重组人促红细胞生成素的纯化

三步纯化法
用三步法纯化重组人促红细胞生成素
李 琳 邓继先 卢建申 周 江 （军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071） 生物技术通讯1997年第8卷第1期
三步纯化基本流程


第一步：反相柱色谱 样品浓缩约96.7% 透析 第二步： DEAE-离子交换色谱 第三步： 分子筛色谱
总回收率 〉30% 比活 1.5*108U/g蛋白
分析



分子筛，也就是凝胶层析，主要依赖分子量大小 分离蛋白质，EPO粗制品中分子量接近的蛋白质 较多，且该法上样量小，故一般不用于前期纯化 步骤。 凝胶层析除纯化分离作用外，还可起脱盐和置换 缓冲液作用。 在该方案中纯化的最后一步使用Sephacryl S-200 柱层析，在进一步分离纯化的同时，使终产品溶 液换为可直接临床使用的柠檬酸钠缓冲液。
重组人促红细胞生成素的纯化
什么是促红细胞生成素？


促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一 种促进红系造血前体细胞分化，繁殖的细 胞因子。 EPO产生于人的肾及胎儿的肝脏。
EPO的研究历史



1977年 Miyake 等人首先经过7步纯化从 在障性贫血患者尿中获得毫克量级尿EPO （urine EPO，uEPo） 尿液，血浆，胎盘浸出液 80年代后期编码人EPO基因被克隆 重组人EPO（recombinant human EPO, rhEPO）在哺乳动物细胞中成功表达

不同文献报道EPO的分子量有一定的差别, 其原因一是EPO为含糖量高达40%左右的糖 蛋白,糖基化程度的高低与分子量大小有关, 故SDSPAGE的染色带为一较宽的弥散带,另 外与上样量的多少也有一定的关系。

第一步：反相色谱

C6 反相柱（2cm*2cm） （创新生物技 术公司）

流程：
上样 50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/ml介质） 去离子水平衡至检测基线 10%~80%乙醇胍线性梯度洗脱 检测并收集含EPO主峰 ELISA测定
结果：60%乙醇-1mol/L盐酸胍洗出EPO
透析



透析液：10倍体积的10mmol/L Tris.HCl (pH 7.5)-2%蔗糖缓冲液 透析次数：2 时间：5~6h


流动相采用了低浓度阳离子缓冲液，pH在 7.5，洗脱时采用了改变离子强度的策略。 总的看来，EPO不是一种离子化程度很高的 物质，离子强度变化比较小即可使其从柱 上解离。一般使用50mmol/L~125mmol/L 的NaCl缓冲液即可将EPO从DEAE柱上洗脱 下来。
第三步：分子筛色谱

EPO理化性质



疏水性极强 酸性糖蛋白 pI 3.75~4.15 MW 30~39kD, 其中糖链约占39% 两个链内二硫键
rhEPO和天然EPO结构极为相似，仅在唾液 酸连接上有细微差别
(DavisGMetal.Biochemistry.1987:26:2633)


经等电聚焦电泳计算其pI为3.75～4.15.通 常来讲,一种蛋白质只有一个pI,但EPO的pI 并非如此,却出现较多条带,原因是EPO的糖 基化程度的微小差异而造成空间构象和分 子大小不同。
结果： ELISA检测盒表明75mmol/L洗脱峰中含
EPO
分析



Epo的pI偏低，所以多采用阴离子交换柱层 析，尤其是DEAE离子柱层析如DEAEsephacel,DEAE-sephadex,DEAE-agarose。 离子交换柱结合量大，洗脱体积小，纯化， 浓缩倍数较高。 天然，重组EPO原始粗制品中均含有一定浓 度的盐分，直接上柱层析往往不能很好吸 附，需要预处理。
rhEPO的应用

临床应用重组人促红细胞生成素可治疗慢 性肾衰竭合并贫血症，慢性肾功能衰竭 （CRF）贫血，骨髓增生异常综合症贫血 （Myelodys-plastic Syndrom ,MDS）， AIDS病人的伴生贫血，（非髓性）肿瘤伴 生贫血及肿瘤化疗贫血，β地中海贫血,镰刀 形贫血,早产儿贫血等.也可用于外科手术中 的自体输血、骨髓移植等。
生产细胞株： CHO-EPO C2 （由军科院生物 工程研究所提供） 细胞培养基：含5%FBS和5*10-7mol/LMTX的 DMEM培养基（Gibco公司产品） 生产培养基：无FBS的DMEM：F12（1：1） 培养基（Gibco公司产品），另添加一些维 生素和小分子多肽

培养方法简介：
冻存细胞 扩增培养 0.025%胰蛋白酶消化 接种 堆积床反应器 〉1*10 7 无血清培 养基灌流培养
EPO纯化历史



Miyake的七步法：纯化步骤太多,对设备及 操作要求也较高,不适合工业生产的特点 Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于 凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸 附,使得分离效果降低,成本增高,也不利于大 规模生产 疏水层析,凝胶柱层析等
三步层析法



1. 染料配基亲和层析→反相疏水层析→离 子交换层析; 2. 染料配基亲和层析→反相疏水层析→分 子筛层析; 3. 反相疏水层析→离子交换层析→分子筛 层析.
Sephacryl S-200 Βιβλιοθήκη Baidu谱分析
流程：
上样体积 80ml 流速 2ml/min 流动相 20mmol/L 柠檬酸钠- 100mmol/L NaCl 缓冲液
结果：收集的rHuEPO保留时间约为45min
比活性约为1.5*108U/g蛋白；纯度 〉98%（SDSPAGE检测） 免疫原性检测：Western blot
分析


相关历史：1980年Sylvia Lee Huang 报道 了使用疏水柱层析纯化uEPO，提示EPO是 一种疏水性较强的蛋白。不足：层析条件 剧烈，活性丧失多。 80年代后期，反相高压液相纯化成为趋势， 多用于离子交换柱的后续步骤。
第二步：离子交换柱

DEAE型离子交换柱
流程：
10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡 上样 20ml/min（柱结合量20mg/ml） 10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡至基线 添加NaCl入缓冲液，进行截状梯度洗脱（NaCl浓度分别为： 50，70，125mmol/L）