MTT测定细胞的存活率
MTT法又称MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法其检测原理
MTT法又称MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法其检测原理MTT法，即3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑（MTT）比色法，是一种常用的检测细胞存活和生长的方法。
MTT法的基本原理是通过检测细胞内的线粒体活性来评估细胞的存活状况和生长情况。
线粒体是细胞内能量产生中心和细胞呼吸的主要场所，其功能完整与否直接影响细胞的生活能力和活动状态。
MTT法利用MTT试剂与细胞内的线粒体还原酶作用产生可溶性的蓝紫色产物，通过比色测定可间接反映细胞数量和细胞代谢活性。
MTT法的操作步骤如下：1.培养细胞：将需要检测的细胞在细胞培养板中培养至合适的生长期，使细胞处于活跃生长状态。
2.处理试样：根据实验的需要，对细胞进行不同处理，例如添加药物，感染病毒等。
3.加入MTT试剂：将MTT试剂以适当的浓度加入细胞培养板的培养液中，并保持细胞在适宜的温度和环境条件下培养一段时间，通常为2-4小时。
4.溶解MTT产物：将培养液完全移除，加入溶解剂如二甲基亚砜(DMSO)，使产生的蓝紫色MTT产物完全溶解。
5. 比色测定：将溶解后的MTT产物转移至96孔板或比色皿中，利用分光光度计在570 nm波长下测定吸光度值。
吸光度值的高低代表了细胞的存活状况和生长活性。
MTT法的优点在于操作简单、结果读取方便、对细胞破坏小等。
同时，MTT法可以应用于不同类型的细胞，包括哺乳动物细胞、微生物细胞等。
然而，MTT法也存在一定的局限性，比如不能直接反映细胞的精细结构和功能等。
总之，MTT法是一种常用的检测细胞存活和生长的方法，利用线粒体活性作为指标，通过MTT试剂的比色测定来间接评估细胞的数量和代谢活性。
在细胞研究、肿瘤学和药物筛选等领域具有广泛的应用前景。
MTT原理方法及操作步骤
MTT原理方法及操作步骤MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种常用的细胞增殖测定试剂，用于定量测定细胞的存活情况。
MTT的工作原理：MTT原理是基于还原型特种金属试剂Florida Cyanide。
MTT可进入细胞内部，被活细胞内的膜连蛋白酶还原为水溶性紫色化合物，甲基化噻唑胺盐（formazan）。
甲基化噻唑胺盐可溶于有机溶剂如DMSO或乙醇。
MTT的量越多，被还原为甲基化噻唑胺盐越多，即细胞活性越高。
MTT的操作步骤：1.预处理细胞将需要检测细胞的培养基倒入培养皿中，将获得的细胞悬液加入培养基中，根据实验要求进行设定浓度和培养时间。
2.处理试剂根据常规的MTT工作浓度（通常为0.5 mg/ml），将MTT试剂精确称取并溶解在无菌的溶剂（例如PBS）中。
3.细胞处理将培养中的细胞培养液抽取约100μl至新的96孔板孔中，并注意控制每个孔中细胞数相同时的培养基体积。
4.加入MTT试剂将所制备的MTT溶液以100μl的体积的溶液加入到培养细胞上，并尽量在操作中迅速搅拌均匀，以使MTT均匀分布。
5.细胞孔板孔的处理将MTT试剂添加到孔中后，覆盖板密封（如用保鲜膜密封）。
然后将培养皿放入暗处，37°C培养孔中的细胞进行inculbation与MTT碳酸酯酶的反应。
通常培养12至24小时，可以根据具体实验情况延长培养时间。
6.细胞孔中溶解甲基化噻唑胺盐将培养平皿中的培养液取出约50μl，悬浮溶解掉的甲基化噻唑胺盐，再加入200μlDMSO混合均匀。
7.测定吸光度将孔中的溶液分别转移到透明壁的96孔板，并使用微孔板阅读装置（Multiskan Spectrum）在570 nm波长下测定吸光度。
DMSO溶液作为空白参照，用作光强的基准。
8.数据分析根据检测吸光度得到的数据，计算出每个孔的平均值，并根据实验要求，进行数据图表分析。
总结：MTT法是一种可靠、灵敏、简单、可重复性好的细胞增殖测定方法。
MTT法检测细胞活力讲解
评估细胞因子对免疫细胞活性的影响
实验中遇到的问题与解决方案
问题一
细胞培养污染导致实验结果异常
解决方案
严格控制细胞培养环境，定期进 行细胞污染检测
问题二
不同批次细胞生长状态不一致
解决方案
加强实验操作培训，提高实验员 操作水平
问题三
MTT法操作过程中出现误差
解决方案
标准化细胞培养条件，确保细胞 生长状态一致
可见光下稳定
MTT结晶在可见光下稳定，不易分解，因此可以长 时间保存和测量。
细胞代谢与颜色变化
细胞代谢
活细胞通过代谢将MTT染料还原成蓝紫色结晶，结晶的数量与细 胞活性成正比。
颜色变化
随着结晶的形成，培养液的颜色逐渐由黄色变为蓝紫色，颜色的 深浅与细胞活力成正比。
细胞活力的判定标准
80%
细胞存活率
荧光染色法
利用荧光染料对活细胞进行染色，通 过荧光显微镜观察荧光信号判断细胞 活力。
mtt法与其他方法的优缺点比较
染色法
操作简单，但主观性强，误差 较大。
代谢活性检测
客观准确，但试剂成本较高。
荧光染色法
灵敏度高，但操作复杂，需要 荧光显微镜。
MTT法
操作简便，成本低，结果准确 可靠。
选择合适的细胞活力检测方法的原则
经验总结与未来展望
经验总结
MTT法是一种简单、可靠的检测细胞 活力的方法，但在实验过程中需要注 意避免污染、误差等问题。
未来展望
随着细胞生物学研究的深入，MTT法 将会有更多的应用场景，如药物筛选、 免疫疗法评估等。同时，需要不断优 化实验条件和方法，提高实验结果的 准确性和可靠性。
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MTT检测细胞活性的操作方法
MTT检测细胞活性的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
MTT检测法
MTT法检测细胞存活和生长MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT检测细胞活性的操作方法
检测细胞活性的操作方法一、是什么是一种粉末状化学试剂，全称为() ()，汉语化学名为(，二甲基噻唑)，二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
主要有两个用途．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（值），来判断活细胞数量，值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料．溶液的配制通常配成的终浓度为,须用或生理盐水做溶剂。
市面上一般的包装为或对于这样的小包装，厂家都是将放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如用来溶解。
具体做法：预先在离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入，从中先吸取装入含的小管中，吹打若干次后将其移入离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的不残留于管内。
将完全混匀后，用μ滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于度。
按细胞培养板每孔需加计算，一般每孔板约需，所以分装时可考虑每管分装。
