细胞复苏及存活率测定
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞复苏标准操作规程
细胞复苏标准操作规程一、准备工作在进行细胞复苏之前，需要做好以下准备工作：1.准备细胞复苏所需器材和试剂，包括细胞培养瓶、细胞复苏试剂、培养基、离心管、移液管、离心机等。
2.清洗实验器材，消毒处理，确保无菌环境。
3.计算细胞复苏所需剂量和浓度，为后续操作做好准备。
二、细胞复苏前消毒在进行细胞复苏之前，需要对细胞培养基和器材进行消毒处理，以确保细胞生存环境的安全：1.将细胞培养基和器材放入高压锅中进行高温高压消毒。
2.清洗干净细胞培养瓶，确保无残留物。
3.加入适量细胞复苏试剂，以备后续使用。
三、细胞复苏细胞复苏是将冷冻保存的细胞进行复苏解冻的过程，具体操作如下：1.将细胞培养瓶放入37℃恒温水浴中，轻轻晃动培养瓶，使试剂与细胞充分接触。
2.放置于适宜温度下培养，一般需要培养至细胞融合完全。
四、细胞计数和存活率检测在细胞复苏后，需要对细胞进行计数和存活率检测，以了解细胞的生长状态和存活情况：1.收获培养好的细胞，用离心机进行离心分离。
2.计数细胞并检测存活率，可以使用血球计数板或流式细胞仪进行计数和存活率检测。
3.记录所得数据，包括细胞数量、存活率等。
五、细胞传代和扩增在细胞生长至融合完全后，可以进行细胞的传代和扩增，以获得更多的细胞数量：1.将部分细胞进行传代培养，加入适量细胞培养基，置入37℃恒温水浴中。
2.培养一段时间，至细胞融合完全。
3.继续进行细胞的传代和扩增，直至达到所需的细胞数量。
六、细胞质量检测在细胞传代和扩增过程中，需要对细胞的形态、结构和数量进行检测，以评估细胞的质量：1.观察细胞的形态和结构，包括细胞的形状、大小、边缘等特征。
2.对细胞的生长和繁殖情况进行观察和分析，包括细胞的分裂速度、生长曲线等。
3.通过检测细胞的各项指标，综合评估细胞的质量和适用性。
七、记录和整理在细胞复苏、传代和扩增过程中，需要对各项数据进行记录和整理，以便对细胞的生长状态和质量进行评估：1.对每一步操作进行详细记录，包括操作时间、操作人员、操作步骤等。
实验细胞复苏与计数
细胞生物学实验细胞复苏及细胞鉴别与计数一、实验目的1、掌握细胞复苏的基本方法；2、掌握用血球计数板进行细胞计数的方法；3、学习死活细胞的鉴别方法；二、实验原理原理：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。
不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。
1、复苏细胞原则：快溶。
防止在融化过程中已融解水渗透入细胞导致的二次结晶对细胞形成损害。
使培养物能快速通过对细胞有损害的－5～0℃摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。
2、台盼蓝染色：台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。
健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。
依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。
3、细胞计数方法：血球计数板和显微镜智洁计数。
血球计数板：由一块长约7.5cm，宽3.5cm的厚玻璃制成。
计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室的容积为 0.1mm3。
所以，可根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量。
细胞计数：细胞压格计上线不计下，计左不计右，如有少量两个以上细胞按一个细胞计数，如超过10%说明消化不充分。
三、实验步骤1、细胞复苏（1）准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯40℃的温水。
（2）从液氮中取出冻存管、迅速置于温水不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1分之内融化。
取出冻存管，用75%的酒精擦拭管口。
（3）将冻存管放入离心管中800r/pm离心10分钟，取出冻存管拿入超净台，75%酒精消毒管口，打开冻存管，弃掉上清液，沉淀加4ml的含10%FCS的DMEM培养基后吹打使细胞均匀，吸至一个25mL的细胞培养瓶中。
（4）另取9滴细胞悬液加入1滴0.4%台盼蓝染色,取80µl细胞液镜下观察活力。
细胞计数和存活率的测定
细胞计数和存活率的测定目的学会细胞计数和鉴别细胞死活的方法。
实验前的思考体外培养细胞常常需要测定细胞的培养密度，即单位体积内的细胞数，同时还需要鉴别细胞的死活，从而了解细胞的存活情况。
细胞密度测定最常用的工具是血球计数板，细胞死活测定的最简单方法是染料排斥法，常用鉴别染料为台酚蓝。
材料器具蟾蜍或小白鼠的骨髓细胞；显微镜，血球计数板，吸管，培养皿，试管，软布或擦镜纸；0.4%台酚蓝染液，两栖动物生理盐水（0.65%氯化钠溶液）或哺乳动物生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。
步骤1.制备骨髓细胞悬液具体方法参见第660页实验“赡蜍骨髓细胞染色体的制备”。
2.细胞计数准备取一副血球计数板，用软布或擦镜纸擦净，把盖玻片盖在血球计数板中央的计数室上。
