重组人促红细胞生成素的纯化
第十八章重组人红细胞生成素生产工艺
抗体药物制备
鼠源单克隆抗体
3） 原生质体融合
取对数期骨髓瘤细胞和B淋巴细胞悬液，于离心管中以1:10混 匀，离心、去上清 在37℃下，使两者充分接触 滴加PEG后，继续震动2min 添加培养基稀释PEG，终止其作用 离心后，置于培养板中用HAT培养基进行培养
抗体药物制备
重组人红细胞生成素工艺路线的研究
大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。 家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性 较低、活性较差等问题。 在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞 生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采 用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。
第十八章 重组人红细胞生 成素生产工艺
第一节 概述 第二节 工程CHO细胞系的构建 第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制 第四节 分离纯化工艺
红细胞生成素
细胞系的构建
第二节 工程CHO细胞系的构建
18.2.1 表达载体的构建 18.2. 2 转染 18.2. 3 稳定性筛选
红细胞生成素
18.2.1 表达载体的构建
细胞系的构建
人红细胞生成素基因的克隆策略： 从基因组中克隆编码区片断，拼接成全长；或从基因中 克隆全长，在动物细胞中转录出mRNA，RT-PCR克隆全长 序列 将目标基因与载体在连接体系中连接过夜，连接酶为 Phage T4连接酶 表达载体的构建： 人红细胞生成素基因与载体进行酶切、连接、转化、大肠 杆菌中筛选、鉴定、测序、确证序列、方向无误。
红细胞生成素
18.3. 3 培养过程控制
培养过程与工艺控制
搅拌控制：接种后，搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上， 随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。 温度控制：较为严格，恒定37℃。 pH值控制：7.0-7.2,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。 溶解氧控制：在50％-80％的范围内，通入氧气、空气或 氮气的比例混合气体。 葡萄糖控制：流加补料。 代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度， 减少对细胞损害。
最新关于药品“重组人促红素”的认识
3. 市场需求分析还可以帮助企业发现新的市场机会，通过满足 消费者的新需求，获取更大的市场份额。
2. 国内外发展现状
01
1. 在国内，重组人促 红素的生产工艺已经相 对成熟，多家企业已实 现规模化生产，市场需 求持续增长。
1. 优化策略之一是提高生产 效率，通过改进生产流程、引 入先进的生产设备和技术，降 低生产成本，提高产品质量和 产量。
2. 优化策略之二是加强研发创 新，不断推出具有竞争力的新 产品，满足市场需求，提高企 业的市场份额和盈利能力。
3. 优化策略之三是提升企业管理 水平，通过实施现代企业制度、 完善内部管理制度、提高员工素 质和激励机制，提高企业的运营 效率和竞争力。
1. 蛋白纯化过程 主要包括样品准备 、粗分离、细分离 和纯度检测等步骤
1。
2. 在蛋白纯化过程
3. 蛋白纯化过程的
中，选择合适的纯化
优化可以提高蛋白质
方法和技术是关键，
的产量和纯度，为后
如亲和层析、离子交
续的实验和应用提供Biblioteka 2换层析和凝胶过滤层
3 高质量的蛋白质样品
析等。
。
3. 质量控制与检测
3. 对于不合格的产品，需要进行追溯分析，找出问题原因，
02
2. 在国际上，美国、 欧洲等地的生物制药公 司也在积极研发重组人 促红素，市场竞争激烈 。
03
3. 随着全球血液疾病 患者数量的增加，重组 人促红素的市场规模预 计将持续扩大。
3. 未来发展趋势
1. 随着科技的不断发展，未来发展趋势将更加侧重于人工智能 、大数据和云计算等前沿技术的应用。
化学制药工艺重组人红细胞生成素生产工艺
rhEPO
rhEPO的技术来源
概述
• 20世纪70年代，对人EPO氨基酸序列测定。 • 基于蛋白质序列，设计寡核苷酸探针，从人基因组中克隆
到hEPO基因。 • 1983：Amgen提交了hEPO基因序列与重组hEPO物质组成的
专利
• 分离纯化技术专利：基于天然人红细胞生成素的分离纯化 方法。
• 分析方法：形成质量控制技术
制药工艺学
Pharmaceutical Technology
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第二篇 生物技术制药工艺
第十八章 重组人红细胞生成素的生产工艺
