2020秋季 基因工程 第9章 基因工程抗体 第2部分
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释基因工程抗体是利用基因工程技术对人工合成抗体进行定制和改造的一种生物工程技术。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，它可以识别和结合体内外的异物，从而协助机体进行免疫防御。
基因工程抗体通过选择性克隆和定制抗体基因序列，可以产生特异性更强、稳定性更好、生产成本更低的抗体。
基因工程抗体包括以下几种：1. 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）：基因工程技术可以使得单个淋巴细胞克隆产生大量相同的抗体，从而获得具有高度特异性的单克隆抗体。
这种抗体广泛应用于医学诊断、疾病治疗和科学研究等领域。
2. 重链抗体（Recombinant Antibodies）：重链抗体是利用基因工程技术使抗体重链蛋白的编码基因与其他蛋白的编码基因相融合，生成融合抗体。
这种重链抗体可以通过改变其结构和功能来提高其生物活性和稳定性。
3. 组合抗体（Bispecific Antibodies）：基因工程技术可以将两种不同的单克隆抗体的编码基因进行融合，产生具有双特异性的组合抗体。
这种抗体可以同时结合两个不同的目标分子，从而实现更强的疗效和更多样化的应用。
4. 人源化抗体（Humanized Antibodies）：由于小鼠源抗体和人类抗体在体内效价和安全性方面存在差异，基因工程技术可以通过改造抗体的基因序列，使得抗体具有更接近人类抗体的结构和功能。
这种人源化抗体更适合在治疗和预防疾病时使用。
基因工程抗体的应用广泛，其中的一些常见应用包括：1. 肿瘤治疗：通过基因工程技术，可以定制针对特定肿瘤抗原的单克隆抗体，用于治疗癌症。
2. 自身免疫性疾病治疗：基因工程抗体可以定制具有特异性和高效的抗体，用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。
3. 传染病治疗：通过基因工程技术，可以改造抗体的结构和功能，用于治疗传染病，如艾滋病、流感和乙肝等。
4. 分子诊断：基因工程抗体可以用于检测和诊断疾病，如癌症标志物的检测和感染性病原体的检测等。
基因工程抗体
基因工程抗体综述前言：抗体的实验研究始于上世纪末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉杆菌的培养上清分离到可溶性毒素，后者注入动物内可引起典型的白喉发病症状。
Von Behring及同事Kitasato(北里)报告，以白喉或破伤风毒素免疫动物后，其血清中可产生一种中和毒素的物质，该物质能阻止毒素引发的疾病，来自实验动物的抗血清用于感染的患儿，获得明显的治疗效果，尤其是在发病的早期。
于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin)，随后引入抗体一词，泛指抗毒素一类的物质，而将引起相应抗体产生的物质称为抗原（antigen）。
1896年Gruber和Durham发现了凝集素。
1897年Draus发现可与相应抗原形成沉淀反应的抗体，称为沉淀素。
于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。
直至本世纪30年代，“抗体”一词才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动速度最慢的血清组分，称为丙种球蛋白（gammaglobulin）。
免疫后的抗血清的电泳图形中，gamma球蛋白明显升高，抗血清经相应抗原吸收后再电泳，其gamma球蛋白又恢复到正常血清图形相同。
在之后相当长的一段时期内，人们曾将抗体与gamma球蛋白作为同义词相互用。
但事实上，具有抗体活性的球蛋白并不都泳动至gamma组分，反之在gamma组分的球蛋白并不都具有抗体活性。
在1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin），由此可见，抗体是一个生物学和功能的概念，可理解为能与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白，免疫球蛋白则是一个结构概念，除抗体外，它尚包括正常个体中天然存在的免疫球蛋白及病理情况下（如骨髓瘤，巨球蛋白血症及冷球蛋白血症等）患者血清中的免疫球蛋白及其亚单位等，因此，抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性，至少目前尚不了解这此天然的或病理的球蛋白的免疫功能。
《基因工程抗体》PPT课件
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行微 调即更换某个位点上的氨基酸。
理想的抗体药物的性质
高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排 斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准
抗体治疗存在的问题及对策
问题
对策
异源蛋白导致产生抗抗体，• 抗体人源化 影响靶向性和效果
2 开创人类抗体基因组学的研究 评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在
PNAS 2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会
未来单抗开发的完美方案
从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体 全人抗体挑战靶分子的筛选 开发未知抗原的治疗用抗体
已批准上市的单抗
适用病症 移植排斥 大肠癌 冠心病
AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白 质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列 中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构 象和免疫原性的新型抗体。
今后抗体药物发展的方向
寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物
最理想的单克隆抗体 100%人源 人类免疫系统自然产生
功能：具有较好的抗原结合能 力，且分子量小、穿透力强、免 疫原性低等特性。可与其他效应 分子构建成多种具有新功能的抗 体分子，是构建免疫毒素和双特 异抗体等的理想而基本的元件 。
基因工程抗体片段课件
• 3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经 性疾病和脑肿瘤的新药
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基因工程抗体片段
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VHH稳定的机制
• 传统抗体的VH 和VL 区通过疏水作用形成稳 定结构，而重链抗体则通过选择性突变VHH 胚系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲 水性表面，可在缺失VL 条件下保持结构稳定；
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VHH 胚系基因序列特性
• 1）对骆驼VHH 胚系基因序列分析发现， VHH 与人源VH 基因Ⅲ家族序列具有较 高的同源性；
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• 2）比较人类和骆驼IgG 重链可变区发现，在框架
FR2 区的氨基酸组成中，有4 个氨基酸显著不同。这 4 个氨基酸在VH 和VHH 中分别是V42F 或V42Y， G49E，L50R 和W52G，，
• 是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段；
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ScFV的功能
• 1）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部 位, 如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面 的腔囊等；
• 2）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点： 多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具 有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或 药物等, 用于影像和临床治疗；
基因工程抗体片段之前奏曲 ———小分子抗体
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第一代小分子抗体———抗原结合片段 ( fragment with antigen binding，Fab重链的VH + CH1构成， 其大小为完整抗体的1/3,约55KD；
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cover illustration Antibody single-chain fragment stability-engineered by point mutations (A) and by a CDR-graft to the most stable human consensus framework (B). Insufficient thermodynamic stability can limit the use of particular antibody fragments as targeting moieties in therapeutic constructs, such as e.g. immunotoxins or immunoliposomes. This limitation can be overcome by a graft of the antigen combining site to a more stable antibody framework. However, such grafts sometimes fail to reach the superior stability of the acceptor framework. Comparison with the stabilization obtained with a set of designed point mutations shows that this is not always due to destabilizing interactions within the complementary determining regions, but to subtle structural differences between different classes of antibody frameworks that introduce strain in CDR grafts to divergent frameworks. For further details please see Kügler et al. (pp.135–148) and Honegger et al. (pp. 121–134).