把上述制得骨髓细胞悬液摇匀，用吸管吸取少量细胞悬液轻轻地滴在计数室边缘的斜面上，让它自然地流入盖玻片下的空隙，均匀地充满在计数室内。
悬液不能过多或过少，过多会使盖玻片浮起，过少会出现空隙或气泡。
如果有上述现象必须洗去，擦干重做，否则会影响计数准确性。
3.细胞计数方法静置2～3分钟，待细胞在计数室下沉后，在低倍镜下计数（详见本书第777页实验《血细胞的计数》。
4.细胞存活力鉴别取0.5毫升骨髓细胞悬液放入小试管里，再加0.4%台酚蓝染液0.5毫升，用吸管轻轻吹打混匀，染色2～3分钟。
然后把悬液摇匀，吸取悬液滴一滴在干净载玻片上，加盖玻片，在低倍镜下，随机计数上、下、左、中、右五个视野内的细胞总数和被染成蓝色的细胞数，蓝色细胞为死细胞，按以下公式计算细胞存活率：上述细胞计数和细胞存活力测定也可以合并在一起做。
分析和讨论1.细胞计数时，应该先调焦，看清计数板上的格线。
细胞密度太高时，计数不便，应该先把原液稀释若干倍后再计数，随后把测得结果乘以稀释倍数即为原液细胞密度。
计数时，以每大格点数在几十到一百多为宜。
2.台酚蓝染液一般不能渗透到活细胞里，所以活细胞不会着色。
但是如果延长染色时间或提高染液的浓度，造成活细胞膜损伤时，活细胞也可着色。
细胞复苏及存活率测定
细胞工程实验报告实验课程：细胞工程实验内容：细胞复苏及存活率测定一实验目的1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。
2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。
二实验原理在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
血球计数板：血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。
H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。
计数室：每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）三、主要仪器试剂设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、离心管等。
试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。
四实验步骤（复苏）●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。
●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。
（细胞死活鉴定及计数）➢用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
➢取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
➢如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
细胞计数与存活的测试实验方法
细胞计数与存活的测试实验方法细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。
那么细胞计数与存活的测试实验方法有哪些呢？1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。
使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。
计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。
细胞计数及细胞活力检测
细胞计数
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
1.将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上；
2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；
3.静置3分钟；
4.镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的,然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×稀释倍数×104
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
细胞计数板
细胞活力测定
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。
复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。
1.将细胞悬液以0.5ml加入试管中；
2.加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟；
3.死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
细胞存活率为：活细胞数÷总细胞数×100％。
注意：活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
细胞培养流程
