免疫组化技术-实用篇
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是现代生物学研究领域中一项重要的实验技术，它通过利用抗体与特定抗原的高亲和力结合特异性标记，可以准确地检测和定位分子在细胞和组织中的分布，并在这一基础上进行生物学功能的研究。
本文将对免疫组化技术的原理、应用以及发展趋势进行详细介绍。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术基于生物体对抗原与抗体的免疫反应，利用抗体与抗原的特异性结合来标记和检测感兴趣的分子。
免疫组化技术的关键步骤包括：抗原的固定、抗原的暴露、与抗原的特异性结合和信号检测等。
在免疫组化技术中，抗原通常需要进行固定，以保持其在组织中的形态和位置不变。
一般来说，抗原可通过形成固定化复合物或被共价结合到载玻片或膜上。
随后，我们需要将抗原从组织中溶出，以使其暴露于抗体。
这一步骤通常涉及脱水、脱脂和脱钙等处理。
暴露后的抗原可以与特异抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
为了标记抗原-抗体复合物，我们需要选择适当的检测系统。
目前常用的检测方法包括荧光染色、酶学染色和放射性标记等。
其中，荧光染色技术具有高灵敏度和分辨率，能够利用荧光显微镜直接观察标记物的分布。
二、免疫组化技术的应用免疫组化技术在许多研究领域中广泛应用。
在医学领域，它常用于研究肿瘤形成机制、诊断和预后判断。
通过免疫组化技术，我们可以检测和定位许多肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）和肿瘤相关抗原（CA）等，从而帮助医生进行早期诊断和治疗。
在神经科学领域，免疫组化技术被广泛用于研究神经元发育、突触形成和神经退行性疾病。
通过标记神经元特异性蛋白质，如神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经纤维酸性蛋白（NF）等，可以清晰地观察和研究神经元的结构和功能。
此外，免疫组化技术在细胞和分子生物学研究中也具有广泛的应用。
通过对细胞内蛋白质、DNA和RNA等分子的定位和检测，我们可以研究细胞的生物学功能和基因调控机制。
例如，通过检测特定蛋白质的表达和定位，可以研究调节细胞周期和细胞分化的信号通路。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是通过对组织切片进行染色，利用免疫反应性的抗原抗体反应，以检测和定位组织切片中的特定抗原或蛋白质的技术。
免疫组化在临床病理学和研究中被广泛应用，可以提供有关疾病诊断、病理机制研究、分子分型和药物靶向治疗等方面的信息。
1. 抗原修复（antigen retrieval）：抗原修复是为了使组织样本中的目标抗原或蛋白质恢复到免疫表位充分暴露的状态。
组织切片有可能存在形态学变化、组织化学改变、酸碱性改变或氧化还原状态的变化，这些变化导致了抗原稀释或失活。
抗原修复的方法通常包括热敏抗原恢复和酶消化抗原恢复。
热敏抗原恢复是将组织切片放置在高温缓冲液中，以恢复抗原的形态和免疫活性。
酶消化抗原恢复是通过酶的消化作用，破坏组织切片中的蛋白质交联结构，使抗原恢复活性。
2. 阻断（blocking）：阻断是为了防止非特异性背景信号的产生。
在进入下一步的抗体孵育之前，使用非特异性的蛋白质来覆盖未被抗体结合的区域，防止后续过程中非特异性背景信号的形成。
通常使用的非特异性蛋白质包括牛血清蛋白、羊血清蛋白、鱼胶蛋白等。
3. 一抗孵育（primary antibody incubation）：在这一步骤中，使用特异性抗体与目标抗原或蛋白质结合。
抗原抗体反应是免疫组化的核心步骤，这一步骤的可靠性和特异性对结果的准确性和解释性起着至关重要的作用。
选择合适的一抗对研究目的至关重要，一抗通常通过免疫荧光标记、酶标标记或生物素标记等方式来实现。
4. 二抗孵育（secondary antibody incubation）：在这一步骤中，使用抗一抗体结合免疫球蛋白和抗体复合物。
一抗与目标抗原结合后，二抗与一抗的Fc区结合，从而形成一个抗原-一抗-二抗复合物。
二抗通常标记有酶（如辣根过氧化物酶-HRP）、荧光物质（如荧光素酶）或生物素等。
5. 显色反应（color development）：根据标记的二抗的性质，选择合适的显色方法。
免疫组化技术演示文稿
特定的糖基。另外，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、
酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结 合部位
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（二）凝集素在免疫组织化学中的应用 由于凝集素的以上生物学特性，目前已广泛应用作为细胞 分化和成熟的标记、细胞特殊类型标记和肿瘤细胞凝结素结合特 性的研究。凝集素可以被多种标记物如荧光素、过氧化物酶、生 物素等所标记，进行免疫组织化学染色。
合物是先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与 卵白素反应，使每一个卵白素分子上结合3个带HRP的生物素， 留出一个能与其它生物素结合的空位。复合物上携带的HRP越多
，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显
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种属特异性，可适用于任何种属的一抗。
当然，生物素结合的二抗必须是针对一抗种属的。因此，SABC法
较PAP法操作更简单、更灵敏。目前，SABC试剂盒已经商品化，
可以根据需要购买。
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（四）PAP法与ABC法联合（ABPAP）技术
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1．直接法 将标记物质直接标记在凝集素上，使其直接与切片
中的相应糖蛋白或糖脂结合。本法简便、快速，但灵敏度不高。
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将荧光、HRP或
胶体金标记的凝 集素直接用于未 处理组织，简单 迅速但敏感性差 。
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2．间接法 将生物素化的凝集素直接与切片中的相应糖 基结合，生物素同ABC复合物结合。本法简便、快速，而且灵敏度
免疫组化教程范文
免疫组化教程范文免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质、抗原或其他分子的方法。