对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：. 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
配成的需要无菌，对菌很敏感一般最好现用现配，过滤后度避光保存两周内（个人曾做过度避光保存周的溶液，效果仍然不错）有效，或配制成保存在度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当变为灰绿色时就绝对不能再用。
有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.．甲瓒溶解液二甲基亚砜，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
mtt评价法
mtt评价法摘要：1.MTT 评价法的定义和背景2.MTT 评价法的核心理念3.MTT 评价法的具体操作步骤4.MTT 评价法的优点和局限性5.MTT 评价法在实际应用中的案例分析正文：一、MTT 评价法的定义和背景MTT 评价法，全称“最小肿瘤杀伤浓度评价法”，是一种用于评估抗肿瘤药物活性的实验方法。
该方法起源于20 世纪60 年代，由美国国立癌症研究所（NCI）的Murray 等人首次提出。
其目的是为了在药物筛选阶段，找到对肿瘤细胞具有最佳杀伤效果的药物，同时确保药物对正常细胞的毒性较低。
二、MTT 评价法的核心理念MTT 评价法的核心理念是通过测量药物对肿瘤细胞和正常细胞的毒性来评估药物的活性。
该方法基于细胞呼吸的原理，通过检测细胞内的脱氢酶活性来判断细胞是否存活。
三、MTT 评价法的具体操作步骤1.细胞种植：首先将肿瘤细胞种植在96 孔板中，每孔细胞数量适宜。
然后将不同浓度的药物加入不同孔的培养液中。
2.培养：将96 孔板放入培养箱中，按照实验要求进行培养。
3.检测：培养一定时间后，取出96 孔板，加入MTT 溶液，继续培养1-4 小时。
4.酶标仪检测：用酶标仪检测各孔中MTT 的吸光度，以反映细胞存活率。
5.数据处理：以药物浓度为横坐标，MTT 吸光度为纵坐标，绘制剂量- 反应曲线，计算半数抑制浓度（IC50）和95% 抑制浓度（IC95）。
四、MTT 评价法的优点和局限性优点：1.操作简单，易于实现自动化；2.可以快速评估药物的活性；3.对细胞类型和药物种类适用性广泛。
局限性：1.不能完全反映药物在体内的药效和毒性；2.对细胞状态要求较高，细胞状态不佳时，结果可能不准确；3.受试剂质量、操作方法等因素影响较大。
五、MTT 评价法在实际应用中的案例分析案例：研究某种新型抗肿瘤药物X 对肺癌细胞A549 的活性。
步骤：1.将A549 细胞种植在96 孔板中，每孔细胞数量适宜。
2.将不同浓度的药物X 加入不同孔的培养液中。
MTT
·吸光度测定 死细胞中珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原 为蓝紫色结晶。因此，结晶生成量与活细胞 数成正比。用DMSO溶解结晶，利用酶标仪 测定出在490nm处的光吸收值以反映出活细 胞相对数目。
原理
• 一般来讲，活细胞数越多，生成的蓝紫色结晶越多，检测 的OD就越大；活细胞数越少，生成的紫色结晶越少，OD 值越小。来自结果分析结果分析
100
细胞存活率（%）
80 60 40 20 0 0 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 浓度
生存率曲线（量效曲线）
结果分析
100
细胞死亡率(%)
80 60 40 20 0 0 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 浓度
生存率曲线（量效曲线）
结果分析
MTT实验技术介绍
内容
• MTT实验原理
• MTT法应用 • 所需材料和试剂 • 实验步骤 • 结果分析
• 注意事项
原理
MTT法是一种检测细胞存活及增殖的试 验方法。
原理
·活细胞还原 MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的荧 光染料，可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢 酶还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒 （Formazan）结晶
二甲基亚砜（DMSO）、酶标仪、培养液、胰酶、 二氧化碳培养箱
实验步骤
胰酶消化制成细胞悬液 酶标仪震荡5min，测490nm处OD值
每孔5000个细胞接种于96孔板内
加100μl DMSO溶解颜色结晶
贴壁后加100μl药物溶液孵育24h
每孔加10μl MTT溶液,孵育3h
点板的设计排版
0 1 1 1 1 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6
• 结论：活细胞数与OD值成正相关。
MTT实验操作步骤
MTT实验操作步骤MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种常用的细胞增殖和细胞存活试剂，它可以通过将细胞内的还原型辅酶NAD(P)H转化为紫色的可溶性沉淀MTT形式进行测量。
MTT实验通常用于评估细胞的代谢活性和细胞数量，为细胞生物学研究提供重要数据。
以下是MTT实验的操作步骤：第一步：制备细胞悬浮液1.细胞培养：将细胞种植在含有适当培养基的培养皿中，并在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度达到所需水平。
2.细胞收获：用细胞刮器轻轻刮下细胞，将细胞转移到离心管中。
3. 离心：将离心管放入离心机中，以1000 rpm的速度离心5分钟，以沉淀细胞。
4.悬浮液制备：去除上清液，向离心管中添加适量的培养基，将细胞沉淀悬浮均匀。
第二步：细胞孵育和处理1.细胞计数：使用细胞计数板或血细胞计数仪计算细胞的数目，并将细胞悬浮在适当的量的培养基中（通常为每孔1×104到1×105个细胞）。
2.孵育时间：将细胞悬浮液加入培养板孔中，然后将培养板放入细胞培养箱中孵育一段时间（通常为12-24小时），直到细胞附着和生长。
3.处理：根据实验需求，在培养基中加入所需浓度的药物或试剂，不加入或加入等量的溶剂作为对照组。
第三步：MTT溶液制备和细胞处理1. MTT溶液制备：将MTT粉末溶解在无菌PBS缓冲液中，使得最终浓度为5 mg/mL。
2. 细胞处理：将MTT溶液加入每孔的培养基中，使最终浓度为0.5 mg/mL，然后将培养板放回细胞培养箱中继续孵育4-6小时。
第四步：细胞溶解和MTT还原1.去除培养基：用吸头将培养基尽量吸尽，或者用吸头轻轻吸去溶液。
2.细胞溶解：加入200μL的溶剂（DMSO、异丙醇或PBS等）到每孔中，将培养板放入振荡器中振荡10-20分钟，让细胞完全溶解。
3. MTT还原：将溶液转移到96孔板或其他适合的容器中，用ELISA阅读器将吸光度（OD）在550 nm波长下测量。
MTT法检测细胞活性
MTT法MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
什么是MTT法?又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT检测法