细胞体外培养实验流程一、细胞复苏1.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;2.灼烧离心管管口、塞子和滴管,用滴管取5mL培养基加入离心管中;3.戴好防护用具,从液氮中取出冻存管后立即放入37℃水浴箱中,轻轻摇晃冻存管,保证细胞1min内融化;以75%酒精擦拭冻存管外部,移入无菌工作台;4.用吸细胞液的从冻存管中将细胞悬液完全吸出加入到已装有培养基的离心管中,塞子塞离心管,2000rpm,离心4min,弃上清;5.往离心管中加培养基含FBS5mL,用吸细胞悬液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,将离心管中的细胞悬液全部吸出加入到培养瓶中,培养瓶平放,轻轻晃动,使细胞均匀贴壁,标记好细胞名称、日期、培养人,放入37℃,5%的CO2恒温培养箱培养;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.离心时转速太高,离心时间过久都易对细胞造成伤害;2.滴管一定要严格分开,不能混用,防止细胞污染;3.DMSO常温下对细胞毒性较大,故冻存细胞复苏后应立即洗涤冷冻保护剂;二、细胞换液1.将培养瓶从CO2培养箱中取出,倒置显微镜下观察细胞生长状态判断生长情况,并确证未发生污染后转入无菌操作台内;2.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;3.酒精灯外焰灼烧培养瓶瓶口、瓶塞和滴管,培养瓶倾斜,吸出旧液,尽量吸净;4.吸取培养基含FBS5mL,加到培养瓶中FBS终浓度为10%;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次,再加培养基;5.将培养瓶与瓶盖过火,旋紧瓶塞后回旋半圈,平放回CO2培养箱;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.打开和盖紧培养基、培养瓶前后均需旋转灼烧瓶口和瓶盖;2.各滴管一定要严格分开,不能混用;3.将PBS注入到培养瓶中,应将液体打到没有细胞的那一面;4.培养液以没过细胞为宜;5.细胞溶液变黄或死细胞过多时换液;6.倒掉培养瓶中的培养液,瓶口应尽量远离废液缸,以免造成污染三、细胞计数和活力测定一细胞计数细胞数/mL=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数1.紫外照台30min,75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板,用干纱布或棉签再擦一遍,放好盖玻片;2.用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中吸出少许,滴加在盖玻片边缘,使悬液充满盖玻片和计数板之间,静置3min;3.观察计数：压线的记左不计右,记上不记下,成团细胞只记为1个;先用4×倍镜找出大位置,再用10×镜计数;4.计数完用75%酒精棉签擦洗盖玻片和计数板;二细胞活力测定1. 紫外照台30min,吸取细胞悬液加入试管中;2. 加入%台盼兰染液,染色2～3min;3. 吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片;4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力;死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状;注意：1.细胞计数时盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边凹槽中;2.活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用;四、细胞传代1.配完全培养基：基础培养基:FBS=1:92.取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代 ;3.紫外照台30min,75%酒精擦拭双手,将预热后的培养基、PBS、胰酶培养基等用酒精擦拭后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台;4.点燃酒精灯,将培养瓶用75%酒精擦拭后移入工作台,将瓶口和瓶盖过火灼烧;5.在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,用适量PBS清洗细胞表面,并弃去PBS;6.加入1mL %胰酶消化细胞,此时可将细胞置于37℃细胞培养箱内消化;胰酶以铺平培养瓶底部为宜;倒置显微镜下观察,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度一般2-5min;立即弃去消化液加入3mL完全培养基终止消化;注意更换吸管7.用吸细胞液的滴管轻柔吹打,保证培养瓶底的每个角落都吹打到,斜坡处不能忽略,把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入离心管中,再用滴管吹打混匀细胞悬液;8.取一滴细胞悬液进行计数,计算好细胞传代培养时稀释倍数细胞传代密度不低于5×105个/mL;9.传代：先用滴管吹打混匀细胞悬液,按一定比例稀释,标记好细胞名称,传代培养时间,培养员,细胞个数,平放入CO2培养箱继续培养;10.