18.1 概述 18.2 工程CHO细胞系的构建 18.3 CHO细胞培养过程与工艺控制 18.4 分离纯化工艺与质量控制
‹#1 红细胞生成素种类 18.1.2 红细胞生成素临床应用 18.1.3 红细胞生成素理化性质 18.1.4重组红细胞生成素的工艺研究
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rhEPO
概述
18.1.3 hEPO的理化性质
大 小 ： 165aa;MW34-36ku(SDS-PAGE) 、 30.4ku(超滤) 。 糖链占分子量的39%。 糖基化程度与准确性对活性影响很大 pI4.2 ～ 4.6 ， 对 热 56℃ 和 pH 变 化 （ 3 －10）相对稳定。 较耐有机溶剂，对蛋白酶敏感。
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rhEPO
概述
18.1.1 红细胞生成素的种类
1、红细胞生成素的生成与作用机理
1890：现象，低氧压下红细胞增多 1948 ： Bonsdorff 和 Jalavisto ， 提 出 红 细 胞 生 成 素 （erythropoietin，EPO）。
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rhEPO
2、天然红细胞的种类
重组人促红细胞生成素的纯化【精品-PPT】
EPO纯化历史
Miyake的七步法：纯化步骤太多,对设备及 操作要求也较高,不适合工业生产的特点
Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于 凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸 附,使得分离效果降低,成本增高,也不利于大 规模生产
疏水层析,凝胶柱层析等
三步层析法
1. 染料配基亲和层析→反相疏水层析→离 子交换层析;
尿液，血浆，胎盘浸出液 80年代后期编码人EPO基因被克隆 重组人EPO（recombinant human EPO,
rhEPO）在哺乳动物细胞中成功表达
rhEPO的应用
临床应用重组人促红细胞生成素可治疗慢 性肾衰竭合并贫血症，慢性肾功能衰竭 （CRF）贫血，骨髓增生异常综合症贫血 （Myelodys-plastic Syndrom ,MDS）， AIDS病人的伴生贫血，（非髓性）肿瘤伴 生贫血及肿瘤化疗贫血，β地中海贫血,镰刀 形贫血,早产儿贫血等.也可用于外科手术中 的自体输血、骨髓移植等。
为什么第一步先用反相色谱？
综合国外和国内文献，大多数使用的是阴 离子交换柱或亲和柱作为第一步纯化，在 这种方案里，必须先对样品进行超滤，透 析及冻干等以达到浓缩和脱盐目的。
缺点？
低效耗时
糖蛋白对机械作用力敏感，长时间超滤等 处理可能对蛋白造成不可逆损伤，丧失活 性
EPO易吸附在容器表面，处理步骤增多会引 起蛋白回收率下降
而且使用可以用于临床的柠檬酸缓冲液做 流动相，不需另作临床使用溶剂置换处理。
关于三步法的缺点
反相作为起始步骤？ 反相色谱是以高分辨率的纯化方法，将其 作为起始步骤，不能及时处理大量样品， 而且起始物质成分复杂，可能并不能达到 良好的分离效果，还有可能会影响反相介 质的再生作用。
免疫亲和层析法纯化重组人促红细胞生成素的实验研究
文章编号:1007-8738(2002)04-408-04免疫亲和层析法纯化重组人促红细胞生成素的实验研究邓瑞春1,张明伟2,白云秀2,汪劲松2,毛 宁2,章金刚3,周 勇4(1军事医学科学院毒物药物研究所生化药理室,北京100850;2北京瑞得生物技术研究所;3军事医学科学院野战输血研究所;4北京中医药大学中西医结合研究所)收稿日期:2002-03-15; 修回日期:2002-04-15作者简介:邓瑞春(1960-),女,河北遵化市人,助理研究员,博士.北京市海淀区太平路27号,T el.(010)6821171关键词:重组人红细胞生成素;单克隆抗体;免疫亲和层析;酶联免疫吸附试验中图分类号:R392.12 文献标识码:B摘 要:目的 以免疫亲和层析方法纯化重组人促红细胞生成素(rhEPO )。
方法 以rhEPO 作为抗原,免疫Balb/C 小鼠,制备抗rhEPO 单克隆抗体(mAb )。
以纯化的抗rhEPOmAb 2F12与预活化的Sepharose 4B 偶联,制成抗体亲和层析柱,纯化rhEPO 。
结果 经筛选共获得4株可分泌抗rhEPOmAb 的杂交瘤细胞株,分别为:1A8、2F12、3D4和3F10。
亲和层析纯化的rhEPO 经S DS 2PAGE 显示单一条带;2g 凝胶制备的层析柱一次层析可获得1.5mg 高纯度的rhEP O 。
利用纯化的m Ab 建立的E LIS A 法,用于检测rhEP O 的蛋白含量可达ng 水平。
结论 免疫亲和层析法纯化rhEP O 的效率高、纯度好,用纯化的mAb 建立的E LIS A 法具有灵敏度高、重复性和稳定性好等优点。