《基因工程抗体》PPT课件
（三）单链抗体（single-chain antibody
） • 又称FV分子。
• 目的：基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单链抗体 蛋白。
• 本质：是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。此外肽 连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。
优点
• 这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单 克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性 杀伤；能进入实体瘤周围的微循理：可将抗体分子的部分片段（如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如 毒素），就可创造出一些Ig相关分子
• 催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在 的高效催化剂，对生物学、化学和医药等多种学科有重要的理论意义和实用价值。
（二）催化抗体的制备
• 催化抗体（抗体酶）技术是化学和免疫生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物 ，是将抗体的极其多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新 方法，故而显示出较高的理论和实用价值，成为酶工程领域中的研究热点。
2. 导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链 3. 再将小鼠杂交瘤细胞的Ig VL基因与人的CL基因相连 4. 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 5. 筛选分泌鼠－人嵌合抗体的骨髓瘤细胞
所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分 泌的抗体特异性和亲和力相同，但减 少了抗体中的鼠源性成分
（二）重构抗体（reshaping anti body）
基因工程抗体
（genetic engineering antibody）
• 随着DNA重组技术以及其它分子生物学技术的发展，人们利用基因工程技术来制备抗体 分子，这种抗体分子称为基因工程抗体，这是分子水平的抗体。
基因工程抗体
（三）双链抗体（diabody)及三链抗体 （triabody)
通过缩短scFv的接头，使两个单链抗体分子间互 相形成VH和VL配对，以非共价键结合在一起形成二 聚体，从而构建出的双价小分子抗体。
如果将两个不同特异性的单链抗体分子的VH和VL 交叉组合构建两个杂合的单链抗体基因，重组到同 一表达载体中，则可在大肠杆菌中表达出双特异双 链抗体。
• 细胞内抗体的应用 表型敲除：在细胞内表达特定抗体分子阻断某 内源蛋白的活性，可用研究靶蛋白的生物学功 能。 基因治疗：通过细胞内抗体对某些蛋白功能的 干扰也可达到基因治疗的目的，如利用癌基因 的细胞内抗体为抗肿瘤的基因治疗提供了一个 新的途径。 目前抗HIV gp120（外壳蛋白）的Fab段和抗Tat （调节蛋白）的scFv已进入临床试用。
• 缺点 有时ScFv比其亲本抗体的亲和力明显降
低，并常常显示聚集倾向，尤其在37度
时稳定性较差，这与轻重链可变区由作
用力较弱的非共价键连接在一起有关。
四、dsFv
• 在VH和VL之间导入了一个链间二硫键，构 建了disulfide-stabilized Fv, dsFv。 二硫键可设计在CDR也可在骨架区。由于 CDR涉及抗原结合，需了解Fv段的立体结构 才能确定正确的引入二硫键的部位。在远 离CDR的结构较保守的骨架区设计二硫键， 具备通用性。
创新的癌症免疫疗法——BiTE抗体技。
• 今年9月，安进向FDA提交首个BiTE疗法blinatumomab上市 申请。
• FDA日前表示，已接受审查BiTE免疫疗法blinatumomab生物
制品许可申请（BLA），同时已授予该药优先审查资格。 • 此前，FDA和EMA均已授予该药孤儿药地位，FDA还授予该 药突破性疗法认定。
基因工程抗体
基因工程抗体你的单抗杂交瘤细胞株产不出抗体，不妨试试基因工程抗体基因工程抗体的概念比较广本文仅仅讨论怎么从杂交瘤细胞株开始做基因工程抗体主要解决如下几个问题：1. 知识产权保护的需要，给细胞株建立指纹身份；2. 更容易发文章；3. 序列比细胞株更容易保存；4. 对于不容易从腹水或者培养制备抗体的细胞株换个思路5. 人源化抗体的需求6. 嵌合抗体潜在需要从杂交瘤细胞株做单克隆抗体，主要解决分三大步骤：1. 杂交瘤细胞株测序测序的方法主要有两种，1)兼并引物设计（degenerate primer）分别扩增抗体重连和轻链的可变区2)RACE法，RACE即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends),是一种基于逆转录PCR从样本中快速扩增cDNA的5′端及3'端的技术方法1）更加的节约成本，便捷高效；但是很多的实验室不掌握核心的兼并引物设计方法，只能选择RACE方法。