收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台;附：培养细胞若需给动物注射,在消化后用PBS清洗3-5次后收集细胞并计数,用PBS清洗细胞是为防止给动物注射时残留的FBS造成动物炎症;注意：1. 对于难消化的细胞在用胰酶消化前,先用1～2mL 4 ℃PBS冲洗一遍,较易消化的细胞不需要此步骤;2. 一定要防止细胞过消化因过消化,使细胞成团,不均匀,且对细胞伤害很大,影响细胞贴壁和导致生长状态差等;过消化特征：a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落,胰酶里出现很多悬浮物,为掉下来的细胞;b.培养瓶底板上本身为白茫茫细胞贴壁生长,而过消化后细胞脱壁掉下来,则可见培养瓶底板有一片片空隙;出现过消化时立即加入含FBS的培养基终止消化;3. 把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时,每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体,以防止细胞成团不均,用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害,影响在培养瓶中生长;5. 一般细胞生长铺至瓶底约80%,则可传代或用来做实验,否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化,不易用于后续实验;五、细胞冻存1.选对数增生期细胞证明无支原体污染,在冻存前1天换半量或全量培养基;与冷冻细胞应生长良好且存活率高,约为80-90%致密度;2.配制冷冻保存溶液使用前配制：另取一离心管,加入培养基、FBS10%,逐滴加入二甲基亚砜DMSO至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用; 3.依细胞传代培养的操作,收集细胞于离心管中,取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率,一般细胞冻存浓度为1-5×106个/mL;4.离心管管口和管塞过火灼烧,塞好后,2000rpm离心4min,去上清,加适量完全培养基,混匀;5.取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液DMSO最后浓度为5～10％,使细胞浓度为1～5×106cells/mL,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1～2mL/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测;严密封口后,注明细胞名称、代数、日期;6.4℃静置10min,-20℃静置30min,-80℃过夜放置,液氮槽冷冻保存;。
动物细胞的死活鉴定和存活率的测定
（二）、动物细胞的死活鉴定和存活率的测定一、实验目的及原理1、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
2、学习用血球计数板进行细胞计数，以测定动物细胞存活率的方法。
原理：在显微镜下，从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
二、实验材料试剂血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、电吹风、0.25%胰蛋白酶液、PE液、MEM+小牛血清培养液、0.4%台盼蓝三、主要操作步骤（一）细胞悬液的准备1、75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。
2、将前一实验传代培养的细胞培养液倒入一个小试管中，暂存。
3、向培养瓶内加入5ml PE液，平放轻摇，放置2～5分钟后倒掉。
4、向培养瓶内加入0.5～o.8ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置2～４分钟后倒掉。
拍打悬浮后，再将暂存的细胞培养液倒入，制备成单细胞悬液, （内含活细胞和死细胞）。
（二）细胞死活鉴定及计数1、用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
2、取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
3、向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。
4、显微镜下观察和计数。
活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。
分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。
（三）数据的统计活（死）细胞数（个/ml）=8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ⨯104⨯稀释倍数细胞存活率%=（活细胞数/细胞总数）⨯%四、实验结果第一个平台，四个角的活细胞数分别为9,10,7,12；死细胞数分别为2,2,3,1.第二个平台，四个角的活细胞数分别为11,7,9，10；死细胞数分别为3,2,2,2.五、思考题解答与讨论计算培养瓶中活（死）细胞数（个/ml），计算细胞存活率%。
