冰冻切片免疫组化步骤

合集下载

实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）

实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）免疫组化的原理说起来其实挺简单的，抗原抗体反应嘛，通过采用显色剂来标记抗体，进行化学反应后便能显色，从而确定出组织细胞中的抗原。

可以进行定位、定性以及定量。

石蜡切片或者冰冻切片均可以做免疫组化的实验，前期的过程会有所不同：石蜡切片：取出需要实验的石蜡切片，先进行脱蜡处理，最后置于自来水中备用。

对于冰冻切片，无需上述步骤，直接从-20℃冰箱中取出即可进行后续的操作啦~~~接下来的步骤就全部一样啦~~~抗原修复：由于我们在制备石蜡切片或者冰冻切片时，采用福尔马林进行固定，会使得组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛建，使得不少抗原决定簇被封闭；采用多聚甲醛会具有聚合作用，均阻碍了抗原和抗体的结合。

所以我们怎么着都要进行这步哒，虽然比较耗时。

言归正传，具体的抗原修复液为：0.51 g 柠檬酸钠0.095 g 柠檬酸双蒸水定容至250 mL偷偷告诉你可以偷懒的，配置为10×抗原修复液后，每次实验稀释后使用就可以了。

配置好修复液后，将切片置于其中，采用微波修复法修复（中火，5 min），取出后冷却至室温（一般放在4℃冰箱冷却更快），再进行如上微波修复后冷却，一共三次。

阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢（30%过氧化氢，采用甲醇稀释10倍即可得到）中10 min即可。

随后采用1×PBS洗三次，每次5 min。

抗原抗体反应步骤：这部分内容就会因使用的试剂盒的不同而略有差异了，我使用的是中杉金桥的二步法试剂盒，过程比较简单，接上一步骤后直接加一抗（1×PBS稀释）4℃孵育过夜。

第二天洗一抗（1×PBS洗三次，每次5 min）后加二抗室温孵育半小时后，同上洗三次。

Tips: 有些试剂盒会需要先用血清封闭后再加一抗孵育的。

还有哦，孵育要在湿盒中哦，不然全挥发咯会。

DAB显色：这步挺关键的，显色的时间把握很重要，显色过度会颜色太深而观察不到有效的结果，时间过短也会显色不完全。

切片、免疫组化步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。

取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。

冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。

也可根据需要选择其它的固定方式。

PBS洗，5分钟×3。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×3。

下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。

2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。

4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5. PBS冲洗，2分钟×3次。

6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

7. PBS冲洗，2分钟×3次。

8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

9. PBS冲洗，2分钟×3次。

10. 显色剂显色（DAB或AEC）。

11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。

免疫组化实验步骤及配方

免疫组化步骤1. 多聚甲醛灌流取材,多聚甲醛后固定,30%多聚糖溶液沉糖;2. 冰冻切片1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm3. 0.01MPBS 洗10min ×3次;4. 1NHCL 暴露抗原30min ；5. 去离子水洗,0.01MPBST 洗10min ×3次；6. 3%双氧水0.01MPBS 配制洗10min,灭活内源性HRP ；7. 0.01MPBST 洗10min ×3次；8. 5%-10%血清封闭30min0.01MPBST 配制；9. 一抗过夜,一抗用PBST 稀释；10.0.01MPBS 洗10min ×3次,二抗3孵育小时； 11.0.01MPBS 洗10min ×3次,HRP-亲和素3小时； 12. 0.01MPBS 洗10min ×3次,DAB 显色12-18min.免疫组化常用试剂配制1. 0.1MPB:14.5gNa 2HPO 4·12H 2O500mLH 2O1.5gNaH 2PO 4·2H 2O2. 0.1MPBS:500mL0.1MPB45gNaCl3. 0.01MPBST:100mL0.01MPBS10滴TritonX-1004.INHCL:盐酸：水=1：105.4%多聚甲醛：13.6gKH 2PO 43.6gNaOH40g 多聚甲醛1000mLH 2O注：1.需要60°C 加热溶解,过滤使用；2.多聚甲醛每次比需要多称10g,以弥补后面过滤的损失；3.现将多聚甲醛溶于1000mL 水中,然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH,待NaOH 和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH 2PO 4,溶后过滤备用.6.DAB 液：以0..1MPB 配制,DAB 浓度0.05%,H 2O 2浓度0.03%.注：1.H 2O 2临用时再加；2.用DAB 染后用0.01MPB 洗.7.30%蔗糖：150g 蔗糖500mL4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定.8.封闭液：10%山羊血清做免疫荧光时另加0.1%BSA.。

