细胞复苏及存活率测定

细胞工程实验报告

实验课程：细胞工程

实验内容：细胞复苏及存活率测定

一实验目的

1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。

2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。

3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。

二实验原理

在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。

血球计数板：

血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。

计数室：

每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）

三、主要仪器试剂

设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、

离心管等。

试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。

四实验步骤

（复苏）

●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中，

不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。

●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将

细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀

后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞

贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养

箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。

（细胞死活鉴定及计数）

➢用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。

➢取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。

➢如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。

➢向计数板边缘处轻轻滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片间的空隙。

➢显微镜下观察和计数。

活细胞不着色，死细胞被染上蓝色。

➢分别统计角上的4个大方格内的活细胞和死细胞数，两个平台共8个大方格。

五实验结果

计算公式：

活（死）细胞数（个/ml）=

8个大方格中的活（或死）细胞总数/8 ⨯10*4⨯稀释倍数

细胞存活率（%）=（活细胞数/细胞总数）⨯%

通过观察统计：

活细胞：27个

死细胞：10个

活细胞(个/ml)=27/8*10^4*6=2*10^5(个/ml)

细胞存活率=（27/37）*100%=72.97%

六思考题

绘图并说明复苏培养细胞的成活情况及形状。

⏹复苏后细胞生长状态良好，透明度大；细胞内颗粒少，没有

空泡,细胞形态完整。

⏹过一段时间后细胞已呈现一层，无悬浮状态，多数细胞处于

开始贴壁状态，但是细胞形状未发生明显变化。等到细胞完

全贴壁时，细胞会呈现扁平或梭型或多边形，透明度较好。细胞成活情况：

从显微观察到的图片上看到细胞整体状态良好。大概有20%的细

胞发生不同程度的破损，细胞质流出，使得细胞变成碎片；其中没有破碎的细胞透明度下降，形态不规则。具体的成活情况可以通过细胞计数板更精确的测定。