通过IHC技术，可以在组织切片中观察到染色物质的分布和定位，从而研究蛋白质表达、分布和定位在正常生理和病理状态下的变化。
IHC的基本原理是将待检测的抗原与特异性抗体结合，然后通过染色剂标记该抗体，使得抗原可以在显微镜下被直接或间接观察到。
以下是IHC的基本步骤：1. 制备组织切片：从病理标本或实验动物中取得需要研究的组织，并用形alin固定和包埋成蜡块。
然后，用切片机切出厚度约为4-6微米的组织切片，然后将切片贴附到载玻片上。
2.抗原修复：组织切片在生理条件下（如溶液中）固定后，可能会导致抗原的结构和形态发生改变。
因此，需要进行抗原修复来恢复抗原的结构。
常用的抗原修复方法包括热敏抗原修复（如蒸汽加压或热水浴）和酶解抗原修复（如消化蛋白酶）。
3.阻断非特异性结合位点：组织切片中存在一些非特异性的结合位点，容易和标记抗体结合，导致假阳性结果。
因此，需要使用一种非特异性抗体（例如牛血清白蛋白）在切片上进行预处理，阻断非特异性结合位点。
4. 标记抗体：选择适当的抗体来结合待检测的抗原。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，且必须能够特异性地结合到待检测的抗原上。
此外，还需要选择一种染色剂将抗体标记，常用的染色剂有酶标记和荧光标记。
酶标记常用的包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），而荧光标记则常用的有荧光素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
5.洗涤：在标记抗体过程中需要进行多次洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质。
洗涤的目的是提高特异性和灵敏度。
6.反应-可视化：将标记抗体溶液加到组织切片上，使其与待检测的抗原结合。
如果使用酶标记抗体，则需要加入底物使其转化为可见的染色产物；如果使用荧光标记抗体，则直接在显微镜下观察荧光信号。
7.染色和显微镜观察：使用显微镜观察切片染色后的结果。
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化技术在疾病诊断中的应用
免疫组化技术在疾病诊断中的应用随着生物医学领域的飞速发展，疾病的检测和治疗手段也在不断更新换代。
免疫组化技术就是其中之一，它应用了分子生物学、免疫学等学科的核心理论和技术，为疾病诊断提供了强有力的技术支撑。
但是，相对于其他技术来说，免疫组化技术的应用范围和定位可谓是口耳相传，今天，我们就来了解下它的应用。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术是利用抗体与抗原的特异性结合性质，针对被检测物在细胞或组织中的位置和数量进行定位与计量的方法。
免疫组化技术在诊断发育异常，鉴别组织类型，评估分子分型等方面起着重要作用。
通常包括以下三个步骤：1.抗原修复：对组织标本进行脱水、透明化、石蜡包埋、切片处理后，需要将变性的蛋白质抗原复原，使其在免疫反应中保持原有的构象和活性。
2.抗体标记：采用特定的抗体，针对需要检测的抗原进行特异性识别。
通常会利用荧光素、酶等物质与抗体进行标记。
3.染色反应：通过化学反应使标记后的抗体与抗原发生特异性反应，然后利用化学染色方法将反应产物显示出来。
由于该方法产生直接的显色反应，可以直接在显微镜下观测到抗原的位置、数目和类型。
二、1.肿瘤标志物检测肿瘤标志物是特定癌细胞产生的分子，可以通过类似免疫组化的方法进行检测。
凭借其高度特异性的优势，与肿瘤相关的标志物已被广泛运用于临床诊断中。
例如，抗体检测可以用于检测肺癌、鼻咽癌和乳腺癌等常见癌症，可作为确诊和治疗指南的依据。
2.医学遗传学检测用于检测胚胎性基因突变的技术已经应用于不孕不育和男性生殖系统疾病的研究中。
广泛利用的检测技术包括比色法、荧光抗体法和原位杂交法等。
该技术可在多种组织类型中用于检测精子数、精子质量和卵子质量等遗传学特征。
3.炎症诊断炎症标志物可以识别并跟踪炎性疾病的病理过程，如红斑性狼疮和类风湿关节炎。
适当的抗体检测可为长期的追踪和监测提供经济而可靠的方法。
4.神经学和心理学研究镜片染色和FISH技术的应用可以为神经学和心理学研究提供直接的可视化反馈，使分子分型分析更加容易。
免疫组化技术实用篇教学课件
2023免疫组化技术实用篇教学课件pptcontents •免疫组化技术简介•免疫组化技术实验流程•免疫组化技术实验数据分析和解读•免疫组化技术实验优化和提升•免疫组化技术前沿进展和发展趋势目录01免疫组化技术简介免疫组化技术是一种用于研究生物组织中蛋白质表达和分布的生物学技术。
定义免疫组化技术分为直接法和间接法两大类，其中间接法应用最为广泛。
分类定义与分类直接法利用特异性抗体直接与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
间接法利用特异性抗体与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
免疫组化技术的原理1免疫组化技术的应用23免疫组化技术可用于疾病诊断，如癌症、自身免疫性疾病等。
疾病诊断免疫组化技术可用于科学研究，如在细胞和分子水平上研究生物大分子的相互作用和功能。
科学研究免疫组化技术可用于药物研发，如检测药物在组织中的分布和作用。
药物研发02免疫组化技术实验流程包括组织样本、抗体、抗原等；实验准备实验材料准备如显微镜、染色机等；实验仪器准备熟悉实验操作流程和注意事项。
实验操作准备切片制作将组织样本制作成切片，并进行脱蜡、水化等处理；加一抗将抗体稀释后加入切片中，孵育适宜时间；抗原修复使用抗原修复液对切片进行修复，以暴露出抗原；加二抗将标记有荧光素的二抗加入切片中，孵育适宜时间；阻断加入阻断液，以抑制内源性过氧化物酶活性；观察与拍照用荧光显微镜观察染色结果，并进行拍照记录。
实验步骤及操作流程实验注意事项实验前务必熟悉操作流程和注意事项；对于不同的组织类型和抗体，应根据具体情况调整实验条件和操作步骤；实验过程中要注意安全，避免受伤和感染；在实验过程中要保持实验室的清洁和整洁，遵守实验室规范。
03免疫组化技术实验数据分析和解读03定量PCR使用荧光定量PCR技术，检测样本中特定基因的表达水平，分析免疫组化染色的结果。
高级病理学：免疫组化技术原理与应用
乳腺良性肿瘤肌上皮完整， Actin＋ 乳腺癌浸润性，缺乏肌上皮， Actin－ 晚期乳腺癌，肌上皮萎缩或完全破坏消失
（三）神经源性肿瘤标记物
１、胶质纤维酸性蛋白（ Glial fibrillary acide protein ，GFAP）
Eng在1971年首先从人脑胶质细胞中分离出 来的一种酸性蛋白
①植物凝集素与糖 ②葡萄球菌A蛋白与IgG ③生物素Biotin与卵白素Avidin ④受体与配体 ⑤阴阳离子