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。

该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。

本文将详细介绍这些步骤。

二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。

比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。

2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。

固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。

3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。

脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。

4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。

三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。

这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。

2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。

这一步需要注意，避免样品受到外界污染。

四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。

这一步可以通过加热或酶解等方式实现。

2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。

常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。

3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。

这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。

4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。

观察过程需要使用荧光显微镜进行。

五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。

该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。

在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。

免疫组化的原理及试验步骤

免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。

2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。

冰冻切片免疫组化

冰冻切片免疫组化步骤
1.从-20°取出片子平衡到室温
2.PBS洗2min 3遍
3.0.3%H2O2 10min（避光）--用PBS将30% H2O2稀释100倍
4.PBS洗2min 3遍
5.10%FBS封闭30-60min（室温）；可以配置10%FBS约10ml，用PBS稀释
6.一抗（10%FBS配置），60min，室温孵育（注意封闭后不用洗！）
7.PBS洗2min 3遍
8.1‰链霉素（带HRP）30min 室温孵育，同样链霉素用10%FBS稀释；若为二抗则也是
用10%FBS稀释，接着孵育半小时。

9.PBS洗2min 3遍
10.将玻片擦拭干净，带组织部分保持湿润，DAB显色（bufferA 1ml + bufferB 1滴），用1ml
枪加在载玻片后，进行镜下观察，待特异性蛋白显色适当时，用PBS洗去DAB。

11.苏木素2min （待染色效果改变颜色）
12.1‰盐酸乙醇分化（迅速刷三次）
13.PBS水中洗净有机溶剂
14.75%、80%、95%、100%酒精脱水
15.二甲苯2min
16.二甲苯2min
17.中性树脂封片
Ps:盖玻片先用盐酸乙醇刷一下，然后用水洗干净，最后泡在二甲苯里，在封片前用无尘纸头擦干净，再封片。

说明一抗配置，如果一抗为100ug（RD）则可以加入100ul的pbs，使浓度在1ug/ul，同时分装抗体。

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。

它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。

本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。

步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。

2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。

步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。

2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。

3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。

步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。

2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。

3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。

这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。

2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。

步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。

2.孵育时间通常为30分钟至1小时。

步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。

2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。

步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。

2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。

步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。

步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。

（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。

冰冻切片的免疫组化染色

冰冻切片的免疫组化染色1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6 m。

2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。

5. PBS 洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔既抗原修复)。

6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光。

7. 用PBS 洗2次,每次5分钟。

8．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。

9．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2 小时（也可置于4℃冰箱过夜）。

10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

11．滴加二抗（辣根过氧化物酶标记）， 37℃，40 分钟。

12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

15．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。

16．自来水（细水）充分冲洗。

17．苏木素复染，室温，1-5min，自来水冲洗。

（时间可调节，最好在镜下观察，核染上就好不要过染）。

18．自来水冲洗返蓝，15 分钟。

(可调节)19．梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

20．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各5 分钟21．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。