2. 载体构建分别构建重链和轻链的表达质粒，表达载体的选择和元件优化组合尤为重要，除了大家认为密码子优化问题，还有载体的信号肽选择尤为重要，这个决定抗体的表达水平，一般优先选择V5信号肽，当抗体产量不高的时候也可以试试其他的信号肽，筛选最优；当然载体的抗体的骨架选择也是需要注意的。
3. 共转染哺乳动物细胞表达抗体的表达一般选用HKE293或者CHO细胞系，好用的细胞系一般都是商业化公司压箱底至宝，不会轻易流出，其配套的转染试剂和培养基也是经过特殊优化的，培养基和转染试剂是可以公开出售的。
进行以上实验，必须要1.2.0*10^6以上的杂交瘤细胞，越纯越好；杂交瘤细胞株测序的难点在于基于PCR的引物对的设计，很多实验室没有这个技术，按照文献发表的序列重复，往往也效果不好；这个时候可以委托专业化公司帮忙。
基因工程表达抗体的益处：长期做单抗的实验室都知道，经常遇到杂交瘤细胞株产生抗体能力越来越弱或者抗体效价越来越低，主要原因可能是抗体基因发生突变，因此早期测序留住抗体基因尤为重要，对于规模化生产单抗的均一性更为重要。
基因工程抗体和抗体工程
2023-10-30contents •基因工程抗体概述•基因工程抗体技术•抗体工程技术•基因工程抗体和抗体工程的应用•未来展望与挑战目录01基因工程抗体概述基因工程抗体是指通过基因工程技术对抗体基因进行改造或合成，以产生具有特定性能的抗体分子。
基因工程抗体是通过操作DNA分子层面，根据需求对抗体基因进行各种形式的改造，如插入、敲除或突变等，以获得具有特定性能或去除不良特性的抗体。
基因工程抗体的定义基因工程抗体的种类将鼠源性抗体的人源化改造，使其具有人抗体的亲和性和特异性，同时降低鼠源性抗体的免疫原性。
人源化抗体单克隆抗体双特异性抗体突变体抗体通过杂交瘤技术，将鼠源性的B细胞和骨髓瘤细胞融合，产生的杂交瘤细胞能产生单一抗体的克隆。
具有识别两种不同抗原表位的抗体，通常用于肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病的治疗。
通过基因突变技术，改造抗体分子的结合位点，以获得更强的亲和力、更高的稳定性或降低免疫原性。
基因工程抗体可以用于肿瘤免疫治疗，如靶向肿瘤细胞的抗体-药物偶联物(ADC)，通过将细胞毒性药物偶联到抗体上，实现定向杀伤肿瘤细胞。
肿瘤免疫治疗基因工程抗体可以用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，通过抑制或调节免疫反应达到治疗目的。
自身免疫性疾病治疗基因工程抗体可以作为疫苗的一部分，通过刺激机体产生特异性抗体来增强免疫力。
疫苗开发基因工程抗体的应用02基因工程抗体技术从免疫原刺激的B细胞中提取抗体基因，包括重链和轻链可变区基因。
抗体基因的获取将抗体基因与适当的载体连接，构建成表达载体。
载体构建将表达载体导入合适的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞系。
转化宿主细胞在宿主细胞中表达抗体，通常以融合蛋白的形式存在。
抗体表达抗体基因的克隆和表达抗体库的建立和筛选抗体筛选通过亲和力、特异性等指标筛选出高亲和力和高特异性的抗体。
抗体库的建立通过PCR扩增抗体基因，构建成多样性抗体库。
B细胞克隆从免疫动物的脾脏或淋巴结中提取B细胞，并克隆化。
基因工程抗体和抗体工程PPT课件
第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片 段与毒素的A链或与A链相似的单链核 糖体失活蛋白的结合物。因避免了第 一代免疫毒素的非特异性，故能在体 内有一定的抗肿瘤作用。
第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因 克隆方法改造毒素基因和小分子抗体 基因重组表达。特异性好、稳定性强、 渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。
3.间 质 性 肺 炎 以肺间 质炎症 为主， 病变累 及支气 管壁及 其周围 组织， 有肺泡 壁增生 及间质 水肿。 可由细 菌、支 原体、 衣原体 、病毒 或卡氏 肺囊虫 等引起 。 病因 学分类 1.细 菌 性 肺 炎 如肺炎 链球菌 （即肺 炎球菌 ）、金 黄色葡 萄球菌 、甲型 溶血性 链球菌 、肺炎 克雷白 杆菌、 流感嗜 血杆菌 、铜绿 假单胞 菌、埃 希大肠 杆菌、 绿脓杆 菌等。 2.非 典 型 病 原 体所致 的肺炎 如军团 菌、支 原体和 衣原体 等。