MTT法检测细胞存活和生长之迟辟智美创作MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并堆积在细胞中，而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、年夜规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济. 缺点：由于MTT经还原所发生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才华检测.这不单使工作量增加，也会对实验结果的准确性发生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害. MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保管即可.在配制和保管的过程中，容器最好用铝箔纸包住.需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数.在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内.MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC 避光保管两周内有效，或配制成5mg/ml保管在-20度长期保管，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没需要一下子配那么多,尤其当MTT酿成灰绿色时就绝对不能再用了. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，究竟时间较短，或者你不放心的时候可以把把持台上的照明灯关失落.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶.MTT法实验步伐贴壁细胞：1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）. 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，第二天上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，颠倒显微镜下观察.4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h.若药物与MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液.5、终止培养，小心吸去孔内培养液.6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充沛溶解.在酶联免疫检测仪OD490nm处丈量各孔的吸光值.7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对比孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，顺次第将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释(贮存液100g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）.每板设对比（加100l 1640）.2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，颠倒显微镜下观察.3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h.（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步伐4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸失落上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充沛溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值.5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对比孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔.关于MTT实验总结MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础.MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）.还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目.也可以用DMSO来溶解.MTT粉末和溶液保管时都需要避光，用铝箔纸包好就可以.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比力好.MTT步伐：1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）.3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml 用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充沛融解.4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.MTT注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度.2、防止血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验.在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液.3、设空白对比：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对比.其他试验步伐坚持一致，最后比色以空白调零.4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超越这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度.把药品稀释成份歧的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后获得50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50.要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最年夜浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06.代入计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4).其中：Xm:lg 最年夜剂量；I:lg(最年夜剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最年夜阳性反应率；Pn:最小阳性反应率；抑制率=1-加药组OD值/对比组OD值.