备注：若用DAB呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

若用AEC，则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（例如明胶甘油）封片。

免疫组化步骤

免疫组化步骤
切片准备
石蜡切片：3微米，漂片50度烘片70度30分钟
二甲苯2 次每次5分钟
梯度酒精：无水酒精2道，95% ，85%各一道多浸几下
自来水水洗数分钟，双蒸水数下
冰冻切片：丙酮固定5分钟，干燥后水洗
抗原修复
高压锅沸腾抗原修复液（柠檬酸、柠檬酸钠）喷气1分钟自来水降温后开盖
双蒸水数下
内源性过氧化物酶阻断
甲醇300 毫升双氧水10 毫升15分钟
流水中冲洗3-5分钟双蒸水几下PBS洗5分钟
画圈加BSA 或胎牛血清5% 20 分钟
甩掉后，直接加一抗37度60分钟甩一张加一张
PBS 洗4遍
二抗37度40分钟
PBS 洗3遍
加DAB 显色变色即停
PBS 洗
苏木素10秒至30秒返蓝
无水乙醇2道
封片。

冰冻切片免疫组化流程

冰冻切片免疫组化流程冰冻切片免疫组化听起来就很厉害的样子呢！其实呀，这个流程还挺有趣的哦。

一、切片准备。

咱们先得有冰冻切片呀。

这切片可得小心对待呢。

一般从冰箱里拿出来的时候，要赶紧放到合适的环境下，可不能让它在不合适的温度里待太久啦，不然它可能就会变得不那么听话了。

这个切片的厚度也是有讲究的哦，太薄了可能会丢失一些重要的信息，太厚了又可能会影响后面的操作。

就像我们穿衣服，太薄了冷，太厚了又热得难受呢。

二、固定。

三、通透。

通透这一步也很关键呢。

它就像是给切片开一些小通道，让后面我们加进去的各种试剂能够顺利地进去和切片里的东西打交道。

这就好比是我们要去一个神秘的城堡，得先找到进入城堡的通道一样。

如果通透没做好，那些试剂就只能在外面干着急，进不去，就没办法完成它们的使命啦。

四、封闭。

封闭就像是给切片做一个保护罩，同时又能把那些不需要的干扰因素给排除掉。

就像我们在一个嘈杂的环境里，戴上隔音耳罩，只让我们想听的声音进来。

如果封闭没做好，可能就会有一些乱七八糟的东西来干扰我们的检测，就像在听音乐的时候有很多噪音一样讨厌。

五、一抗孵育。

然后就是一抗孵育啦。

一抗就像是我们派去寻找目标的小侦探。

我们把一抗加到切片上，让它在切片里到处找我们想要检测的东西。

这个过程就像是小侦探在城堡里寻找宝藏一样，得给它足够的时间和合适的环境，这样它才能把宝藏找出来哦。

六、洗涤。

洗涤这一步可不能小看呢。

就像我们每天都要洗脸刷牙一样，切片也需要清洗干净。

把那些没有结合的一抗或者其他杂质都洗掉，这样才能让后面的步骤顺利进行。

要是不洗干净，就像脸没洗干净就出门，总是感觉脏脏的，而且会影响后面的检测结果呢。

七、二抗孵育。

八、再次洗涤。

又要洗涤啦，还是和之前一样，要把多余的东西都洗掉，让切片清清爽爽的。

九、显色。

最后就是显色这一步啦。

这就像是把我们找到的宝藏展现出来一样。

通过显色，我们就能看到我们想要检测的东西在切片上的位置啦。

这个时候就像是我们的努力有了成果，看到那些颜色出现，心里还挺有成就感的呢。

冰冻切片漂片

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。

6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。

7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。

一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。

8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。

干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。

9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。

如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。

免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。

冰冻切片免疫组化步骤

孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。
浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。
染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。
封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或的材料
APES包被的载玻片
PBS（pH7.4）
4%多聚甲醛
PBST（含Tween-20）
PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸）
2.冰冻切片
取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。
切片厚度4-8um(5um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。
切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。
3.免疫组化染色步骤
固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。
打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25%TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。
封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。

取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。

冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。

也可根据需要选择其它的固定方式。

PBS洗，5分钟×3。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×3。

下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。

2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5. PBS冲洗，2分钟×3次。

6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

7. PBS冲洗，2分钟×3次。

8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

9. PBS冲洗，2分钟×3次。

10. 显色剂显色（DAB或AEC）。

11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

冰冻切片免疫组化

冰冻切片免疫组化 The document was prepared on January 2, 2021
1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟（另：丙酮先在-20C 预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化），PBS洗，5分钟×3。