Study on purification of rhEPO by the im 2munoaffinity chromatographyDENG Rui 2chun 1,ZH ANG Ming 2wei 2,BAI Yun 2xiu 2,WANG Jin 2song 2,MAO Ning 2,ZH ANG Jin 2gang 3,ZHOU Yong41Institute of T oxicology and Pharmacology ,Academy of M ilitary Medi 2cal Sciences ;2Read &F our 2Ring Institute of Biotechn ology ;3Institute of T rans fusion Medicine ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100850;4Institute of C ombination of Chinese T raditional and Western Medicine ,Beijing University of T raditional Chinese Medicine ,Beijing 100029,ChinaK eyw ords :recombinant human erythropoietin ;m onoclonal anti 2body ;immunoaffinity chromatography ;E LIS AAbstract :Aim T o purify recombinant human erythropoietin (rhEP 2O )by immunoaffinity chromatograghy.Methods rhEPO was used as antigen to immunize Balb/c mice for preparing mAbs against rhE 2PO.Purified mAb 2F12was coupled with activited sepharose 4B to prepare the immunoaffinity chromatography columu for purification of rhEPO.R esults F our hybridoma cell lines secreting mAbs against rhEPO were obtained ,namely ,1A8、2F12、3D4and 3F10.A sin 2gle band be exhibited on S DS 2PAGE gel with a yield of 90%.By using sandwich E LIS A established with these mAbs for detection of rhEPO ,Sensitivity of the E LIS A reached ng level.Conclution rhEPO purified by immunoaffinity chromatograghy have high 2efficien g ood purify and the E LIS A are sensitiveand and stabile. 重组人促红细胞生成素(rhEPO )为一种糖蛋白,相对分子质量(M r )约为30000～39000,其主要生理作用是调节红系前体细胞分化为成熟的红细胞,进而维持外周血红细胞的水平,临床上主要用于治疗肾衰后引起的贫血。
用三步法纯化重组人促红细胞生成素
用三步法纯化重组人促红细胞生成素技术方法李 琳 邓继先 卢建申 周 江军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071【摘要】 用生物反应器培养中国仓鼠卵巢细胞2促红细胞生成素(CHO 2EPO )C2细胞株,培养上清液中重组人促红细胞生成素(rHuEPO )表达水平达2×106～3×106U/L 。
培养上清液经过三步纯化:第一步为反相色谱,可将样品体积浓缩约96.7%,其收集液经充分透析后进行第二步的DEAE 2离子交换色谱,最后进行分子筛色谱,总回收率为30%以上。
经纯化的rHuEPO 比活性为1.5×108U/g 蛋白,SDS 2PA GE 为一条带,扫描测试纯度达98%以上。
关键词 促红细胞生成素;纯化;色谱法中国图书资料分类法分类号 R392.11Purif ication of recombinant human erythropoietin to homogeneity by a rapid three 2step procedureL i L i n ,Deng Ji xian ,L u Jianshen ,Zhou JiangInstitute of Biotechnology ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100071Abstract Chinese hamster ovary 2erythropoietin (CHO 2EPO )C2cells were cultured in the packed bed bioreactor with free 2fetal bovine serum