宣木瓜中齐墩果酸的分离提取及含量测定

宣木瓜中齐墩果酸的分离提取及含量测定1

严睿文1*，张秀真1，陈勤2

1. 安徽大学现代实验技术中心国家计量认证实验室，合肥（230039）

2. 安徽大学生命科学学院，合肥（230039）

E-mail：yrw@

摘要：采用高效液相色谱法测定了宣中齐墩果酸的含量,选用:Phenomenex

℃流C18(250mm×4.6mm i.d.,5µm);流动相:V(甲醇)：V(5%磷酸水溶液)=95：5;柱温:30;速:1.5mL/min;进样量:20µL;检测波长:210nm,结果齐墩果酸在50~1000mg/L范围内具有良好的线性关系,r=0.9998;考察了回流提取、超声提取、微波提取等样品处理方法，结果发现微波提取方法最好，相对标准偏差为2%～3 %，其回收率在95%~98%之间;检出限为0.5ng。宣木瓜在八月上旬齐墩果酸的含量最高，为9.98g/kg.

关键词：齐墩果酸，高效液相色谱，宣木瓜

木瓜为蔷薇科木瓜属植物，别名铁脚梨、秋木瓜、酸木瓜等,为蔷薇科落叶灌木,主产于四川、湖北、安徽、浙江等地。性味酸、温,具有平肝舒筋、和胃祛湿之功效，是一种名贵的药食两用瓜果。明代李时珍在《本草纲目》中称：“木瓜处处有之，而宣城者最佳”，故称木瓜为宣木瓜。齐墩果酸是宣木瓜的主要药效成分之一。齐墩果酸具有消炎、增强免疫功能、降转氨酶、防止肝硬化、降血脂、降血糖等多方面的临床药理作用，是治疗肝炎的有效药物之一。近年来的医学研究表明，齐墩果酸还具有抗癌活性［1，2］。因此宣木瓜在绿色食品、疾病防治和医疗保健等领域有广泛的应用前景。

齐墩果酸是五环三萜类化合物，不溶于水,可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。熔点为３０８～３１０℃，比旋度［α］２０＝＋７３．３°（氯仿中）。齐墩果酸的提取及检测方法较多[3，4,5]，但采用微波提取-高效液相色谱法对宣木瓜中的齐墩果酸含量鲜有报道，本实验采用回流提取、超声提取、微波提取等方法提取宣木瓜中的齐墩果酸，采用高效液相色谱法对木瓜中的齐墩果酸的含量进行测定，优化了检测条件，结果表明该法操作简便快速，精确度高。本文对木瓜中的齐墩果酸进行分离提取及含量测定研究，为木瓜的进一步开发利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Prostar-210型高效液相色谱仪（美国VARIAN公司）; KQ-2200DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MWS-3+型微波快速反应系统（德国BERGHOF公司）；Milli-Q型超纯水发生器(美国Millipore 公司); 电热鼓风干燥箱（江苏东台电器厂，型号101-1）；甲醇(色谱纯);乙醇(分析纯)；齐墩果酸对照品(购于中国药品生物制品检定所);试验用水为超纯水

1.2 色谱条件

色谱柱:Phenomenex C18(250mm×4.6mm i.d.,5µm);流动相:V(甲醇)：V(5%)磷酸水溶液=95：5;柱温:30℃;流速:1.5mL/min;进样量:20µL;检测波长:210nm

对照品溶液的配制准确称取齐墩果酸对照品0.0250g,置于25mL容量瓶中,用水溶解并稀1本课题得到安徽省教委自然科学基金（2006KJ100B、KJ2007A104ZC）的资助。

释到刻度,摇匀,得1000mg/L的齐墩果酸对照品溶液

标准曲线的制备准确配制质量浓度分别为50.0,250.0,500.0,750.0,1000.0mg/L对照品溶

液。

1.3样品处理

回流提取：精密称定原料3g,（精确至0.0001g）用40ml95%乙醇在60℃回流2h提取

3次,合并提取液，在旋转蒸发仪上浓缩，最后定容到25 ml的容量瓶中。

超声提取：精密称定原料3g,（精确至0.0001g）用40ml95%乙醇超声30min提取,在旋

转蒸发仪上浓缩，最后定容到25 ml的容量瓶中。

微波提取：精密称定原料1g,（精确至0.0001g）于提取罐中加入15ml95%乙醇，在120℃

提取20min,合并提取液，在旋转蒸发仪上浓缩，最后定容到25 ml的容量瓶中。

2 结果与讨论

2.1液相色谱分析条件的优化

曾用三种流动相V(甲醇)：V水=50：50、V(甲醇)：V水=95：5、V(甲醇)：V(5%)磷酸

水溶液=95：5,实验发现V(甲醇)：V(5%)磷酸水溶液=95：5是检测齐墩果酸的最佳流动相，

齐墩果酸的峰形对称,分离效好，其它两种齐墩果酸的峰形不对称，存在拖尾现象。

2.2齐墩果酸的标准曲线

在上述的色谱条件下，测定齐墩果酸的峰面积，齐墩果酸浓度与面积的对应关系见表1

所示，对照品齐墩果酸色谱图见图1所示，样品宣木瓜加标色谱图见图2所示。

表１齐墩果酸浓度与面积的对应关系

Table 1 The relation between density of oleanolic acid and area

(min) Density（mg/mL) Aera Rt

0.25 970718 5.210

0.50 1861493 5.205

0.75 2730462 5.215

1.00 3705219 5.217

Ｙ＝19525.7＋3667541Ｘ， Ｒ＝０.9998；

图1 对照品齐墩果酸色谱图

Fig.1 Chromatographic profile of standard oleanolic acid

图2 样品宣木瓜加标色谱图

Fig.2 Chromatographic profile of oleanolic acid with addition of standard

2.3不同提取方法的比较

通过不同的提取方法，各平行测定7份样品，考察方法的精密度；在样品中加入标样，按照实验方法进行加样回收实验，结果见表2。

表2 精密度及加样回收实验结果

Table 2 Results of precision and recovery test

treating with sample Average

g/kg

RSD(N=7)

S r/%

Added

g/kg

Found

g/kg

Recovery

R/%

回流

提取)

9.47 3.18 10.0 9.01 90.1 Ultrasonic

Extraction(超声

提取)

8.26 3.45 10.0 8.75 87.5 Microwave

Extraction(微波

提取)

9.94 1.59 10.0 9.83 98.3

从表2中可以看出，回流提取和超声提取方法处理样品，检测出样品中齐墩果酸的含量偏低，精密度大于3.4%，回收率小于90%；而微波提取方法处理样品，精密度为1.59%，回收率为98.3%，微波直接把能量辐射作用到反应物上，使极性分子每秒产生二十五亿次以上的分子旋转和碰撞，迅速提高反应物的温度，与通常的热传导、对流等致热方式不同，微波对物质具有很强的穿透力，对被照射物具有即时深层加热作用,微波的这种热效应使微波在穿透到介质内部的同时，将微波能量转换成热能对介质加热,形成独特的介质受热方式——介质整体被加热，即无温度梯度加热。微波可使试样与试剂的接触界面不断快速更新.粒子间发生局部的内加热，引起试剂与试样间产生较大的热对流，搅动并消除已溶解的不活泼试样表层，促进试剂与试样更有效的接触解。因此微波提取方法处理样品最好，宣木瓜中齐墩果酸的含量为9.94g/kg。

2.4检出限

以0.1mg/L的齐墩果酸对照品,按上述的色谱条件测定,以3倍信噪比计算齐墩果酸的检出限为0.5ng。