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
快速检测细胞存活率的方法
快速检测细胞存活率的方法细胞存活率的检测在生物学研究和临床实践中具有重要意义。
传统的细胞存活率检测方法通常涉及复杂的操作步骤和耗时的分析过程，不适用于快速筛查和高通量实验。
因此，发展一种快速、简便且准确的细胞存活率检测方法具有重要的研究和应用价值。
细胞膜完整性是细胞存活与否的重要指标之一。
当细胞膜完整时，细胞内的染料无法进入细胞内部，从而形成相对较弱的荧光信号。
而当细胞膜破损时，染料可以进入细胞内部，形成相对较强的荧光信号。
基于这一原理，我们可以利用染料与细胞膜的相互作用来快速检测细胞存活率。
一种常用的方法是利用细胞膜不可透性的染料如Trypan Blue或Propidium Iodide。
这些染料可以通过细胞膜破损的部位进入细胞内部，与细胞核酸结合并发出荧光信号。
通过检测染料的荧光强度，我们可以判断细胞膜的完整性，从而间接反映细胞的存活率。
这种方法简便易行，但需要对染料浓度和染色时间进行优化，以避免染料自身对细胞的毒性影响。
另一种常用的方法是利用细胞膜通透性的染料如Calcein-AM和Ethidium Homodimer-1。
Calcein-AM可以通过细胞膜进入细胞内部，在细胞内被酯酶水解释放出荧光信号。
而Ethidium Homodimer-1只能通过细胞膜破损的部位进入细胞内部，并与细胞核酸结合发出荧光信号。
通过同时检测这两种染料的荧光强度，我们可以快速准确地判断细胞的存活率。
除了染料法，还可以利用细胞内酶的活性来检测细胞存活率。
比如，细胞存活率试剂盒中常用的细胞酶活性检测法。
这种方法通过测量某些细胞内酶的活性来反映细胞的存活状况。
细胞酶活性检测法可选择的酶包括乳酸脱氢酶（LDH）、细胞色素C等。
这些酶在细胞膜完整时位于细胞内，而在细胞膜破损时释放到培养基中。
通过测量培养基中酶活性的变化，可以快速准确地评估细胞的存活率。
细胞存活率的快速检测方法在细胞培养、药物筛选、细胞毒性测试等领域具有广泛的应用前景。
细胞培养操作及其注意事项
六、操作完处理
• 1.试剂瓶瓶口喷酒精，用封口膜封住后，拿回冰箱应该放置的位置。 • 2. 清理工作台面，并用酒精消毒。下拉门，开紫外照射一般30分钟。 • 3. 垃圾袋封口，拿出高压蒸气灭菌（如果有感染试剂）。 • 4. 关掉37℃水浴箱的电源，细胞培养箱CO2浓度恢复至5%后，关掉
次解冻。10%浓度配制冻存液。 • 3. 由于DMSO稀释时会放出大量热量，故不可将DMSO直接加入细胞液中，
必须使用前先行配制完成。 • 4. adherent tumor lines: 5-7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解
冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。other suspensions: 510 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。 • 5. 回收动物细胞，其离心速率一般为300×g(约1,000rpm），过高的转速， 将照成细胞死亡。
• 3. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如移液器和枪头盒等可以暂时 放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以酒精擦拭后才带 入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
• 4. 操作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套Байду номын сангаас才进行实验。用酒精擦拭手套 后才可进行操作。
• 5. 实验服应该定期灭菌和更换。进出细胞间时，不要同时打开相邻两个房间的门。
二、贴壁细胞的换液及传代
• 1. 换液 • 当培养基中有较多漂浮的死细胞或者培养基颜色变黄，而细胞密度未
复苏细胞的存活率
2 结果2.1 复苏细胞的存活率 复苏后ADMSCs 经椎虫蓝拒染试验检测活细胞数显示，随冻存时间的延长细胞存活率略有下降，短期（3个月）冻存组为（90.85±3.24）%，较长期（20个月）冻存组为（83.90± 3.15）%，但二者之间的差异没有统计学意义（P > 0.05）。
2.2 冻存前后细胞的生长曲线 短期（3月）冻存组和较长期（20月）冻存组ADMSCs ，在冻存前后细胞的生长曲线无明显差别，均呈“S ”形，接种后第1、2天为潜伏期，第3天进入对数生长期，第7天达顶点，第8天略有减少。
见图1。
2.3 细胞表面分子检测 短期（3月）冻存组细胞呈CD29阳性（冻存前87.51%，冻存后90.49%），HLA -DR 阴性（冻存前9.54%，冻存后11.30%）；较长期（20月）冻存组细胞呈CD44阳性（冻存前91.83%，冻存后87.35%），CD34阴性（冻存前0.07%，冻存后 0.91%）。
冻存前、后A DMSCs 的表面分子表达不存在统计学差异（P > 0.05），见图2，3。
2.4 脂肪间充质干细胞向心肌细胞诱导分化潜能的鉴定 冻存前后A DMSCs 经5-aza 诱导后第28天时心肌特异性肌钙蛋白-I 均呈阳性表达。