medium.Conditioned medium from the Bioreactor contained 2×106-3×106U/L of recombinant human erythropoietin (rHuEPO ).Crude rHuEPO from the con 2ditioned medium was purified by three 2step procedure to yield preparations with potency of 1.5×108U/g in 30%yield.The three steps involved :(1)reverse 2phase chromatography which made 302fold concentration ;(2)sufficient dialysis and purification with ion 2exchange chromatography ;(3)gel filtra 2tion.SDS 2PA GE result of the preparations showed a single band.Homogeneity was confirmed by UV scanning.K ey w ords erythropoietin ;purification ;chromatography 促红细胞生成素(erythropoietin ,EPO )是一种糖蛋白激素,它通过刺激红细胞前体细胞分化生成成熟红细胞以调节外周血红细胞水平。
重组人促红细胞生成素
临床上EPO不仅用于治疗肾性贫血，而且已经被应贫血的治疗8]。
尽管输血由于起效快、价格低等有利因素在临床治疗中被广泛应用，但是它也存在诸多潜在危险，如感染、输血反应，严重时甚至引起死亡。
而注射EPO则能有效地避免这些输血并发症。
1985年，人们运用重组技术[9表达了重组人红细胞生成素(rHuEPO)。
rHuEPO 生产细胞株CHO2EPO C2重组人红细胞生成素( rHuEPO) 是利用基因工程技术,将人的红细胞生成素基因转入哺乳动物细胞内,高效表达的能刺激红细胞生成的糖蛋白激素,用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗产生的贫血[122 ][1 ] Oh J H ,Ha H , Yu M R ,et al . Sequential effects of high glucose on mesangial cell TGF2β1 and fibronectin synthesis[J ] . Kidney Int ,1998 ,54 :187221878.[2 ] Border WA ,Noble N A. TGF2beta in kidney fibrosis :A target for gene therapy[J ] . Kidney Int ,1997 ,51 (5) :138821396.重组EPO(rHuEPO)由于EPO在体内的作用巨大而天然来源却十分有限(主要从贫血患者的尿中提取)，人们便开始利用基因重组的分子，它由不同的糖化体构成，各种糖化体的区别主要表现在糖基在整个分子中所占的比例不同，而这个比例也的作用极为相似，它一方面能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量；另一方面能够增强机体对氧的结合、运输和供应能力，有利于在高强度竞技时改善缺氧状态，促进肌肉中氧生成，使肌肉更有力、工作时间更长，从而增强运动能力。
长期使用rHuEPO，对运动员来说，可能会带来一时的荣誉，但给其健康带来的却是永久的危量过度增加，当血红蛋白含量超过55％时，血液粘滞度就会增高，同时血流也会变慢。
第9章重组人红细胞生成素生产工艺
AmpR NeoR
hEPO dhfr
• CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是 neo等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影 响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增 的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因 （dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（gs）。
• 研究工作中发现，GS 系统表达水平高，但细胞长 期连续培养时，生长状况不佳，而DHFR 系统表达 水平较GS 系统低，但细胞生长状况良好。
rhEPO的大规模生产方式
• （1）板瓶 • （2）转瓶，Amgen • （3）反应器
9.3 工程CHO细胞系培养工艺
• 种子细胞制备 • 反应器培养工艺 • 培养过程控制
1、种子细胞制备
• （1）液氮中冻存的细胞系37℃水浴，无菌理性。 • （2）弃上清，加适量DMEM（含10%小牛血清）。 • （3）37℃，CO2培养箱培养，连续传3代。 • （4）用胰酶消化后，制成细胞浓度约为2.5×106个/ml。用于接种。