③小分子抗体易到达肿瘤部位， 可显著提高N/NT值。
④抗体在肿瘤部位可保留6～9日 ⑤能观擦抗体在血中的半衰期和
可能出现的不良反应。
放射免疫显像定位技术
将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基 三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成 Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体 内组织相结合。由于抗体分子量大， 需3天完成。3天后注入放射性核素In113M（半衰期100m），因DTPA是重 金属离子络合剂，所以In-113M可以结 合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。 这一过程在2小时内可完成。
④测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂
⑤甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊 断试剂
⑥癌胚抗原（CEA）的酶标抗体 诊断试剂
⒊放射免疫用抗体诊断试剂
放射免疫技术是将放射性核素 分析的高度灵敏性与抗原抗体 反应的特异性结合起来建立的 检测技术。
基因工程抗体概述和基本技术
基因工程抗体概述和基本技术(Genetic Engineering Antibody)一、概述以生物高技术为手段，将动物淋巴细胞产生的抗体基因，人为地使其在非淋巴细胞中表达，所产生的抗体称基因工程抗体。
产生抗体的基因工程是建立在单克隆抗体(McAb)技术之上的，如果说后者是生物科学的一场革命，那么抗体的基因工程技术无疑是这场革命的拓宽和延续。
1975年，Khler和Milstein等创立的B淋巴细胞杂交瘤技术给抗体技术的深入研究及应用带来了突破，单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防及基础理论研究的新型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，尤其是McAb或“McAb复合物”对临床某些疾病如肿瘤的治疗作用更引人注意。
将McAb与化疗药物、毒素或同位素等连接后，借助McAb的特异性识别，可有效地将治疗性药物运送到靶细胞，这种称为魔弹(magic bullets)的导向药物疗法的出现，曾令人们兴奋不已，以为找到了攻克癌症的尖端武器。
尽管这一技术有许多不可比拟的优点，随着研究的深入，也暴露出许多问题，其中最主要的就是难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，致使用于临床治疗的McAb绝大多数都来源于小鼠和大鼠。
由于人和鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用鼠源McAb，会被作为外源性蛋白抗原而产生人抗鼠抗体(human anti-murine antibodies, HAMA)，这种抗体会被迅速清除，如由静脉注入人血液中的小鼠单抗，会妨碍小鼠McAb与抗原或靶细胞的结合，从而降低McAb的治疗效应，更为重要的是HAMA可在人体内与小鼠McAb结合，可产生类似血清病的超敏反应，因而限制了鼠源McAb在临床上的反复使用。
最好的办法是应用人源性单抗。
但人-人杂交瘤技术尚未出现重大的突破，存在着建株困难、Ig产量太低、稳定性和亲和力差，以及本身还分泌一些杂蛋白等问题。
基因工程抗体技术依赖于两个基础：一是抗体的结构功能关系以及抗体多样性的遗传机制，二是分子生物学技术进展，特别是PCR技术，为基因片段的大量扩增提供了简单有效的途径。
基因工程抗体
由一个仅识别一种抗原表位的B 细胞克隆产生的同源抗体，为单克隆抗体（McAb）。
其理化性状高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，有效抗体含量高，无效蛋白含量少，易于实验标准化和大量制备。
单克隆抗体在医学领域中有广泛的应用。
基因工程抗体(genetic engineering antibody)又称重组抗体，在充分认识Ig(immunoglobulin)的基因结构和功能基础上，应用DNA 重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对编码Ig分子基因进行切割、拼接与修饰等，并导入受体细胞，使之表达出新型抗体分子。
该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，减少或去除了无关结构，更接近人的Ig，第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特征。