ABC法(Avidin biotin-peroxidase complex)
染色原理与流程：
ABC：①Biotin+HRP Biotin-HRP
②1分子Avidin+3分子Biotin-HRP
２、与肿瘤生长相关的抗原 ①肿瘤胚胎抗原 ②肿瘤相关抗原 ③细胞机能抗原 ④某些酶与激素 ⑤病毒基因
其中，在肿瘤鉴别诊断中，具有代 表性的是５种中间丝蛋白：
①上皮细胞的角蛋白（Keratin） ②间胚叶细胞的波纹蛋白（Vimentin） ③肌细胞的结蛋白（Desmin） ④神经元的神经细丝
⑤神经胶质细胞的胶质细丝酸性蛋白
或4%胃蛋白酶消化30-60min，37°C 4，PBS 3X3min 5，0.3%H2O2甲醇液，室温10-30min 6，5%-10%正常血清，室温20 min 7，不洗，滴加适当浓度的特异性抗体，
如1：100的McAbDesmin，37°C60min，或4°C过夜 8，PBS 3X3min 9，生物素化羊抗鼠二抗，1：200，37°C，40min 10，PBS 3X3min 11，ABC1：100-1：150，37°C，40-50min
肿瘤病理诊断新技术免疫组化技术免疫组化技术现已广泛应用于
肿瘤病理诊断新技术一、免疫组化技术免疫组化技术现已广泛应用于病理诊断，不仅在解决疑难病例诊断方面起着重要作用，随着人们医疗风险意识的增强，许多普通的病例也常常需要免疫组化进一步证实，因此成为病理科医生常规工作中不可缺少的重要工作、常规手段。
在小活检病理检查中免疫组化技术能明确地显示癌细胞的存在（如胃粘膜活检中的印戒细胞癌），可使微小癌、微小转移灶（淋巴结及骨髓）、甚至不易察觉的病变得以确诊。
通过乳腺癌激素受体（ER、PR）的检测，免疫组化技术在指导临床治疗方面已起到了重要的作用。
通过检测针对肿瘤基因产物（C-erbB2、P53、ALK、CD117等）的抗体还将进一步为分子靶向治疗提供重要的参考依据。
细胞增殖核抗原（Ki-67）等免疫组化染色可为肿瘤的预后提供依据。
免疫组化技术的局限性：至今无绝对特异的抗体！相当多的肿瘤缺乏特异的抗原表达；同一种抗原常常可在多种肿瘤中表达，不少肿瘤又由于分化太差或细胞分子结构改变而不表达相关的抗原。
不同抗体滴度有不同的阳性结果；内源性生物素造成假阳性，如肝细胞癌等；缺乏免疫组化的标准化（同一实验室及不同实验室间结果的一致性）；定量结果的判断等还存在不少的问题尚待解决，如ER受体，有的实验室只要有阳性肿瘤细胞就视为阳性，而有的实验室则要至少20％细胞阳性才视为阳性，阳性标准往往是随意确定的，未经临床病理研究证实。
如何正确应用免疫组化呢? 要得到正确、有价值的免疫组化结果，免疫组化实验室规范、合适的技术操作（包括组织固定、抗原修复、检测系统、各类试剂的质量保证、染色技术等）是最重要的基础保证，但病理科医生在组织块的选择、抗体的选择、结果的判断等方面也起着不容忽视的作用。
二分子病理学这是继电镜、免疫组化之后的第三个浪潮。
其优点是反应特异、敏感，检测靶信号本质上不同，DNA检测温度固定影响小。
采用的方法包括PCR、滤膜杂交（斑点、印迹转移），原位杂交、荧光原位杂交（FISH）、显微切割技术、比较基因组杂交、生物芯片（基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片）等。
《免疫组化技术》课件
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化技术典型实验案例学习-3
免疫组化技术典型实验案例学习-36、以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。
还有抗体稀释液的PH值过低等其它原因的干扰。
总之，要想把免疫组化做好，可能每一个环节都很重要，但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。
案例三：石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果背景：因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1（一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白）免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过（原理知道，但细节不太了解）。
我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想（表现为未见特异性强染色）；近几日，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。
在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论），不妥之处敬请指正。
有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光？其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测（我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。
）问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色？1、非特异性染色产生原因及其解决方案：（1）游离荧光素残留在二抗中。
一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。
购买高质量、高纯度的荧光素二抗。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）组织抗原封闭不全。
除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
免疫组化科普
免疫组化科普
免疫组化是一种用于检测组织切片中特定蛋白质表达的技术。
通过免疫组化技术，我们可以了解到组织切片中特定蛋白质的表达情况，从而帮助我们进行疾病的诊断和治疗。
在免疫组化中，我们常用的是抗体。
抗体是一种能够特异性地结合到目标蛋白质的分子。
在免疫组化中，我们通常会选择与目标蛋白质结构相似的抗体，将其标记上荧光素或酶等物质，再加入到组织切片中，经过反应后用显微镜观察标记物的分布情况。
免疫组化技术有着广泛的应用，例如在癌症诊断中，我们可以通过检测肿瘤组织中特定蛋白质的表达情况来判断病情的严重程度和预后。
在药物研发中，我们可以通过检测药物对特定蛋白质的影响来评估药物的疗效和毒性。
在病理学研究中，我们可以通过检测疾病组织中特定蛋白质的表达情况来了解疾病的发生机制和病理变化。
但是，在进行免疫组化检测时，我们也需要注意一些问题。
首先，抗体的选择非常重要，必须选择与目标蛋白质结构相似的抗体，否则可能会出现假阳性或假阴性的情况。