公式中的最年夜最小阳性反应率就是最年夜最小抑制率 .例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加几多1640培养基，几多MTT和DMSO合适？根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO ，加DMSO之前要尽量去失落培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定.一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗失落上清液，注意不要将甲瓉洗失落，然后每孔加150μl DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值.一般要低于IC50，防止非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多.我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h.一般肿瘤细胞系空白处置的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比力明显.有一点看法：我觉得做任何实验都需要摸索适合你的实验的条件，不能用一个protocol去套所有的实际.拿MTT来说，这个实验是间接检测活细胞数目的，而需要确定活细胞数目的实验的目的是各种各样的.在分歧的目的下，就需要分歧的条件.以药物筛选来说，为了准确评价药物的作用，培养时间仅用3～5天可能是不够的；对某些细胞来说，加药培养时可能用维持培养基或无血清培养基更合适.因此，诸如MTT和DMSO加入量、孵育时间等应因事而异，找到最适合你实验要求的就好.MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也经经常使用来检测细胞的增殖情况.MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀.由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得依照实验流程与年夜家交流交流.1、培养好细胞点板.养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法.如果知道了细胞的名字，就可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法.固然可以根据自己实验要求进行修改.由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，年夜概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞年夜概能长满96-孔板的80-90%，如果筹算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况.这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处置）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比力合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）.这样就OK 了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上把持.注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的.建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它.点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂年夜.2、点板规划.其实这一点很多人不懈一顾.如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分.因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会呈现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂年夜，既然如此，不如不用.3、加MTT.如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有掌控，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的.4、加入MTT后的反应.时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO.为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min.提醒：如果你的细胞贴壁欠好，此时的沉淀在弃去液体时易丧失，因此贴壁欠好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处置处置，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体.关于DMSO的量，每孔的体积有点儿不同不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了.至于DMSO的体积不同分歧为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我未几说，如果有人不明白我再证明给他看.固然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好.5、检测MTT.还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最年夜细说波长检测就是了，最年夜波长，年夜概在550nm附近，需要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收.6、吸收值分析.在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处置组的吸收值应该在，太小检测误差占的比例较多，太年夜吸收值可能已经超越线性范围.这个原理在朗伯-比尔定律中有解释.7、如果你觉得MTT中呈现的问题欠好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但把持上简化些，固然，费用也稍微高一些.请问在做MTT实验室是否遇到过下面的情况：调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太年夜变动，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，其实不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺年夜的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的年夜，如果把调零孔的值减失落之后，OD值为负值.另外加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红.