2 用3％（另 %）过氧化氢孵育5~10分钟（另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。

此配方不易产生脱片。

配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制），消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×2。

3 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5 回收一抗，PBS冲洗，5分钟×3次。

6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

7 PBS冲洗，5分钟×3次。

8 显色剂显色（DAB或AEC）。

10 自来水充分冲洗，复染，封片。

如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话，建议还是抗原修复效果比较好，如果没在甲醛中浸泡，无需抗原修复。

如果你的片子切完后在冰箱中保存的话，做之前，从冰箱取出后先室温半小时，然后入37℃烤箱一小时，再进行免疫组化实验，掉片现象会少一点。

我们以前片子从-20℃取出后，接着就做免疫组化，片子掉得很多。

免疫组化方法(冰冻切片)

免疫组化方法（冰冻切片）A.所需溶液和试剂1.二甲苯2.无水乙醇（100% 和 95%，变性无水乙醇，组织学级）3.苏木精（可选）4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a.10%中性福尔马林b.丙酮c.甲醇d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。

5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。

用浓盐酸将pH调节到7.6。

6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。

100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。

7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。

保存在-20°C。

8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。

9.配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

10.检测系统：根据厂家说明书使用。

已有的检测系统*。

11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B.切片1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。

这可以避免切片时样品断裂。

2.将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。

3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。

（这有助于切片贴紧玻片）C.固定注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。

a.10%中性福尔马林：室温10分钟。

立即进行染色操作。

b.冰丙酮：-20°C 10分钟。

风干。

立即进行染色操作。

c.甲醇：-20°C 10分钟。

立即进行染色操作。

免疫组化基本操作流程

免疫组化基本操作流程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平、定位以及相互作用。

以下是免疫组化基本的操作流程：1.组织固定首先，需要对待检测的组织进行固定。

最常用的方法是将组织置于10%的缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24-48小时。

这个步骤的目的是保持组织的形态结构和维持蛋白质的空间位置。

2.制作切片将固定的组织切成5-10微米厚度的切片。

通常使用旋转切片机或者冰冻切片技术来进行切片。

切片后将其放置在载玻片上，通常是带有阳离子的载玻片，如聚胺脂涂层载玻片。

3.抗原恢复固定的组织样本通常会导致部分蛋白质的变性，从而减少抗体的结合能力。

为了恢复这些变性蛋白质的免疫原性，可以进行抗原恢复步骤。

这个步骤通常涉及将切片加热到一定温度，使用酶处理或者盐溶液处理。

常用的抗原恢复方法包括热蒸汽煮沸法、酶消化法等。

4.阻断非特异结合在进行抗体结合之前，需要对样本进行非特异结合的阻断。

这个步骤的目的是防止抗体发生非特异性的结合，从而降低假阳性结果的产生。

通常使用牛血清蛋白（BSA）、奶粉或者干酪蛋白等蛋白质来进行非特异结合的阻断。

5.抗体染色接下来，将切片与目标蛋白质特异性的一抗体一起孵育。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体使用什么抗体取决于试验的目的。

抗体与样本中的特定蛋白质结合后，形成抗原-抗体复合物。

6.检测与显色为了检测抗原-抗体复合物的形成，需要进行二次抗体结合。

二抗与一抗结合，并且经常标记有荧光素或着色剂，用以可视化抗原-抗体复合物。

常用的二抗有荧光标记物（如荧光素、荧光染料等）或酵素标记物（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）。

7.盖片封装在检测和显色后，将玻片放在显微镜下进行观察和分析。

可以使用透明封装剂将玻片封装，以保护样本不受污染和光照损伤。

总结：免疫组化是一种重要的实验技术，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断。

它通过特异性抗体的结合能力来检测目标蛋白质的存在、定位和相互作用。

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。

它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。

以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。

2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。

3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。

4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。

脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。

2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。

抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。

2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。

阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。

一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。

一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。

2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。

4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。

5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。

洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。

2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。

可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。

2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。