其次，免疫组化的结果受到许多因素的影响，例如组织处理的方法、抗体的浓度和反应时间等，因此需要进行严格的控制实验。
最后，免疫组化检测结果还需要结合临床病史和其他检测结果进行综合分析，才能得出准确的诊断和治疗方案。
总的来说，免疫组化是一种非常重要的检测技术，在医学研究和临床应用中都有着广泛的应用。
我们需要注意抗体的选择和实验的严格控制，以获得准确的检测结果，为疾病的诊断和治疗提供科学依据。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测和定位特定抗原在组织样本中的表达的技术。
它是病理学和分子生物学中非常常用的技术之一，广泛应用于疾病的诊断、治疗和研究。
1.取样和制片：首先从活体组织中取得样品，这可以通过标本切片、穿刺活检或手术切取的方式来获取。
然后，将样本固定在福尔马林等适当稳定固定剂中，以保持组织的形态结构和抗原的完整性。
接下来，将固定的组织块进行脱水和包埋，制作成薄片，以便于后续的染色和分析。
2.抗原恢复：对于一些抗原，固定和包埋过程可能会导致其空间和/或结构性改变，并使其与抗体的结合受到抑制。
因此，在进行染色之前，需要通过抗原恢复步骤来恢复抗原的原始状态。
这通常包括对组织样本进行煮沸处理或酶解等热或化学诱导方法，以打开抗体与抗原结合的位点。
3.抗体染色：在免疫组化中，抗体是关键的组分。
通常，会使用特异性的初级抗体与目标抗原结合。
该初级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
这些抗体通常是经过酵素、荧光或放射性标记的，以便于可视化抗原的位置和定位。
4.第二抗体标记：在免疫染色中，为了提高信号的强度，需要使用能够与初级抗体结合的第二抗体。
这个第二抗体通常是与荧光物质、酵素或金颗粒等标记物结合的。
这样，在光学或电子显微镜下可以更容易地观察到抗原的位置。
5.可视化：通过对样本进行可视化，可以观察到抗体与抗原的结合情况。
染色的结果可以是可见的颜色、荧光等。
在可见染色中，通常使用染色剂，如二氧化硅染剂、二氮化钼染剂等。
对于荧光标记的样本，可以使用相应的激光或滤光片来观察荧光信号。
最后，在显微镜下观察和记录染色结果。
6.结果分析：在免疫组化结果分析中，需要对染色的结果进行定性和定量的评估。
这可以包括测定抗原的表达强度、局部化和分布等。
可以使用计算机软件和图像分析算法来辅助结果的定量和分析。
总的来说，免疫组化是一种可以检测和定位特定抗原在组织中表达水平的重要技术。
临床免疫组化实用大全
免疫组化之阳早格格创做定义：免疫组化，是应用免疫教基根源基本理——抗本抗体反应，即抗本与抗体特同性分离的本理，通过化教反应使标记表记标帜抗体的隐色剂（荧光素、酶、金属离子、共位素）隐色去决定构制细胞内抗本（多肽战蛋黑量），对付其举止定位、定性及定量的钻研，称为免疫构制化教技能(immunohistochemistry)或者免疫细胞化教技能(immunocytochemistry).临床时常使用免疫组化指目标意思临床病理处事中，咱们时常使用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记表记标帜”，然而是许多单位只写阳性截止，不写临床意思，其截止对付临床帮闲不大，果为许多医死陌死得那些截止的意思，果此修议大家正在出此类报告时，把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记表记标帜”的意思挨印正在报告中，以减少病理报告的使用价格.1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记表记标帜，齐套4项：P-gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67.2、乳癌免疫组化耐药预后标记表记标帜，齐套7项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，C-erbB-2.3、意思：标记表记标帜物--效用--阳性部位--临床意思多药耐药基果蛋黑（P-Gp）--药泵效用--胞膜/胞浆--阳性率越下，对付下列药物耐药性越强：阿霉素、柔黑霉素、表阿霉素、米托蒽醌、少秋花碱、少秋新碱、紫彬醇、泰素帝.谷光苦肽S变化酶（GST π）--解毒效用--胞浆--阳性率越下，对付下列药物耐药性越强：阿霉素、逆铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁.拓扑同构酶Ⅱ（TOPOⅡ）--靶面效用--胞核--阳性率越下，对付下列药物越灵验：蒽环类抗死素战鬼臼毒素类，如VP16、替僧泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔黑霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26.阳性率下者对付VP16更加灵验.雌激素受体（ER）--性激素效用--胞核--阳性率越下，肿瘤对付内分泌治疗越灵验，预后越佳.孕激素受体(PR) --性激素效用--胞核--阳性率越下，肿瘤对付内分泌治疗越灵验，预后越佳.C-erbB-2--癌基果产品--胞浆--阳性率越下，肿瘤恶性程度越下.ER、PR阳性而C-erbB-2也阳性者，用三苯氧胺治疗效验短佳.Ki-67--细胞删殖标记--胞核--阳性率越下，肿瘤删殖越快，恶性程度越下.Ki-67为细胞删值的一种标记表记标帜，正在细胞周期G1、S、G2、M期均有表黑，G0期缺如，其战许多肿瘤瓦解程度、浸润、变化、预后稀切相闭.PCNA(删埴细胞核抗本).CEA 普遍腺癌表黑CEARb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基果是肿瘤压制基果，安排细胞周期.P53正在免疫组化中均为突变型，阳性率越下，预后约好.家死型半衰期很短Nm23是变化压制基果，其阳性表黑战肿瘤变化呈背相闭.暂时已被广大应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、喉癌等多种恶性肿瘤的检测.险些所有的钻研皆标明，nm23蛋黑下表黑患者淋凑趣变化率相对付较矮，存活期相对付较少.E-Ca，E钙粘附蛋黑，介导细胞间粘连效用的跨膜糖蛋黑，其功能丧得引起细胞之间连交的损害，主要用于肿瘤侵蚀战变化圆里的钻研.PS2（雌激素安排蛋黑），其表黑战ER表黑有闭，可动做内分泌治疗战预后推断的指标之一.CK18，矮分子量角蛋黑，主要标记表记标帜百般单层上皮包罗腺上皮，而复层鳞状上皮常阳性，主要用于腺癌诊疗.CK19，分散于单层上皮战间皮，时常使用于腺癌诊疗，肝细胞不表黑，而胆管为阳性反应Hep par 1,肝细胞抗本，仄常肝细胞战下瓦解肝细胞癌阳性，矮瓦解肝细胞癌多强阳性或者阳性.CK20，用于胃肠讲腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊疗.鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜战卵巢非黏液性肿瘤常阳性.CK7 卵巢、肺战乳腺上皮常阳性，结肠、前列腺、胃肠讲上皮阳性.Villin 绒毛蛋黑，仄常构制中，villin常常只表黑于有刷状缘的细胞上，如胃肠讲上皮细胞、胰腺战胆管上皮细胞以及肾真量的上皮细胞中（特天是近直小管）.Villin正在胃肠讲癌、胰腺癌、胆囊癌战胆管癌构制中有很下的表黑率，具备明隐腺样结构的肿瘤上不villin表黑，则那个肿瘤为胃肠讲、胰腺、胆囊或者胆管根源的大概性极矮.乳腺癌也时常成为女性患者已知本收部位变化癌要鉴别排除的一种徐病.果为正在变化癌构制上瞅察到明隐的villin免疫组化阳性染色，则那个肿瘤便极不可能为乳腺根源.其余villin免疫组化染色常常为阳性表黑的肿瘤另有：如卵巢浆液性癌、尿讲移止细胞癌战前列腺癌.间皮瘤也时常为villin阳性表黑，果此正在一些情况下Villin 还不妨动做鉴别间皮瘤战腺癌使用抗体的一种.然而是也有一些非胃肠讲根源的肿瘤可表黑villin，如子宫内膜样腺癌、卵巢粘液性癌、肾细胞癌战小部分肺癌.也有一些博家报导Villin正在部分宫颈内膜腺癌病例中表黑.肝癌的诊疗Villin免疫组化染色不妨隐现出毛细胆管结构，果此它也大概正在表黑部分肝癌的管状结构上很有用.多克隆CEA是用于此脚段的第一种试剂，而且CD10 (CALLA)正在表黑肝癌的该结构上也非常有用.多克隆CEA、villin战CD10 (CALLA)正在肝癌病例上的表黑，相互之间并不所有的辩论，果此如果猜疑肝癌的大概性，修议将那三种抗体共共使用以协帮疑易病例的诊疗.Villin正在神经内分泌肿瘤上的应用Villin正在神经内分泌肿瘤的钻研上也很有帮闲.寡所周知，类癌战胰腺的胰岛细胞肿瘤具备相相似的形态教特性，仅正在形态教上区别那二种肿瘤险些是不可能的.Villin 正在那种情况下特天有用，果为据文件报导正在85%的胃肠讲类癌病例中有villin的表黑，然而正在胰岛细胞肿瘤上已睹阳性表黑报导.Villin正在类癌上的表黑常常为胞膜阳性.其余，有一些凭证标明villin正在胃战下消化讲的小细胞癌上的表黑率比正在其余部位的小细胞癌上要下.如：肺、食讲、膀胱或者前列腺等.据文件报导，约莫有40%的肺类癌病例villin阳性，正在其余一些神经内分泌肿瘤上，如甲状腺髓样癌战少量的好克我细胞瘤上也有villin的表黑.MRP1多药耐药相闭蛋黑1，效用化疗敏感性，战预后相闭.MDR 多药耐药基果TS胸苷合成酶，是5-FU要害效用靶面，如果其下表黑，阳性反映++以上，提示肿瘤细胞对付5FU耐药.Syn 突触素神经构制标记S-100 神经构制标记，存留于神经构制，垂体、颈动脉体，肾上腺髓量、唾液腺、少量间叶构制，时常使用于神经鞘瘤、恶乌、脂肪肉瘤、硬骨肿瘤诊疗.NSE 主要用于神经内分泌肿瘤诊疗Chr,嗜铬素，肾上腺髓量含量很下，鉴别肾上腺髓量战皮量，用于神经内分泌肿瘤诊疗.CKH 下分子角蛋黑，主要标记表记标帜鳞状细胞肿瘤CKL 矮分之角蛋黑，主要标记表记标帜单层上皮、腺上皮EMA 上皮膜抗本，糖蛋黑，广大分散百般上皮及其肿瘤Vim 波形蛋黑，间叶构制标记P504 甲酰基辅酶A 消旋酶检测诊疗前列腺癌的敏感性为97％，特同性为100％.AMACR的便宜正在于它是癌症特同性，只存留于癌症构制.Rubin称，AMACR亦可用做其余癌症的诊疗标记物.对付百般癌症细胞举止查看后创制，结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤战乌素瘤皆过分表黑AMACR，以结肠直肠癌战前列腺癌表黑最下.CD117 胃肠间量瘤CD10 动做共共慢性淋巴母细胞型黑血病抗本，主要表黑于已老练淋巴细胞，正在Burkitt淋巴癌，缓性髓性黑血病等制血系统徐病的诊疗中具备应用价格.近几年去创制该抗本正在制血系统中的某些肿瘤中有表黑，如子宫内膜间量肉瘤、恶性乌色素瘤等.抗体正在对付肾细胞癌举止诊疗战鉴别时有一定的参照价格.CD15是一种细胞粘附分子，果其对付霍偶金淋巴瘤(HD）中的R-S细胞具备良佳的标记表记标帜效用，被认为是HD的要害标记物.除HD的鉴别诊疗中，对付胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、乳腺癌等肿瘤CD15的表达钻研创制，CD15表黑随癌细胞瓦解程度下落、淋凑趣变化战临床分期删下而明隐删下.认为CDl5的表黑是推断肿瘤的死少、预测淋凑趣变化战预后的良佳指标.免疫电镜瞅察隐现，CD15抗本主要分散于大肠癌细胞浆的界膜、内量网、下我基体及近细胞核膜处，CD15大概是通过对付所分离的铺基构型改变效用战介进肿瘤的产死战变化历程.SMA 仄滑肌肌动蛋黑，标记表记标帜仄滑肌CD56 为神经细胞黏附分子，主要分散于大普遍神经中胚层根源细胞，时常使用于星型细胞瘤、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤诊疗，也是NK细胞瘤的要害标记，也标记表记标帜小细胞肺癌Des,结蛋黑，广大分散于仄滑肌、心肌、骨骼肌细胞战肌上皮细胞，下瓦解下表黑、矮瓦解矮表黑.MSA 肌特同性肌动蛋黑，广大分散于险些所有肌型细胞中CD68存留于骨髓战各神经构制的巨噬细胞用于粒细胞黑血病、百般单核细胞根源肿瘤、包罗恶性纤维构制细胞瘤诊疗（尾选）.CD34 表黑于早期淋巴制血搞细胞、祖细胞、内皮细胞、胚胎纤维母细胞战某些神经构制细胞，多用于标记表记标帜血管内皮细胞，血管源性肿瘤的诊疗，GIST 80-90%.CD31也标记表记标帜血管内皮.CD44 是一种分散广大的跨膜糖蛋黑分子，分CD44s战CD44v二大类.CD44s主要动做透明量酸受体，分离透明量酸后效用肿瘤的死少战变化.而CD44v则主要表黑于变化的肿瘤细胞.李讲明等用免疫组化LSAB法检测了42例食管鳞癌CD44v4／5的表黑，截止创制，淋凑趣变化组的阳性表黑率为76．19％(16／21)，而非变化组的阳性率为42．86％(9／12)，二组间有隐著性好别.癌巢周边的癌细胞、肌间浸润的癌细胞、有核团结的癌细胞战癌栓中的癌细胞及浸润脉管壁的癌细胞均呈强阳性表黑.弛成武等检测了20例仄常胃粘膜上皮、43例同型删死战85例胃癌构制CD44v6的表黑，截止仄常胃粘膜无表黑，而同型删死战胃癌构制阳性率分别为30．2％战74．1％，其表黑强度与胃癌浸润深度、淋凑趣变化、肿瘤死少办法、静脉战淋巴管侵蚀及近处变化稀切相闭.以上截止均标明，CD44v的下表黑形成了肿瘤细胞的侵蚀性与易变化性.NESTIN,神经搞细胞中极为歉富Ost 成骨素，为骨化细胞分泌.AAT 抗胰蛋黑酶纤维构制细胞根源肿瘤ACT抗糜蛋黑酶GFAP 胶量纤维酸性蛋黑神经构制标记，多用于星形胶量瘤诊疗Tg 甲状腺球蛋黑，甲状腺癌TG阳性.CT 落钙素甲状腺髓样癌阳性.PH 甲状旁腺素甲状旁腺肿瘤阳性N-myc表黑巩固的小细胞肺癌战神经母细胞瘤对付化疗缺乏反应并收达赶快；bcl-2：耐药机理为抗凋亡效用，下表黑者对付普遍抗癌药物/搁射治疗耐受.