对比组测出的OD值在0.4～0.5之间.接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm.我做了很屡次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象.我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的结果：三个浓度下的OD值两次的都比力吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右.不知是什么原因，请分析.另外，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那么高吧，而且你复孔之间的差值一般是几多？欠好意思，你说的现象我没呈现过.还得注意几点：1、MTT应该新鲜配制，在4度保管最多不能超越2周，也有说10天的，反正不能太久.2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不能用的，应该加入无菌PBS.3、如果有心，你可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减失落参比吸收后再分析.4、加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净.问：96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法判断板里细胞的死活了.不知道有没有什么法子?丁香网友chinaefulle认为：1、对贴壁细胞：死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好.2、对悬浮细胞似乎欠好直接判断.有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，染不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内就可以判断，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不容易着色.如果96-孔板养欠好，可以试着用24孔板.如果是旧板养欠好，就试着用新板.为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3 h，但不要太长，否则板就黄了.还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试.如果你的细胞欠好养，尽量不要用旧板.问：加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太年夜变动，为黄色.我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，结果颜色就分歧毛病了，干扰了MTT的检测.丁香网友chinaefulle认为：MTT为淡黄色，用0.1 M的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20 ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200 ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了.不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，就可能招致MTT 越不稳定.问：我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm，和您说的波长所测值会有很年夜不同吗？丁香网友chinaefulle认为：如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性.570nm的吸收也是挺高的.波长分歧吸光度会有不同，但不影响检测结果的趋势变动.如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射发生的），那么选用最年夜吸收波长有利于减少非特异性吸收所招致的误差.问：我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？丁香网友chinaefulle认为：单波长也是可以用的.双波长主要可以扣除非特异性吸收，比如细胞颗粒造成的吸收和板孔布景招致的非均一性吸收.如果使用96孔板前先检测板孔的布景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标识表记标帜好不用，单波长也能年夜体扣除因此造成的非特异吸收.对细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对结果判断的方向性不会有太年夜影响.下图A是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对你的酶标仪建议使用470 nm.氧化型MTT的吸收曲线还原型的MTT吸收曲线问：MTT用PBS配制,原先培养基中10%FBS会影响结果吗?丁香网友chinaefulle认为：不会，因为上清会弃去，每一个孔中都平行有10%FBS，即使有影响，其影响的年夜小也是可以通过阴性对比扣除失落.问：我一直在想一个问题，为什么网上见的protocol绝年夜部份都是MTT加10～20ul，然后放3～4h再测？是为了节省试剂？我想在某种水平上时间能更重要些，但为什么不增加MTT的量，减少孵育时间呢？从我的实验来看，增加MTT、降低孵育时间是可行的.可是现在也存在一个问题，就是即使用到5000/well，现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上.是否有MTT增加的原因？这个还在进行验证.希望有我这种实验经历和想法的同行一起讨论.丁香网友chinaefulle认为：你提的这个问题很好，值得探索.可是目前都是约定加入10%体积的MTT，然后反应3-4h.我个人猜想可能与以下原因有关（纯属猜想，因为没做过实验）：1、根据我的经验，MTT的溶解度不是太好，所以0.5%的MTT母液（相当于10X）已经可能接近最年夜溶解极限，而直接用含血清的培养液配制因为带入的成份复杂，MTT保管的稳定性可能存在疑问.所以使用孵育3-4h的条件.2、MTT是琥珀酸脱氢酶的人工底物，底物浓渡过高可能招致酶抑制，固然，MTT是否有此作用值得实验验证，但年夜大都酶的底物浓渡过高时会发生酶的抑制作用（直接的抑制作用）.问：我的MTT是用PBS配的，5mg/ml，因为每孔的溶液量为100ul，所以我加了10ul.现在我的调零孔孵育4小时后为黄色，可是加入DMSO之后，还是红色的，490nm下的吸收值为0.2左右.难道是我买的培养基或是血清有问题，我用的是GIBCO的1640培养基，杭州四季青的血清.丁香网友chinaefulle认为：1、MTT温孵4h可能会发生自发的氧化还原作用而发生颜色.因为你是和培养基血清一起孵育的，你的空白孔470nm吸收在0.2左右，因该说是预期值，要减少它，在你的条件下只能靠减少反应时间.