与天然红细胞生成素相似。
• 现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模 生产。
9.2 工程CHO细胞系的构建
• 表达载体构建 • 转染 • 稳定性筛选
1、表达载体的构建
• 人红细胞生成素基因的克隆策略：
从基因组中克隆编码区片段，拼接成全长；或 从基因组中克隆全长，在动物细胞中转录出mRNA， RT-PCR克隆全长序列。
2、连续培养工艺过程
• （1）反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS，高压灭菌。 • （2）接种：排出PBS，加DMEM培养基（含10%小牛血清），接入
种子细胞。 • （3）贴壁培养：pH7.0 ，<50rpm，37℃，DO控制在50~80%。 • （4）扩增培养：80~100rpm，pH7.0，37℃
重组人促红素
【通用名称】
重组人促红素注射液(CHO细胞)
【英文名】
Recombinant Human Erythropoietin Injection(CHO Cell)
【汉语拼音】
Chongzu Ren Cuhongsu Zhusheye(CHO xibao)
【成份】
【化学名称】
基因重组人红细胞生成素。基因重组CHO细胞表达、纯化制得。
【老年用药】
高龄患者应用本品时，要注意监测血压及红细胞压积，并适当调整用药剂量与次数。
【药物相互作用】
尚不清楚。
【药物过量】
可能会导致红细胞压积过高，引起各种致命的心血管系统并发症。
【药理毒理】
1.药理：红细胞生成素是由肾脏分泌的一种活性糖蛋白，作用于骨髓中红系造血祖细胞，能促进其增殖、分化。本品能经由后期母红细胞祖细胞（CFU-E）引导出明显的刺激集落的生成效果。在高浓度下，本品亦可刺激早期母红细胞祖细胞（BFU-E）而引导出集落的形成。
2.毒理：
2.1急性毒性：对小鼠、大白鼠及狗静脉注射的LD50和对生后4天的大白鼠幼鼠注射的LD50，均在20000IU/kg以上。
2.2亚急性毒性、慢性毒性
2.2.1大白鼠 雌、雄大白鼠分别在4周、13周及52周间施行静脉注射或腹腔注射本品所做的亚急性、慢性毒性实验结果显示：4周、13周及52周间分别以本品按体重80IU/kg/天、20IU/kg/天以上 以及10IU/kg/天以上给药时主要由于本品的药理作用过剩而引起了多血症，且长期给药的结果会出现骨髓的纤维化发生。
2.过敏反应：极少数患者用药后可能出现皮疹或荨麻疹等过敏反应，包括过敏性休克，因此，初次使用本品或重新使用本品时，建议先使用少量，确定无异常反应后，再注射全量，如发现异常，应立即停药并妥善处理。
重组人红细胞生成素制剂的制备生产方法[发明专利]
![重组人红细胞生成素制剂的制备生产方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/e35a99c77375a417876f8f53.png)
专利名称：重组人红细胞生成素制剂的制备生产方法专利类型：发明专利
发明人：娄丹,徐莉萍,邹钟诚
申请号：CN98100248.X
申请日：19980119
公开号：CN1190130A
公开日：
19980812
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种大规模生产人红细胞生成素的制剂方法。
该方法包括用添加了胰岛素和转铁蛋白的营养培养基,于特定培养条件下培养携带人促红细胞生成素DNA编码序列的被转化的哺乳动物细胞,以获得该蛋白质产物的高表达。
然后对富含人红细胞生成素的收获液依次进行亲和层析、离子交换、反相高效液相及凝胶过滤纯化,以获得纯度高并具有高生物活性的人红细胞生成素。
申请人：沈阳三生制药股份有限公司
地址：110141 辽宁省沈阳市经济技术开发区十号路1甲3高军
国籍：CN
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Sephacryl S-200 色谱分析
流程：
上样体积 80ml 流速 2ml/min 流动相 20mmol/L 柠檬酸钠- 100mmol/L NaCl 缓冲液
结果：收集的rHuEPO保留时间约为45min
比活性约为1.5*108U/g蛋白；纯度 〉98%（SDSPAGE检测） 免疫原性检测：Western blot
重组人促红细胞生成素的纯化
什么是促红细胞生成素？
促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一 种促进红系造血前体细胞分化，繁殖的细 胞因子。 EPO产生于人的肾及胎儿的肝脏。
EPO的研究历史
1977年 Miyake 等人首先经过7步纯化从 在障性贫血患者尿中获得毫克量级尿EPO （urine EPO，uEPo） 尿液，血浆，胎盘浸出液 80年代后期编码人EPO基因被克隆 重组人EPO（recombinant human EPO, rhEPO）在哺乳动物细胞中成功表达
分析