肿瘤相闭抗本72 (TGA72) 多种恶性上皮性肿瘤表黑TGA72，更加是乳腺癌、卵巢癌战结肠癌.仄常上皮细胞、肉瘤、淋巴制血系统肿瘤常常TGA72阳性. TGA72抗体用于乳腺癌的钻研较多，其下表黑常常与肿瘤体积大、淋凑趣变化瘤细胞瓦解好及下删殖活性有闭.肿瘤相闭抗本(GA733) 编码上皮糖蛋黑40，是一种上皮细胞黏附分子(EP-CAM)，对付上皮细胞的死少与瓦解起着要害效用.多种肿瘤可有GA733表黑，更加是乳腺癌、结肠癌及肺癌等.Kubuschok等采与GA733对付非小细胞肺癌脚术切除淋凑趣中消得性微变化灶举止检测，创制消得灶的检出是推断总存正在率的独力预后果子.结肠癌GA733表黑形式与肿瘤预后有闭，细胞膜及细胞浆的表黑预后较基膜侧的表黑为好.TTF-1 甲状腺转录果子-1，TTF-1表黑于甲状腺腺上皮战肺的上皮细胞中.正在肺肿瘤钻研中创制，大普遍肺的小细胞癌、本收性战变化性肺腺癌、少部分大细胞已瓦解肺癌、大普遍非典型神经内分泌肿瘤免疫组化截止隐现TTF-1阳性，而肺鳞癌及绝大普遍典型类癌TTF-1阳性.正在甲状腺乳头状腺癌中TTF-1亦阳性，而TTF正在其余构制表黑阳性.据此认为TTF-1可用去鉴别肺腺癌与鳞癌，并有帮于与肺变化性腺癌的鉴别.TTF-1正在甲状腺及其肿瘤中的表黑TTF-1主要表黑正在甲状腺滤泡细胞中战甲状旁腺的主细胞中，TTF-1为甲状腺瓦解战甲状腺球蛋黑分泌安排的前提物量，可促进甲状腺过氧化物酶、碘/钠的转运，•TTF-1与血浑TSH的活性有闭，活性的TSH-R 可巩固TTF-1的表黑.TTF-1正在良恶性甲状腺构制中表黑分歧，仄常甲状腺战良性腺瘤表黑多，甲状腺乳头状癌与滤泡癌中表黑少，已瓦解癌中不表黑，TTF-1正在恶性甲状腺病变中的表黑强度随年龄减少而巩固，而且病变存瘤期少，复收机率下.TTF-1正在肺癌中的表黑75%的肺非小细胞癌（NSCLCs)阳性表黑，腺癌(ACs)明隐下于鳞癌(SCC)，90%以上的本收性小细胞肺癌(SCLC)表黑阳性，TTF-1正在非小细胞肺癌（NSCLCs)阳性表黑强度与病人的预后成呈背相闭，可动做一项独力的预后指标，肺的典型性类癌(TCS)均为阳性，标明小细胞肺癌战非小细胞肺癌大概有一个分歧于TCS的共共起源的表里.临床罕睹的免疫组化指标正在乳腺癌诊治中的应用连年去，由于免疫组化真验要领正在各医院病理科的赶快遍及，许多患者的术后标本不妨举止免疫组化查看.那对付于患者的诊疗、分型以及术后的概括治疗有着要害的意思.本文便临床上罕睹的一些指标及其意思举止综诉.一、激素受体（ER）战孕激素受体（PR）人类最先创制乳腺癌细胞战激素的闭系初于1896年.Bentson瞅察到乳腺癌患者切除卵巢后可使乳腺癌细胞的死少受到压制.1967年Jensen创制人类乳腺癌中含有ER.今后开初了真真意思上的乳腺癌内分泌治疗的钻研.女性仄常乳腺的细胞上存留ER战PR，雌激素战孕激素通过ER战PR对付细胞功能举止安排.当细胞恶变时，肿瘤细胞不妨部分天或者局部死存仄常的受体系统，其功能与仄常细胞相似.那种肿瘤细胞的死少仍旧依好本去的激素环境安排，称为激素依好性肿瘤，临床上称为ER阳性乳腺癌.有些细胞正在癌变历程中，其受体系统死存很少或者真足丧得，不克不迭再动做激素的靶细胞，其死少不再受激素的统制与安排，临床上表示为ER阳性乳腺癌.Jensen创制ER后，很快又创制PR，并说明PR的合成与雌激素战ER复合物正在核内爆收的变更历程有闭，PR 的产死直交受ER的统制战安排，故PR阳性的乳腺癌，ER 大多为阳性.临床上不妨通过对付雌激素受体（ER）战孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的火仄，进而提示乳腺癌的预后疑息战指挥内分泌治疗.据报导乳腺癌ER、PR检测的阳性率分别为40%～60%、30%安排.许多文件均已证据，ER、PR变更与乳腺癌病人预后稀切相闭，亦与其余公认的预后果素，如肿瘤分级、倍体性及分期有闭.下瓦解肿瘤或者临床分期较矮的肿瘤ER、PR更大概阳性，受体阳性肿瘤细胞的明隐缩小与细胞删殖分级删下、c-erbB-2癌基果扩删减少及EGFR表黑减罕见闭.免疫组化抗受体检测可预测乳腺癌对付激素治疗的反应性.无ER 或者PR表黑的肿瘤对付激素治疗常常反应性好，而ER及PR阳性肿瘤则对付激素治疗反应性下.1974年好国Bethesde 国际散会，概括天下各国400多例百般办法的内分泌治疗报导，标明预先已经激素受体测定的乳腺癌患者，应用内分泌治疗灵验率惟有30%；而经ER测定阳性者灵验率达55%~60％，受体阳性者灵验率5％~8％.TAM治疗无效的本果与ER的非常十分结构有闭.其后多年病例不竭散集，报导的灵验率基础正在那一火仄.1998年好国临床肿瘤年会（ASCO）国际权威协做临床钻研报导 37 000例乳腺癌患者的截止标明：①乳腺癌术后辅帮三苯氧胺（TAM）治疗不妨明隐落矮复收率、牺牲率；②TAM对付绝经后患者灵验，绝经前患者也有一定疗效；③ER阳性患者用TAM效验最佳，ER不明的患者也灵验；④辅帮化疗后加用TAM，能进一步遍及疗效；⑤延少服药时间能遍及疗效；⑥服用TAM明隐落矮对付测乳腺癌爆收率；⑦少久服用TAM会减少患子宫内膜癌的危害.二、PS2基果PS2蛋黑是Masialowski于1982年从激素依好性乳腺癌MCF-7细胞株中提与出去的雌激素诱导蛋黑之一，正在乳腺癌中表黑阳性率约为43％～58％.PS2基果受雌激素安排战统制，正在雌激素诱收战统制下才搞转录，爆收PS2蛋黑.换止之PS2依好于ER的存留.不妨认为，PS2基果的存留与ER、PB存留着稀切正相闭闭系.Gion钻研446例本收性乳腺癌，瞅察PS2与ER、PR闭系.截止68．5% PS2阳性病例，其ER、PB均阳性；而PS2阳性其ER、PR均阳性者缺乏3％.Gillesby等报导ER（＋）者中有59％，PR（＋）者中有60％PS2呈阳性.洪量钻研标明，PS2蛋黑不妨隐现功制性雌激素安排系统，能更佳的指挥临床抗雌激素治疗.暂时认为PS2对付推断预后及指挥内分泌治疗均有价格，阳性者预后佳，复收率及牺牲率均较矮，且内分泌治疗灵验.动做内分泌治疗效验预测的指标，PS2不妨补充ER、PR的缺乏，以至有教者认为PS2更劣于ER、PR.如果将三者分离使用，可达到相称谦意的效验.当三项均阳性时，内分泌治疗很少灵验，预后甚好.三、c-erbB-2癌基果c-erbB-2癌基果是乳腺构制细胞中较罕睹而易激活的本癌基果.正在多种腺癌细胞中此癌基果均有下火仄表黑，报导最多的是乳腺癌.c-erbB-2癌基果的非常十分表黑扩删睹于25-30%的本收性乳腺癌病例，而且仅限于癌细胞，而不出现于仄常乳腺上皮.c-erbB-2扩删与雌、孕激素受体表黑呈背相闭，与肿瘤级别较下有闭.c-erbB-2基果表黑阳性者可使ER阳性病人对付内分泌治疗的反应率落至20%;ER阳性病人内分泌治疗险些无效.c-erbB-2癌基果的扩删或者过分表黑还与乳腺癌的复收、变化及存正在期明隐相闭.