可是要注意你的“有细胞但不加药的孔”吸光度是几多，如果吸光度小，比如低于0.8，那么建议你增加细胞浓度.2、尽量不要用延长反应时间来增加吸光度，因为MTT 会自发转化，尤其是有血清的帮手下（血清中含有NADH、Fe3+等物质，这些物质能增进MTT转化），通过增加细胞数减少反应时间来提高检测孔和空白孔的相对差值是可行的，而通过增加反应时间可能很难凑效.这一点许多书上没说.你除去培养基后是否在加入同体积的PBS.我曾试过，把培养基吸出，然后加同体积的PBS，再加入MTT，测出的值要比有培养基可孔的值低，那时好像能低0.2左右（490nm）.丁香网友山百合的做法是：去除培养基后，直接加用PBS稀释的MTT（MTT母液也是用PBS配制的）200微升，放置1h再加200微升的DMSO.丁香网友chinaefulle认为：估计采纳提高MTT浓度以减少孵育时间的做法可能不成行.仅供参考，理由如下：我们惯例加入的MTT是过量的，反应4h后96孔板的溶液仍是黄色，改变较小，这标明MTT加入的量简直是过量的.过量的底物与酶反应实际上是零级动力学过程，即酶已经被底物饱和.如果再增加底物浓度实际上也改变不了一按时间内的产物量.也就是说，底物再增加10倍，要想获得原先的吸光度，以前用3h，现在可能还是要用将近3h.因此意义较小.固然，我用的是理论分析，应该以实验为依据.仅供你参考，如果能明显缩短反应时间那么还是很有意义的.问：我前两天做了两板，孵育四小时候，把液体倒出時发现MTT还原物也被倒出了一些！结果很欠好！而且用移液枪吸出的也带有还原物！我该怎么办呢？问题2：由于我所作的药溶解度非常低一百多微克每毫升就析出！使等倍稀释很禁绝！有什么法子解决？我们在Hanks液里加了牛血清白卵白提高溶解度可行吗？不是说血清会影响结果吗？丁香网友山百合认为：1、注意细胞状态，细胞状态好的时候不会失落；或者倒液前离心；2、药物可用DMSO溶解成母液，一般为使用浓度的0.1%左右，不外液有文献报道用1%，我看的文献有用1%、0.5%、0.1%的，尽可能要使工作液中DMSO的含量低，以免影响细胞生长状态.不要加卵白促溶，一方面是否能起促溶作用不明确，另一方面卵白可以吸附药物，尤其是小分子药物问：年夜家都是用DMSO吗？怎么看到有的文献是用HCl-isopropanol溶液，然后570nm测定？丁香网友chinaefulle认为：DMSO的使用比盐酸-异丙醇方便，至少盐酸-异丙醇溶液你还得配置，而DMSO拿来就可以用，而且使用浓盐酸时你得小心一点，要注意平安.而DMSO就没有这么麻烦.固然DMSO和盐酸-异丙醇都可以用来裂解细胞溶解被还原的MTT，如果手头上没有DMSO，用盐酸-异丙醇溶液也是可以的.至于盐酸-异丙醇如何配置可以查查书.问：MTT还能用于组织标本中的细胞增殖检测啊?该怎么弄呢?丁香网友chinaefulle认为：应当可以，只要组织是活的，因为MTT检测与琥珀酸脱氢酶活性有关，只要组织中有此酶，MTT反应同样会发生.固然组织需要匀浆.申明以下，以上是理论推测，我还没试过，如有人试过，无妨也来交流交流.MTT试验的一些细节问题(一)细胞1.选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于分歧细胞贴壁后面积不同很年夜，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及分歧接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满.这样，才华保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到不同.2.药物浓度的设定.一定要多看文献，参考他人的结果再定个比力年夜的范围先初筛.根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛.切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间.3. 时间点的设定.在分歧时间点的测定OD值，输入excel表，最后获得分歧时间点的抑制率变动情况，画出变动的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制暗示的最明显）.4.培养时间.200ul的培养液对10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的.5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数.做MTT时，尽量无菌把持，因为细菌也可以招致MTT比色OD值的升高.6.理论未必都是对的.要根据自己的实际情况调整.设置调零孔，对比孔，加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜.对比孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，分歧的是对比孔加溶解药物的介质，而加药组加入分歧浓度的药物.8.防止血清干扰.用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行.在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液.(二)实验步伐贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）.。
四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力
四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力一、实验目的掌握MTT法检测细胞活力的方法。
二、实验原理四甲基偶氮唑盐(MTT)为淡黄色粉末，水溶性好，易通过细胞膜而进入细胞。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶于水的紫色结晶物甲躜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
一般情况下结晶物的生成量与活细胞数成正比。
酸性异丙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)或二甲亚砜(DMSO)均能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色的深浅与所含的甲躜量成正比。
用酶标仪在5 7 0nm波长处测定其吸光度OD值(A570nm)，可间接反映活细胞数。
MTT法简单快速、准确，广泛用于新药筛选、细胞毒性试验及肿瘤放射敏感性等实验中。
它与前述细胞计数法等方法相关性良好，也可用MTT法测定细胞生长曲线。
三、实验器材仪器二氧化碳培养箱、酶标仪、9 6孔细胞培养板、可调微量移液器、微孔板振荡器等。
试剂MTT溶液：MTT溶于pH7.4的0。
0 1mol／L PBS液中，磁场搅拌3 0分钟，过滤除菌，配制成2m9／ml的MTT液，4℃冰箱贮存。
二甲亚砜(DMSO)分析纯。
细胞培养基。
材料对数生长期的KB细胞或其他贴壁培养传代细胞。
四、实验步骤接种细胞取对数生长期细胞，0.2 5％胰酶消化，加含血清培养基终止消化并吹打成单细胞悬液(悬浮细胞则不需消化)，台盼蓝染色计数(取5 0l细胞悬液，加等量的0.4％台盼蓝染液，正置或倒置显微镜下用血细胞计数板计数活细胞，不着色者为活细胞)后稀释,以6000--40000个细胞／孔接种于96孔培养板(应根据细胞体积及生长速度确定接种浓度，使实验结束时吸光度与活细胞数呈线性关系，吸光度在0．2,--1．5之间)，每孔接种体积为l00>1，另外设空白对照孔，只加完全培养基。
