MTT测定细胞的存活率

MTT测定细胞的存活率

实验材料：

1）试剂：

MTT、DMSO、DMEM、PBS。

2）材料：

15mL离心管、1.5mL EP管、1mL和200μL枪头、排槽，在实验前准备好，121℃30min灭菌后置于超净台中。

96孔培养板为一次性塑料制品。

3）仪器：

超净台、CO2培养箱、显微镜、离心机、单道及八道移液枪、细胞计数板，酶标仪等。

实验操作：

1）种板：

a.准备工作：保证超净台中有15mL的离心管和1mL枪头，将细胞计数板和盖玻片用擦镜纸擦干净；

b.使用移液枪将培养皿中的细胞吹下来，转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min；

c.离心完后用移液枪吸去上清，加入3mL新鲜培养基，轻轻吹打50下，使细胞在培养基中分布均匀成为单细胞悬液，从中取出20μL 稀释到200μL，在从中取出20μL加到细胞计数板上进行细胞计数，所得的数据乘以10即为细胞的浓度；

d.以96孔板上每孔1×104个细胞，每孔150μL计算细胞浓度，将细胞悬液稀释到所需的浓度，放到排槽中，用八道移液枪加样，注意为了消除边缘效应，周围一圈的孔都不加样，而倒数第二排加入培养基作为对照，这样只需在2~11列，B~F排加入细胞悬液；

e.细胞加好后，轻轻晃动培养板使细胞分别均匀，然后在周围一圈的孔中加入200μL PBS，在显微镜下观察后，置入培养箱中。

2）加药：

细胞在培养箱中培养24小时后就可以加药诱导了。

a. 准备工作：保证超净台中有1.5mL EP管和1mL及200μL枪头，

b.配药：因为现在每孔是150μL培养基，加入50μL的药物总体积为200μL，故配药的浓度为最终浓度的4倍，按浓度梯度使用1.5mL EP管配制不同浓度的药物，

c.加板：然后使用200μL的移液枪将配好的药物加入培养板中，

每孔50μL，最后置入培养箱中。

3）显色：

诱导到规定的时间就可以加MTT显色了。a. 准备工作：配制MTT溶液（用PBS将MTT配成5mg/mL溶液，注意避光）；b.将配好的MTT 溶液，以每孔20μL的量加入到培养板中，再置入培养箱中；c.4小时后将板中的培养基倒掉，每孔加入200μL DMSO，在酶标仪上震荡1min，570nm下测定每孔的吸光度。

4）数据处理：

B~F行的值减去本列中G行的值即为每孔MTT的吸光度，每列取平均值，将每列的值除以未加药那列的值即为相应诱导浓度的细胞存活率。

注意事项：

1）细胞计数方面，一般就我的经验而言，一个长满细胞的培养皿制备成3mL细胞悬液，将此悬液稀释十倍，能得到细胞计数的最佳浓度（每个大格20~100个细胞）。

2）细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”。3）对于和MTT有反应的药物来说，可以在加MTT前吸去培养基，再加入MTT。

4）测定时也可以测492nm和630nm下的值，OD492-OD630即为所需要的值。

5）测定的OD值不宜过大，一般在0.8~1.2之间最好，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。