过分表黑者其术后早期复收率战近处变化率减少,存正在期收缩，淋凑趣阳性的乳腺癌c-erbB-2的过表黑是预后不良的要害果素. 另有钻研标明，乳腺癌c-erbB-2表黑阳性病例其瘤肿往往大于2cm，果此推测其蛋黑产品p185过量表黑大概与肿瘤的死少速度有闭.果而c-erbB-2的强阳性表黑可动做辨别早期乳腺癌的灵验指标.连年去有人提出"四联"检测，包罗ER、PR、PS2以及c-erbB-2. ER、PR、PS2阳性表黑的乳腺癌激素治疗的敏感性下，无c-erbB-2基果过分扩删的乳腺癌共样治疗敏感性减少.好同，前三者阳性而后者阳性的乳腺癌，常常其复收率、牺牲率均下，预后好.四、p53抑癌基果p53是一种抑癌基果，是人类钻研最多的基果，分家死型（Wtp53）战突变型（Mtp53）.Wtp53正在仄常构制内含量矮，半衰期短，仅30～60分钟，而免疫组化的敏感性无法检测如许微量的抗本身分.当p53突变后，能战加进构制内的百般病毒蛋黑、Wtp53蛋黑、仄常等位基果蛋黑战热戚克蛋黑等分离产死宁静的复合物，正在构制内的半衰期少，含量渐渐散集，为免疫组化的检测提供了条件.其阳性表黑率约２５％－３５％.Wtp53正在仄常构制中能介进细胞从G0期加进G1期的背安排.进而统制细胞的删死，共时诱导细胞的步调性牺牲.当p53突变后则丧得了开用细胞凋亡的本领，截止使肿瘤细胞数目减少，进而使细胞浮现无戚止死少而凋亡受到压制.正在乳腺癌删死历程中有Mtp53基果表黑，并随着非典型删死程度的减少而减少.p53表黑火仄与细胞的下度删死及肿瘤细胞的瓦解程度有闭，瓦解越矮恶性程度越下的肿瘤，p53基果火仄越下.p53基果蛋黑阳性战ER阳性的乳腺癌患者预后不良，存正在期短.五、nm23nm23又称为抗变化癌基果，是一种抑癌基果，产品是由152个氨基酸组成的蛋黑量，与二磷酸核苷激酶（NDPK）的氨基酸序列具备下度共源性.人类nm23基果有2个亚型：nm23H1战nm23H2,二者有88％共源性，nm23H1与乳腺癌的预后闭系更稀切.nm23蛋黑具备NDPK 功能，通过效用微管散合而安排细胞疏通，并通过效用G 蛋黑的旗号传播而收挥背背安排效用，进而压制肿瘤变化.然而其效用本去不依耐于NDPK的活性.有真验截止标明，与变化潜能有闭的是nm23/NDPK的表黑火仄而不是NDPK 的活性.nm23是独力预后指标，其表黑与年龄、肿瘤大小、ER、PR战C-erbB-2无闭，与淋凑趣变化情景、构制教分型、分级及临床分期均有隐著闭系，nm23下表黑者的预后明隐佳于矮表黑者.nm23表黑落矮的乳腺癌瓦解较矮，ER 表黑火仄矮，并时常出现淋凑趣变化，预后不良.正在乳腺癌收达历程中，nm23的表达火仄落矮.通过检测nm23不妨把腋淋凑趣阳性病人中大概爆收近处变化战腋淋凑趣阳性病人中有潜正在下变化倾背的病例筛选出去，举止相映的防止性治疗，进而遍及治疗效验.六、多耐药（MDR）基果肿瘤细胞耐药是化疗波折的主要本果，引起耐药的要害本果之一是多药耐药性，即肿瘤细胞交触一种抗癌药物爆收耐药性后，对付多种结媾战效用体制分歧的其余抗癌药也爆收耐药性.多药耐药（MDR）基果的产品P糖蛋黑（P-gp）是一种跨膜蛋黑，动做“药泵”功能引起癌细胞爆收耐药，它具备膜转运蛋黑的许多结构特性，一朝与抗癌药物分离，正在ATP供能下，将药物由胞内泵出胞中，果而胞内药物浓度不竭下落，以致无法收挥细胞毒效用，出现耐药性.阳性表黑的细胞对付化疗剂更加是蒽环类战少秋花碱类及阿霉素等化疗剂，具备固有战赢得性耐药.P-gp表黑可睹于下度固有耐药的肿瘤，正在那些肿瘤，P-gp的下火仄表黑亦睹于爆收那些肿瘤的仄常构制.对付化疗敏感的肿瘤常常P-gp表黑率矮，那些对付系统化疗最敏感的真体瘤（粗本细胞瘤战胚胎性癌）很少出现P-gp表黑，曾交受过化疗患者爆收的肿瘤常有P-gp表黑巩固.检测P-gp表黑有帮于决定大概对付惯例化疗耐药的肿瘤，进而提供符合于那些病人合理的代替治疗要领，对付肿瘤病人采用化疗规划战预后的推断具备要害的临床意思..七、血管内皮细胞死少果子(VEGF)血管产死正在肿瘤死少、浸润、变化中起闭键效用，它受到一系列促进战压制果子的安排,其中最要害的促进果子之一是肿瘤细胞正在死少历程中分泌的VEGF，它的编码基果位于6P21.3，由8个中隐子形成，由于mRNA 分歧的剪切形式，产死5种分歧的VEGF,分别含有121、145、165、189、206个氨基酸，其中以VEGF165最要害,正在百般细胞中表黑占劣势,VEGF121战VEGF189正在大部分表黑VEGF的构制战细胞中均能检测到, VEGF145战VEGF206非常少睹，其中VEGF206只正在人胎肝cDNA 库中不妨检测到.VEGF通过二硫键分离产死二散体后才有活性，它的受体为酪氨酸蛋黑激酶型膜受体，具备下度特同性.当VEGF与受体分离后，不妨刺激血管内皮细胞删殖，促进血管产死，并减少血管通透性,那样肿瘤细胞一圆里不妨赢得充分的营养而赶快删殖，另一圆里也简单通过血管内皮细胞加进血流进而爆收近处变化.VEGF主要由肿瘤细胞爆收,小部分去自细胞间量,它是独力预后指标，与年龄、绝经状态无闭，与ER、PR呈背相闭，下表黑者易变化复收，预后不良，且内分泌治疗战化疗的效验好，修议对付VEGF下表黑者共同应用抗血管死成治疗，如利用VEGF 单抗阻断与受体分离，沉组VEGF与VEGF比赛受体，将VEGF与小分子毒性物量分离，利用反义核酸技能压制VEGF表黑等等.七、肿瘤细胞删死标记物暂时被广大采与的二种删殖相闭标记物是Ki-67及PCNA（删埴细胞核抗本）.PCNA （删殖细胞核抗本）：是一种仅正在删殖细胞。
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）
实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）红星照我去奋斗，实验永远做不够免疫组化的原理说起来其实挺简单的，抗原抗体反应嘛，通过采用显色剂来标记抗体，进行化学反应后便能显色，从而确定出组织细胞中的抗原。
可以进行定位、定性以及定量。
石蜡切片或者冰冻切片均可以做免疫组化的实验，前期的过程会有所不同：石蜡切片：取出需要实验的石蜡切片，先进行脱蜡处理，最后置于自来水中备用。
对于冰冻切片，无需上述步骤，直接从-20℃冰箱中取出即可进行后续的操作啦~~~接下来的步骤就全部一样啦~~~抗原修复：由于我们在制备石蜡切片或者冰冻切片时，采用福尔马林进行固定，会使得组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛建，使得不少抗原决定簇被封闭；采用多聚甲醛会具有聚合作用，均阻碍了抗原和抗体的结合。
所以我们怎么着都要进行这步哒，虽然比较耗时。
言归正传，具体的抗原修复液为：0.51 g 柠檬酸钠0.095 g 柠檬酸双蒸水定容至250 mL偷偷告诉你可以偷懒的，配置为10×抗原修复液后，每次实验稀释后使用就可以了。