在37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱内常规培养一段时间(根据实验目的决定培养时间长短。
如果是药物处理需要在培养24小时后换成含不同度实验药物的培养液和对照药或培养基对照，每孔l00μ1，每组设4个复孔，继续培养48h)。
MTT检测法.62
MTT法检测细胞存活和生长MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT复原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒〔Formazan〕并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜〔DMSO〕能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经复原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT ，溶于100 ml的磷酸缓冲液〔PBS〕或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
吸光度细胞存活率计算公式
吸光度细胞存活率计算公式引言。
细胞存活率是细胞生物学研究中一个非常重要的指标，它反映了细胞在特定条件下的生存能力。
而吸光度则是用来衡量溶液中溶质的浓度的一个重要参数。
在细胞生物学研究中，通常会使用吸光度来计算细胞的存活率。
本文将介绍吸光度细胞存活率计算公式，并探讨其在细胞生物学研究中的应用。
吸光度细胞存活率计算公式。
在细胞生物学研究中，通常会使用MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或者WST-1（4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate）等试剂来评估细胞的存活率。
这些试剂会与活细胞中的代谢酶发生反应，产生有色产物，通过检测这些产物的吸光度来计算细胞的存活率。
一般来说，细胞存活率的计算公式如下：存活率（%）=（实验组吸光度-空白吸光度）/（对照组吸光度-空白吸光度）×100%。
其中，实验组吸光度是指添加了MTT或WST-1试剂后的实验组细胞培养基的吸光度值，对照组吸光度是指未添加MTT或WST-1试剂的对照组细胞培养基的吸光度值，空白吸光度是指只有MTT或WST-1试剂的吸光度值。
通过这个公式，我们可以得到细胞的存活率，从而评估细胞在不同条件下的生存能力。
应用。
吸光度细胞存活率计算公式在细胞生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用来评估细胞在不同药物处理、细胞因子刺激、毒素暴露等条件下的存活率，从而帮助研究人员了解这些因素对细胞生存能力的影响。
其次，它还可以用来筛选具有抗肿瘤活性的化合物，通过比较不同化合物处理后细胞的存活率，来评估这些化合物对肿瘤细胞的影响。
此外，吸光度细胞存活率计算公式还可以用来评估细胞的增殖能力，通过监测细胞在不同时间点的存活率，来了解细胞的增殖速率。
除了在细胞生物学研究中的应用外，吸光度细胞存活率计算公式还可以在药理学研究、毒理学研究、生物医学工程等领域得到广泛应用。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
MTT法原理步骤
MTT法原理步骤MTT法（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种常用于细胞增殖和细胞存活分析的非放射性测定方法。
MTT法的原理基于细胞线粒体中存在的一种酶，称为呼吸链中的NAD(P)H氧化酶，它将4,5-二甲基噻唑-2-基四唑（MTT）氧化为紫色的甲基紫色素（formazan），进而可以利用光密度测量来研究细胞的增殖和存活情况。
MTT法的操作步骤主要包括以下几个环节：1.细胞培养：首先，需要将感兴趣的细胞进行培养。
通常，细胞会在培养皿内以适当的培养基中进行培养。
在培养期间，细胞会继续增殖，形成一个单层或多层的细胞群。
2.细胞孵育：将培养好的细胞通过酶解或机械方法从培养皿中剥离，并转移到一个合适的孵育皿中。
通常孵育皿的形状为96孔板，这样可以同时处理多个样品。
3.MTT处理：将细胞孵育一定时间后，将MTT溶液加入到每个孔中。
MTT溶液会迅速进入细胞，并被细胞内的活性酶还原为紫色的甲基紫。
MTT溶液中的浓度和处理时间会根据实验要求进行调整。
4.溶解形成甲基紫：在处理一定时间后，将孔板从培养箱中取出，并将MTT溶液取出，然后加入一种溶解液，可以是DMSO（二甲亚砜）等有机溶剂。
溶解液会溶解甲基紫，形成紫色溶液。
5.光密度测量：最后，使用光密度计等仪器对每个孔中的溶液进行测量，光密度的测量值与细胞数量和代谢活性呈正相关关系。
根据参考值和实验结果，可以计算出细胞增殖或存活的百分比。
总结起来，MTT法的基本原理是利用细胞内酶对MTT溶液的还原作用，生成可溶于有机溶剂的紫色产物，通过紫外-可见吸收光度计测定溶液吸光度的变化，进而推测细胞的代谢活性或存活率。
这种方法简单、经济、没有放射性，因此被广泛应用于细胞生物学和药物筛选研究中。
细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究
细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究细胞生物学是研究细胞结构、功能和生物过程的学科，而药物筛选与评价方法是指在细胞水平上对药物进行筛选和评价的方法。
这些方法在药物研发和临床应用中起着至关重要的作用。
本文将介绍几种常用的细胞生物学中的药物筛选与评价方法。
1. 细胞存活率测定法细胞存活率测定法是一种常用的药物筛选与评价方法。
该方法通过评估细胞在药物处理后的存活率来判断药物对细胞的毒性和抗细胞增殖活性。
常见的细胞存活率测定方法包括MTT、CCK-8、LDH释放等。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法是通过测定细胞内活性代谢产物的形成来评估细胞存活率的。
MTT是一种黄色草酮类化合物，可以被活细胞内的NAD(P)H依赖的还原酶酶活（如线粒体呼吸链复合物）还原为紫色的结晶物。
通过把MTT溶液添加到细胞培养板中，待细胞生长一段时间后，通过加入一定的溶解剂来溶解结晶物，最后用分光光度计测定溶液的吸光度来评估细胞存活率。
CCK-8（cell counting kit-8）法是一种类似于MTT法的细胞存活率测定方法。
CCK-8是MTT法的改进版，它具有更高的灵敏度和更好的线性关系。
该方法也是通过测定细胞内的活性代谢产物（如细胞色素c）来评估细胞存活率的。
LDH（lactate dehydrogenase）释放法是一种衡量细胞毒性的常用方法。
LDH是存在于细胞质中的酶，只有在细胞膜破裂释放到培养液中时才会被检测到。
通过测量培养液中的LDH含量，可以评估细胞膜完整性的损害程度和细胞的存活率。
2. 细胞凋亡检测法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，与多种疾病的发生和药物治疗效果密切相关。
因此，在药物筛选与评价中，细胞凋亡的检测方法也是不可或缺的。