当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。
融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybid cell)，包括B 淋巴细胞杂交细胞和T淋巴细胞杂交细胞。
一、B淋巴细胞杂交瘤技术该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb 的杂交瘤细胞。
其原理如下：（一）细胞的选择与融合融合细胞一方为经过抗原免疫的B 细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞；另一方则是具有永生性的肿瘤细胞，选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
浓度为40％(W／V)的聚乙二醇PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂。
（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。
经融合过程后细胞将有多种形式出现，须进行特别的筛选得到融合的脾细胞与瘤细胞。
HAT培养基应用原理：细胞的DNA合成一般有两条途径。
第九章+基因工程共41页
基因工程(genetic engineering）是指 采用人工方法将不同来源的DNA进行重 组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中 进行增殖或表达的过程。
重组DNA技术 重组DNA技术又称为基因工程（genetic
engineBiblioteka ring）或分子克隆(molecular cloning)。 基因工程的操作过程主要由以 下步骤组成：
（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接
法。当载体和目的基因无法采用同一种 限制酶进行切断，无法得到相同得粘性 末端时，可采用此方法。 此法首先使用
单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端 核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核 苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如 载体上添加一段polyG，则可在目的基 因上添加一段polyC，故二者即可通过 碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连 接。
3．病毒： 常用的为SV40，通过感染方 式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增 殖。目前应用相对较少。
（二）目的基因：
目的基因的筛选和分离可采用以下方法进 行：
1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于 原核生物基因的分离，较少采用。
2．人工合成：
根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传 密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。 适应于编码小分子多肽的基因。
三、载体和目的基因的重组
即将带有切口的载体与所获得的目的 基因连接起来，得到重新组合后的 DNA分子。
（一）粘性末端连接法：当载体DNA 和目的基因均用同一种限制酶进行切 断时，二者即可带有相同的粘性末端。 如将载体与目的基因混合在一起，二 者即可通过粘性末端进行互补粘合， 再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口， 得到重组体。 较少的情况下，对产生 的平端也可直接进行连接。
基因工程抗体演示文稿
（一）嵌合抗体
从杂交瘤细胞基因组 中分离和鉴别出功能 性VL和VH基因，与 人Ig恒定区基因连接， 插入适当表达载体， 转染宿主细胞，使之 表达人-鼠嵌合抗体。
嵌合抗体优点： § 减少了鼠源性抗体的
免疫原性 § 保留了亲本抗体特异
性结合抗原的能力
（二）改型抗体
尽管嵌合抗体的免疫原性已 降低很多，但有时它仍可能 引发较强的免疫反应。为了 进一步降低抗体的鼠源成分， 发展出CDR移植技术。即把 鼠抗体的CDR序列移植到 人抗体的可变区内，所得到 的抗体称CDR移植抗体或 改型抗体，也就是人源化抗 体。
• 该项技术的优点:
