理与方法（2学时）第6周 第五章 重组DNA分子的构建、导入受体细胞及筛选 （2学时）第7周 第六章 大肠杆菌基因工程 （4学时）第8，9周 第七讲 真核生物基因工程 （6学时）第10，11，12周 第八章 转基因动物与转基因植物 （4学时）第13，14周 第九章 基因工程抗体（4学时）第15，16周
共转染细胞
抗体分泌细胞
鼠VH
鼠VL
人CL 人CH
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
人 鼠 嵌 合 抗 体
人-鼠嵌合抗体
MabThera（美罗华，通用名：rituximab，利妥昔单抗）： for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
二、人源化抗体（CDR移植抗体）
基因工程抗体的基本原理
1. 从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA 2. PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因 3. 构建表达载体 4. 在宿主细胞中表达并折叠 5. 筛选出高表达细胞株 6. 亲和层折等手段纯化抗体片段
• 单克隆抗体药来自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗体在给病人 服用过程中常常遇到一些问题:
人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
PCR 鼠抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
人抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
嵌合轻链
嵌合重链
IgG
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
→ 人体把这些单抗药当作异体蛋白，会产生免疫排斥； → 免疫排斥使单抗药很快从病人体内被清除掉，大大降低了它
们应有的疗效； → 少数病例中，鼠源抗体会引起严重的过敏反应，甚至导致了
个别病人的死亡。
• 如何解决这个问题？
• 单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床， 经历了一段曲折 的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
The fact that nearly half of all US Food and Drug Administration (FDA)approved therapeutic mAbs are humanized antibodies testifies to their safety and tolerance by humans.
FV regions CDRs from from mouse mouse
Mouse antibody
Chimeric antibody
(66%)
Humanized Fully antibody human (90%) antibody
(100%)
方案二：全人源单抗 （Fully human mAbs）
• 转基因小鼠（transgenic mice） • 人抗体展示技术（Human
antibody-display libraries） • 人B细胞永生化 • 单B细胞RT-PCR技术
一、人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
• 从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性V 区基因，并与人抗体C区基因按一定的方式重组，克隆到表达载体中构 建鼠－人嵌合的轻重链基因表达载体，再转入宿主细胞表达，经筛选 后制备成特异性的嵌合抗体。
• 鼠单抗的可变区+人抗体的恒定区 =嵌合抗体 Chimeric Antibody
• 在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起，所产生 的抗体含有70-80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少了单克隆 抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-30%的鼠源成分，在实际应用过 程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。