短期冻存组，冻存前心肌样细胞转化率为（31.27±3.52）%，冻存后为（30.87±3.49）%；较长期冻存组，冻存前为（32.50±3.85）%，冻存后为（30.13±3.65）%。
冻存前、后比较以及短期冻存组与较长期冻存组间比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），见图4。
a: Before cryopreservationFigure 3 Expression of CD44 and CD34 in adipose-derived mesenchymal stem cells in the long term (20 months) cryopreservation grou p before and after cryopreservation 图3 较长期（20月）冻存组脂肪间充质干细胞冻存前后CD44和CD34的表达 b: After cryopreservation b: After cryopreservation a: Before cryopreservation Figure 2 Expression of C D29 and HLA-DR in adipose-derived mesenchymal stem cells in the short term (3 months) cryopreservation grou p before and after cryopreservation图2 短期（3月）冻存组脂肪间充质干细胞冻存前后CD29和HLA-DR 的表达编者按：大地涵藏万物，孕育生命，被誉为人类的母亲。
细胞复苏实验报告
细胞复苏实验报告细胞复苏实验报告引言：细胞复苏是一项重要的生物学研究领域，它关注的是如何使受损细胞恢复正常功能。
本实验旨在探索不同方法对细胞复苏的影响，以期为细胞治疗和再生医学领域的发展提供有益的指导。
实验设计：本实验采用了体外培养的细胞模型，以人类肺癌细胞株A549为研究对象。
首先，我们将细胞分为四组，分别为对照组、低温处理组、药物处理组和光照处理组。
每组细胞都经历了相同的培养条件，但在处理过程中有所区别。
通过比较不同组细胞的形态学和功能特征，我们可以评估不同处理对细胞复苏的影响。
实验过程：1. 对照组：对照组细胞在常温下进行培养，没有任何额外处理。
我们观察细胞的生长情况、形态特征和细胞周期等指标，并记录下来。
2. 低温处理组：在培养基中将细胞置于低温环境中，模拟细胞受到寒冷刺激的情况。
我们将细胞暴露在4摄氏度的环境中，持续24小时。
之后，将细胞恢复到常温下培养，并观察其复苏情况。
3. 药物处理组：在培养基中添加一种已知具有细胞保护作用的药物。
我们选择了一种抗氧化剂，它被广泛应用于细胞保护和抗衰老研究中。
将药物加入培养基中，细胞在常温下培养，并观察其复苏情况。
4. 光照处理组：细胞对光线的敏感性是一个重要的生理特征。
在培养基中，我们将细胞置于光照条件下，并观察其对光线的响应和复苏情况。
实验结果：1. 对照组：对照组细胞在常温下正常生长，形态特征良好，细胞周期正常。
2. 低温处理组：低温处理导致细胞停止生长，形态发生变化，细胞周期延长。
然而，当细胞恢复到常温下培养后，细胞逐渐恢复正常生长和形态特征。
3. 药物处理组：药物处理组细胞在常温下生长良好，形态特征与对照组相似。
细胞周期也没有明显变化。
这表明该药物具有一定的细胞保护作用，可以促进细胞复苏。
4. 光照处理组：光照处理对细胞的影响较为复杂。
在适宜的光照条件下，细胞生长正常，形态特征良好。
然而，过强或过弱的光照都会导致细胞受损和生长受阻。
细胞对光照的复苏能力较弱，需要一定时间来恢复正常状态。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。
细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。
下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。
通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。
随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。
待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。
培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。
冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。
同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤SOP15
Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:
SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤
●基本原理:
SRB是一种蛋白质结合染料，可与生物大分于中的碱性氨基酸结合，其颜色的变化与活细胞中的蛋白成正比。
●溶液的配制:
SRB溶液：以1%乙酸稀释SRB粉，至浓度为0.4%。
洗脱液：乙酸用单蒸水配制至1%浓度。
Tris base液：Tris base用单蒸水配制至10mmol浓度，调pH值为10.5。
●操作步骤:
1数种药物分别配成20X溶液.