分子筛，也就是凝胶层析，主要依赖分子量大小 分离蛋白质，EPO粗制品中分子量接近的蛋白质 较多，且该法上样量小，故一般不用于前期纯化 步骤。 凝胶层析除纯化分离作用外，还可起脱盐和置换 缓冲液作用。 在该方案中纯化的最后一步使用Sephacryl S-200 柱层析，在进一步分离纯化的同时，使终产品溶 液换为可直接临床使用的柠檬酸钠缓冲液。
结果： ELISA检测盒表明75mmol/L洗脱峰中含
EPO
分析
Epo的pI偏低，所以多采用阴离子交换柱层 析，尤其是DEAE离子柱层析如DEAEsephacel,DEAE-sephadex,DEAE-agarose。 离子交换柱结合量大，洗脱体积小，纯化， 浓缩倍数较高。 天然，重组EPO原始粗制品中均含有一定浓 度的盐分，直接上柱层析往往不能很好吸 附，需要预处理。
EPO理化性质
疏水性极强 酸性糖蛋白 pI 3.75~4.15 MW 30~39kD, 其中糖链约占39% 两个链内二硫键
rhEPO和天然EPO结构极为相似，仅在唾液 酸连接上有细微差别
(DavisGMetal.Biochemistry.1987:26:2633)
经等电聚焦电泳计算其pI为3.75～4.15.通 常来讲,一种蛋白质只有一个pI,但EPO的pI 并非如此,却出现较多条带,原因是EPO的糖 基化程度的微小差异而造成空间构象和分 子大小不同。
分析
相关历史：1980年Sylvia Lee Huang 报道 了使用疏水柱层析纯化uEPO，提示EPO是 一种疏水性较强的蛋白。不足：层析条件 剧烈，活性丧失多。 80年代后期，反相高压液相纯化成为趋势， 多用于离子交换柱的后续步骤。
第二步：离子交换柱
DEAE型离子交换柱
流程：
10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡 上样 20ml/min（柱结合量20mg/ml） 10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡至基线 添加NaCl入缓冲液，进行截状梯度洗脱（NaCl浓度分别为： 50，70，125mmol/L）
不同文献报道EPO的分子量有一定的差别, 其原因一是EPO为含糖量高达40%左右的糖 蛋白,糖基化程度的高低与分子量大小有关, 故SDSPAGE的染色带为一较宽的弥散带,另 外与上样量的多少也有一定的关系。
EPO纯化历史
Miyake的七步法：纯化步骤太多,对设备及 操作要求也较高,不适合工业生产的特点 Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于 凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸 附,使得分离效果降低,成本增高,也不利于大 规模生产 疏水层析,凝胶柱层析等
三步层析法
层析→离 子交换层析; 2. 染料配基亲和层析→反相疏水层析→分 子筛层析; 3. 反相疏水层析→离子交换层析→分子筛 层析.
rhEPO的应用
临床应用重组人促红细胞生成素可治疗慢 性肾衰竭合并贫血症，慢性肾功能衰竭 （CRF）贫血，骨髓增生异常综合症贫血 （Myelodys-plastic Syndrom ,MDS）， AIDS病人的伴生贫血，（非髓性）肿瘤伴 生贫血及肿瘤化疗贫血，β地中海贫血,镰刀 形贫血,早产儿贫血等.也可用于外科手术中 的自体输血、骨髓移植等。
第一步：反相色谱
C6 反相柱（2cm*2cm） （创新生物技 术公司）
流程：
上样 50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/ml介质） 去离子水平衡至检测基线 10%~80%乙醇胍线性梯度洗脱 检测并收集含EPO主峰 ELISA测定
结果：60%乙醇-1mol/L盐酸胍洗出EPO
透析
透析液：10倍体积的10mmol/L Tris.HCl (pH 7.5)-2%蔗糖缓冲液 透析次数：2 时间：5~6h
流动相采用了低浓度阳离子缓冲液，pH在 7.5，洗脱时采用了改变离子强度的策略。 总的看来，EPO不是一种离子化程度很高的 物质，离子强度变化比较小即可使其从柱 上解离。一般使用50mmol/L~125mmol/L 的NaCl缓冲液即可将EPO从DEAE柱上洗脱 下来。
第三步：分子筛色谱
生产细胞株： CHO-EPO C2 （由军科院生物 工程研究所提供） 细胞培养基：含5%FBS和5*10-7mol/LMTX的 DMEM培养基（Gibco公司产品） 生产培养基：无FBS的DMEM：F12（1：1） 培养基（Gibco公司产品），另添加一些维 生素和小分子多肽
培养方法简介：
冻存细胞 扩增培养 0.025%胰蛋白酶消化 接种 堆积床反应器 〉1*10 7 无血清培 养基灌流培养
三步纯化法
用三步法纯化重组人促红细胞生成素
李 琳 邓继先 卢建申 周 江 （军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071） 生物技术通讯1997年第8卷第1期
三步纯化基本流程
第一步：反相柱色谱 样品浓缩约96.7% 透析 第二步： DEAE-离子交换色谱 第三步： 分子筛色谱
总回收率 〉30% 比活 1.5*108U/g蛋白