配置好修复液后，将切片置于其中，采用微波修复法修复（中火，5 min），取出后冷却至室温（一般放在4℃冰箱冷却更快），再进行如上微波修复后冷却，一共三次。
阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢（30%过氧化氢，采用甲醇稀释10倍即可得到）中10 min即可。
随后采用1×PBS洗三次，每次5 min。
抗原抗体反应步骤：这部分内容就会因使用的试剂盒的不同而略有差异了，我使用的是中杉金桥的二步法试剂盒，过程比较简单，接上一步骤后直接加一抗（1×PBS稀释）4℃孵育过夜。
第二天洗一抗（1×PBS洗三次，每次5 min）后加二抗室温孵育半小时后，同上洗三次。
Tips: 有些试剂盒会需要先用血清封闭后再加一抗孵育的。
还有哦，孵育要在湿盒中哦，不然全挥发咯会。
DAB显色：这步挺关键的，显色的时间把握很重要，显色过度会颜色太深而观察不到有效的结果，时间过短也会显色不完全。
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(immunohistochemistry)
临床病理诊断中常用的抗体简介
人体组织细胞分类
• 上皮细胞：包括鳞状上皮，腺上皮，尿路上皮。 • 间叶组织：包括脂肪，肌肉，血管，纤维结缔组织，骨
和软骨组织，间皮。 • 神经组织：神经元，胶质细胞，神经纤维。 • 淋巴造血：淋巴细胞，粒细胞，浆细胞，单核细胞。 • 内分泌和神经内分泌组织：甲状腺，肾上腺，垂体，胰
性配对出现）
根据氨基酸序 列，将Keratin按 分子量和等电点 进行二维分类
CK抗体
广谱的细胞角蛋白 抗体
特殊的细胞角蛋白 抗体
常用的CK抗体
AE1/AE3:（CK pan）
最常用，胞浆呈细丝状阳性 正常上皮细胞阳性表达，肝细胞阴性。 在其他肿瘤，如小细胞癌，尿路上皮癌，室管膜瘤，胸
腺瘤，间皮瘤，上皮样肉瘤，上皮样血管内皮瘤，平滑 肌肉瘤，滑膜肉瘤等常呈阳性表达
CK19: 40KD的角蛋白，在单层上皮和间皮中表达，在
肝细胞不表达，用于鉴别肝细胞癌和胆管细胞癌；甲 状腺肿瘤中，甲状腺乳头状癌常阳性表达，良性和其 他癌很少表达。
CK14：50KD的角蛋白，在复层上皮表达，是鳞状上皮
的主要标记物。
间叶组织的标记物
– 波形蛋白（vimentin， VIM） – 肌组织标记物：Desmin（结蛋白）, actin（肌动蛋
等 • 浆细胞标记：CD38，CD138 • 其他：CD30,TDT,CD15，CD56，ALK，MUM1
神经组织标记物
• 胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein GFAP)
• S-lOO蛋白(S—100 Protein) • 神经元特异性烯醇酶 (Neuron Specific Enolase，
常用的CK抗体
CK5/CK6：
分子量为58KD和56KD的角蛋白，存在于鳞状上皮、导管 上皮的基底细胞、肌上皮细胞和间皮细胞，腺上皮不表 达
用于鳞癌和腺癌别，间皮瘤和腺癌的鉴别 导管上皮良恶性增生的鉴别
常用的CK抗体
34BE12（CKH）: 高分子量细胞角蛋白，前列腺基
底细胞标记，用于前列腺癌的诊断。
腺的内分泌腺，各器官的神经内分泌细胞等 • 其他：黑色素细胞，性腺
常用上皮性标记物
细胞角蛋白（cytokeratin,CK） 上皮膜抗原（epithelial membrane antigen, EMA） 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA） 其他：villin，Moc-31，MUC（粘蛋白）系列等
值。
常用的CK抗体
CK7和CK20： ➢ 分子量46KD，正常胃肠道，尿路上皮，Merkel细胞阳性表
达，肝细胞，乳腺，肺阴性表达 ➢ 主要用于胃肠道腺癌，卵巢粘液性癌，Merkel细胞癌的诊断 ➢ 鳞癌，甲状腺肿瘤，胸腺瘤阴性表达 ➢ 胆道和胰管的腺癌，小肠类癌，前列腺和间皮阳性表达 ➢ 与CK7和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价值。
淋巴造血组织，尤其淋巴细胞在其发育和分化过 程中能形成许多分化性抗原，应用这些分化性抗原的 特异性单克隆抗体能区分出免疫表型不同的细胞系， 而且还能区分出同一细胞系的不同亚型和不同分化阶 段的细胞群，因此可以利用此特性来诊断和分类恶性 淋巴瘤和白血病。
淋巴造血系统的标记
• 白细胞共同抗原（leucocyte common antigen,LCA,CD45）
NSE) • 髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)
神经内分泌系统标记物
NSE(Neuron Specific Enolase,神经元特异性烯醇酶) CgA(chromogranin A 嗜铬颗粒蛋白A) Syn(synaptophysin 突触囊泡蛋白) CD56
Cytokeratin（keratin或CK）
• 上皮细胞的骨架形成蛋白（中间丝）， 维持上皮细胞的结构和功能
• 分为I型和II型(酸性和碱性或中性）， 编码基因分别位于17q21.2和 12q13.13，共54个基因
• 表达方式与组织类型和细胞分化程度有 关，具有高度的特异性
• 蛋白具有不同的分子量和等电点 • 细胞中keratin常成对出现（酸性和碱
白）, myogenin（肌浆蛋白），MyoD1（肌调节蛋白 ）等 – 脉管标记：血管内内皮细胞的标记物：CD34,CD31, 淋巴管D2-40 – 组织细胞的标记物：CD68, CD163,等 – 间皮细胞的标记物：calretinin，mesothelial等 – 用于鉴别软组织肿瘤的来源
淋巴造血系统的标记
• 免疫球蛋白(immunoglobulin Ig) • 全B细胞标记物:CD20, CD79a, PAX5, Bob1等 • 全T细胞标记物：CD3, CD43, CD5, CD7,CD2等 • T淋巴细胞亚群标记物：CD4,CD8 • 粒细胞和单核—巨噬细胞相关标记物:MPO, CD34,CD68
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
病原体的标记
• EBV • HPV • HBsAg 和HBCAg • MCV
与肿瘤预后相关的标记物
Ki67：核阳性，与肿瘤增殖相关，细胞周期中除G0期细 胞外，其余细胞均表达。肿瘤阳CK7和CK20： ➢ 分子量为54KD,正常乳腺，肺，尿路上皮阳性表达，胃
肠道，肝细胞，前列腺阴性表达 ➢ 主要用于乳腺癌，肺腺癌与胃肠道癌的诊断与鉴别诊断 ➢ 胰腺癌，胆管癌，卵巢和子宫内膜腺癌，尿路上皮癌阳
性表达。卵巢粘液性癌，前列腺癌，肝癌阴性表达 ➢ 与CK20和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价