2取培养瓶中细胞，调整细胞密度至105-107个/L，180μL/孔接种至96孔板。
3预培养24h后，每孔加药物20μL(终浓度为配制浓度的1/10)，每种药物设3个复孔，每孔总液量为200μL。
4在培养箱内培养48h，吸去培养液，用PBS小心洗涤一次（勿冲洗，因细胞未固定）。
广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心
5每孔加冰冷500g/L三氯乙酸（即贴壁细胞所用浓度为5 0%，若为悬浮细胞用80%浓度三氯乙酸））50μL，4℃固定60min。
6去离子水洗4～5次，风干。
7每孔加4g/L SRB溶液100μL作用室温染色30min,10 mL/L乙酸（1%）轻洗5次,风干。
9每孔加10mmol Tris base（pH=10.5）100μL摇动混匀，在平板振荡器上振荡5min。
10在酶联免疫检测仪测定A值，用空白对照调零，所用波长为490nm.
11将所获细胞生长抑制率定义为药物对细胞的体外抑制率.抑制率（%）=（无药细胞对照孔A值平均值-用药孔A值平均值）/无药细胞对照孔A值平均值×100%.。
细胞复苏后存活率低的原因
细胞复苏后存活率低的原因
细胞复苏是指在一定的条件下，经过一段时间的休眠或停滞后，细胞重新恢复生长和分裂的过程。
然而，有时候细胞复苏后存活率却很低，这是为什么呢？
细胞复苏后存活率低可能与细胞的质量有关。
在细胞停滞或休眠期间，细胞内的代谢活动减缓，细胞器的功能也会受到影响。
如果细胞质量本身就不好，复苏后存活率就会降低。
细胞复苏后存活率低还可能与复苏条件有关。
复苏条件包括复苏液的成分、复苏液的温度、复苏液的pH值等。
如果复苏液的成分不合适，或者复苏液的温度、pH值等条件不符合细胞的要求，细胞复苏后存活率就会降低。
细胞复苏后存活率低还可能与复苏过程中的氧化应激有关。
氧化应激是指细胞内氧化还原平衡失调，导致自由基产生过多，从而对细胞膜、蛋白质、核酸等分子造成损伤的过程。
在细胞复苏过程中，由于代谢活动的重新启动，细胞内的氧化应激会增加，从而导致细胞复苏后存活率降低。
细胞复苏后存活率低还可能与细胞的死亡机制有关。
细胞死亡机制包括凋亡、坏死、自噬等多种形式。
在细胞复苏过程中，如果细胞死亡机制被激活，细胞复苏后存活率就会降低。
细胞复苏后存活率低可能与细胞质量、复苏条件、氧化应激、细胞死亡机制等多种因素有关。
为了提高细胞复苏后的存活率，需要在复苏前对细胞进行筛选和优化，同时优化复苏条件，减少氧化应激的影响，避免细胞死亡机制的激活。
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细胞工程实验报告
实验课程：细胞工程
实验内容：细胞复苏及存活率测定
一实验目的
1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。
2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。
二实验原理
在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
血球计数板：
血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。
H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。
计数室：
每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）
三、主要仪器试剂
设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、
离心管等。
试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。
四实验步骤
（复苏）
●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中，
不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。
●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将
细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀
后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞
贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养
箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。
（细胞死活鉴定及计数）
➢用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
➢取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
➢如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
➢向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。
➢显微镜下观察和计数。
活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。
➢分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。
五实验结果
计算公式：
活（死）细胞数（个/ml）=
8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ⨯10*4⨯稀释倍数
细胞存活率（%）=（活细胞数/细胞总数）⨯%
通过观察统计：
活细胞：27个
死细胞：10个
活细胞(个/ml)=27/8*10^4*6=2*10^5(个/ml)
细胞存活率=（27/37）*100%=72.97%
六思考题
绘图并说明复苏培养细胞的成活情况及形状。
⏹复苏后细胞生长状态良好，透明度大；细胞内颗粒少，没有
空泡,细胞形态完整。
⏹过一段时间后细胞已呈现一层，无悬浮状态，多数细胞处于
开始贴壁状态，但是细胞形状未发生明显变化。
等到细胞完
全贴壁时，细胞会呈现扁平或梭型或多边形，透明度较好。
细胞成活情况：
从显微观察到的图片上看到细胞整体状态良好。
大概有20%的细
胞发生不同程度的破损，细胞质流出，使得细胞变成碎片；其中没有破碎的细胞透明度下降，形态不规则。
具体的成活情况可以通过细胞计数板更精确的测定。