§ 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; § 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; § 抗体基因筛选的范围广; § 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; § 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它
蛋白如激素、酶、随机多肽等的生产。
噬菌体抗体库技术的临床应用
一.在新型疫苗研制方面的应用
抗体名称 MDX-33
SCH55700
SB-240563 SB-240683 rhuMab-E25
IDEC-152
抗体来源 Human
临床阶段 Ⅱ
Humanized Ⅱ (IgG4)
Humanized Ⅱ Humanized Ⅱ Humanized( Ⅲ IgG1)
Primmatized Ⅰ
适用病症
移植物抗宿 主疾病
靶抗原 CD147
CD2
CD2 同种异体移 CD3 植排斥
CD3
抗体名称
抗体来源
临床阶段
ABX-CBL
BTI-322
MEDI－507 Orthoclone/ OKT3 SMAT antiCD3
基因工程抗体
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
克隆可变区基因的方细胞的mRNA中扩 增VH及VL基因。
同一抗体的两个抗原结合部分分别针对两个不同 的抗原，在结构上是双价的，而与抗原结合的功能 是单价的。
－可介导标记物与靶抗原的结合 －使某种效应分子定位于靶细胞 －可提高抗体的某些生物学效应 －减少抗体的体内非特异性分布
增强抗体效应功能
细胞内抗体（intrabody）
在抗体基因的N端或C端加入引导序列使抗体表达定 位在亚细胞部位，如胞质、线粒体、内质网或细胞核 部位。在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体称为 细胞内抗体或内抗体。
IgG2、IgG4
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
表达系统的选择
大肠杆菌、噬菌体 无糖基化功能
酵母菌 Asn-X-Ser/Thr 糖基化错误
哺乳动物细胞表达系统 最常用的表达体系
表 达 载 体 的 构 建
共转染模式和单载体转染模式
真核表达载体的要求
为保证PCR产物的准确性，应尽量采 用引导肽部分的引物。
克隆可变区基因常用的引物
克隆鼠κ轻链可变区所用的部分引物
克隆鼠重链可变区所用的部分引物
克隆可变区基因的操作流程
杂交瘤细胞
单链cDNA分离
RNA提取试剂盒
H链引导肽引物 /恒定区引物
L链引导肽引物/ 恒定区引物
制备总RNA
第一链cDNA合成试剂 盒
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
抗 原 表 位 导 向 选 择
基因工程抗体2讲课文档
隆到表达载体中构建鼠－人嵌合的轻重链基因表达载体，再转入 宿主细胞表达，经筛选后制备成特异性的嵌合抗体。
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PCR 鼠抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
人抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
嵌合轻链
嵌合重链
IgG
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人－鼠嵌合抗体
特点
完全保留鼠单抗的特异性和亲和力
降低了HAMA不良反应
一定的免疫原性，V区完全鼠源性
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现在三十四页，总共七十六页。
改型抗体
抗体分子轻、重链可变区的6个CDR 形成CDR平面直接接触抗原，决定了
抗体的特异性，骨架区只是作为支持
50KD，
为完整IgG的1/3。
应用前景： 较好的渗透性和药代动力学特征 HAMA反应存在 亲和力较低、稳定性差
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基因工程手段构建Fab抗体的原理
➢将抗体分子的重链V区和CH1功能区的cDNA与轻链完 整的cDNA序列重组并克隆到适当的表达载体中
➢在大肠杆菌等宿主细胞中表达 ➢整个制备过程包括Fab抗体基因的扩增，表达载体的构建 、表达及产物鉴定
抗体的发展
抗血清的制备：19世纪末，Behring
单克隆抗体：1975，Koehler和Milstein
Nature 1975 Aug 7;256(5517):495-7 Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.
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转基因小鼠原理：
• 把小鼠编码Ig基因（重链、轻 链）的基因剔除。
• 制备表达人的Ig重链、轻链的 转基因小鼠。
• 当用抗原免疫后，小鼠可产生 完全人源抗体。
鼠胚胎干细胞 囊胚
XenoMouse®
• 转基因小鼠（transgenic mice） • 人抗体展示技术（Human
antibody-display libraries） • 人B细胞永生化 • 单B细胞RT-PCR技术
一、人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
• 从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性V 区基因，并与人抗体C区基因按一定的方式重组，克隆到表达载体中构 建鼠－人嵌合的轻重链基因表达载体，再转入宿主细胞表达，经筛选 后制备成特异性的嵌合抗体。
人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
PCR 鼠抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
人抗体基因
VL CL
VH CH1CH2 CH3
嵌合轻链
嵌合重链
IgG
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
• 基于XenoMouse开发的第一个单抗药物是Abgenix与 Amgen 共 同 开 发 的 抗 EGFR 单 抗 panitumumab （Vectibix），FDA于2006年批准Panitumumab上市， 其是第一个基于转基因小鼠的全人源性单抗药物，也是 批准得的第一个全人源单抗药物，而来自噬菌体呈现抗 体库技术的全人源单抗药物Humira于2008年由FDA批 准上市。
骨架区（FR）的某些氨基酸可与CDR有相互作用或影响 分子构象，简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的
亲和力。→使用与鼠FR较大同源性人FR
三、全人抗体的实现途径：转基因小鼠
• 为了开发全人源的抗体药物，在上世纪90年代，随着转 基因基因的发展，多个生物技术公司成功构建了转入H
鼠VL
人CL 人CH
人-鼠嵌合抗体基因工程策略
人 鼠 嵌 合 抗 体
人-鼠嵌合抗体
MabThera（美罗华，通用名：rituximab，利妥昔单抗）： for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas
二、人源化抗体（CDR移植抗体）
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
The fact that nearly half of all US Food and Drug Administration (FDA)approved therapeutic mAbs are humanized antibodies testifies to their safety and tolerance by humans.
• 最早由加州湾区的Cell Genesys公司开发，其于1996年 将XenoMouse技术平台分离出来成立了Abgenix公司。
• Abgenix是硅谷最成功的故事之一。Abgenix公司成立 于1996年，于1998年成功上市。
• 在2005年底，Amgen公司以22亿美元的价格收购了 Abgenix。
→ 人体把这些单抗药当作异体蛋白，会产生免疫排斥； → 免疫排斥使单抗药很快从病人体内被清除掉，大大降低了它
们应有的疗效； → 少数病例中，鼠源抗体会引起严重的过敏反应，甚至导致了
个别病人的死亡。
• 如何解决这个问题？
• 单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床， 经历了一段曲折 的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。
人源化方案一：鼠单抗人源化
• 杂交瘤单抗为鼠源性，应用于人体 产生人抗鼠抗体及毒副作用→对鼠 源性的单抗进行人源化改造。
①恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 (Chimeric Antibody)
②可变区人源化——人源化抗体 （humanized antibody or Reshaped Antibody ）
• 为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，克隆出鼠源抗体中与抗 原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。 由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为 CDR移植抗体（CDR grafted antibody）或人源化抗体 (humanized antibody) 。这种抗体在人体内免疫性大为降低。
FV regions CDRs from from mouse mouse
Mouse antibody
Chimeric antibody
(66%)
Humanized Fully antibody human (90%) antibody
(100%)
方案二：全人源单抗 （Fully human mAbs）
基因工程抗体的基本原理
1. 从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA 2. PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因 3. 构建表达载体 4. 在宿主细胞中表达并折叠 5. 筛选出高表达细胞株 6. 亲和层折等手段纯化抗体片段
• 单克隆抗体药来自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗体在给病人 服用过程中常常遇到一些问题:
生物制药专业《基因工程，Genetic Engineering》教学计划
第一章 基因工程的研究内容和应用（2学时）第1周 第二章 基因工程的工具酶（4学时）第2，3周 第三章 基因工程的载体系统（4学时）第4，5周 第四章 克隆基因的原理与方法（2学时）第6周 第五章 重组DNA分子的构建、导入受体细胞及筛选 （2学时）第7周 第六章 大肠杆菌基因工程 （4学时）第8，9周 第七讲 真核生物基因工程 （6学时）第10，11，12周 第八章 转基因动物与转基因植物 （4学时）第13，14周 第九章 基因工程抗体（4学时）第15，16周
• 鼠单抗的可变区+人抗体的恒定区 =嵌合抗体 Chimeric Antibody
• 在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起，所产生 的抗体含有70-80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少了单克隆 抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-30%的鼠源成分，在实际应用过 程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。