常见的细胞凋亡检测方法包括TUNEL、Annexin V-FITC/PI、DNA Ladder等。
MTT测定细胞的存活率
MTT测定细胞的存活率实验材料：1）试剂：MTT、DMSO、DMEM、PBS。
2）材料：15mL离心管、1.5mL EP管、1mL和200μL枪头、排槽，在实验前准备好，121℃30min灭菌后置于超净台中。
96孔培养板为一次性塑料制品。
3）仪器：超净台、CO2培养箱、显微镜、离心机、单道及八道移液枪、细胞计数板，酶标仪等。
实验操作：1）种板：a.准备工作：保证超净台中有15mL的离心管和1mL枪头，将细胞计数板和盖玻片用擦镜纸擦干净；b.使用移液枪将培养皿中的细胞吹下来，转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min；c.离心完后用移液枪吸去上清，加入3mL新鲜培养基，轻轻吹打50下，使细胞在培养基中分布均匀成为单细胞悬液，从中取出20μL 稀释到200μL，在从中取出20μL加到细胞计数板上进行细胞计数，所得的数据乘以10即为细胞的浓度；d.以96孔板上每孔1×104个细胞，每孔150μL计算细胞浓度，将细胞悬液稀释到所需的浓度，放到排槽中，用八道移液枪加样，注意为了消除边缘效应，周围一圈的孔都不加样，而倒数第二排加入培养基作为对照，这样只需在2~11列，B~F排加入细胞悬液；e.细胞加好后，轻轻晃动培养板使细胞分别均匀，然后在周围一圈的孔中加入200μL PBS，在显微镜下观察后，置入培养箱中。
2）加药：细胞在培养箱中培养24小时后就可以加药诱导了。
a. 准备工作：保证超净台中有1.5mL EP管和1mL及200μL枪头，b.配药：因为现在每孔是150μL培养基，加入50μL的药物总体积为200μL，故配药的浓度为最终浓度的4倍，按浓度梯度使用1.5mL EP管配制不同浓度的药物，c.加板：然后使用200μL的移液枪将配好的药物加入培养板中，每孔50μL，最后置入培养箱中。
3）显色：诱导到规定的时间就可以加MTT显色了。
a. 准备工作：配制MTT溶液（用PBS将MTT配成5mg/mL溶液，注意避光）；b.将配好的MTT 溶液，以每孔20μL的量加入到培养板中，再置入培养箱中；c.4小时后将板中的培养基倒掉，每孔加入200μL DMSO，在酶标仪上震荡1min，570nm下测定每孔的吸光度。
MTT法
MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞增殖曲线，研究对细胞存活的影响：取对数生长期的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液计数，(共36－40ml培养液)→调整细胞浓度为5×103个细胞／ml，反复吹打使细胞均匀，接种于96孔培养板中，每孔100ul（细胞数为 500个培养箱孵育过夜后，36小时后弃原培养液，以细胞/孔）， 37℃，5%CO2无血清培养基清洗2遍，分组加药，加入不同浓度药液（0、10、100、1000、10000）培养液100ul(入无血清培养基中)，每种浓度设立8个平行对照（商），并设正常对照（无药对照）及空白对照（不加细胞只加培养液，其他步骤一样，最后比色调零用），置正常培养条件下培养。
→加药后的第24、48、72、96、120、144h分别取出一板，弃去培养液，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4小时，→小心吸弃孔内上清培养液，每孔加入DMSO 100－200μl（白），振荡摇匀，10分钟充分溶解结晶物，→室温静置20－30分钟后选择490nm（570nm白、张），在酶联免疫检测仪（96孔酶标仪）上测定各孔吸光度（OD）值，并计算细胞存活率，即：细胞存活率=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%1．碘化丙啶（PI）：用PBS溶为1mg/ml，4℃避光保存。
2. MTT溶液(5mg/ml)：50mgMTT粉剂溶于10mlPBS中，以孔径为0.22um滤器过滤除菌。
呵呵以前做过的，大概的实验方法如下，不知道对你是否有用1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。
3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。
4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
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MTT测定细胞的存活率
实验材料：
1）试剂：
MTT、DMSO、DMEM、PBS。
2）材料：
15mL离心管、1.5mL EP管、1mL和200μL枪头、排槽，在实验前准备好，121℃30min灭菌后置于超净台中。
96孔培养板为一次性塑料制品。
3）仪器：
超净台、CO2培养箱、显微镜、离心机、单道及八道移液枪、细胞计数板，酶标仪等。
实验操作：
1）种板：
a.准备工作：保证超净台中有15mL的离心管和1mL枪头，将细胞计数板和盖玻片用擦镜纸擦干净；
b.使用移液枪将培养皿中的细胞吹下来，转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min；
c.离心完后用移液枪吸去上清，加入3mL新鲜培养基，轻轻吹打50下，使细胞在培养基中分布均匀成为单细胞悬液，从中取出20μL 稀释到200μL，在从中取出20μL加到细胞计数板上进行细胞计数，所得的数据乘以10即为细胞的浓度；
d.以96孔板上每孔1×104个细胞，每孔150μL计算细胞浓度，将细胞悬液稀释到所需的浓度，放到排槽中，用八道移液枪加样，注意为了消除边缘效应，周围一圈的孔都不加样，而倒数第二排加入培养基作为对照，这样只需在2~11列，B~F排加入细胞悬液；
e.细胞加好后，轻轻晃动培养板使细胞分别均匀，然后在周围一圈的孔中加入200μL PBS，在显微镜下观察后，置入培养箱中。
2）加药：
细胞在培养箱中培养24小时后就可以加药诱导了。
a. 准备工作：保证超净台中有1.5mL EP管和1mL及200μL枪头，
b.配药：因为现在每孔是150μL培养基，加入50μL的药物总体积为200μL，故配药的浓度为最终浓度的4倍，按浓度梯度使用1.5mL EP管配制不同浓度的药物，
c.加板：然后使用200μL的移液枪将配好的药物加入培养板中，
每孔50μL，最后置入培养箱中。
3）显色：
诱导到规定的时间就可以加MTT显色了。
a. 准备工作：配制MTT溶液（用PBS将MTT配成5mg/mL溶液，注意避光）；b.将配好的MTT 溶液，以每孔20μL的量加入到培养板中，再置入培养箱中；c.4小时后将板中的培养基倒掉，每孔加入200μL DMSO，在酶标仪上震荡1min，570nm下测定每孔的吸光度。
4）数据处理：
B~F行的值减去本列中G行的值即为每孔MTT的吸光度，每列取平均值，将每列的值除以未加药那列的值即为相应诱导浓度的细胞存活率。
注意事项：
1）细胞计数方面，一般就我的经验而言，一个长满细胞的培养皿制备成3mL细胞悬液，将此悬液稀释十倍，能得到细胞计数的最佳浓度（每个大格20~100个细胞）。
2）细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”。
3）对于和MTT有反应的药物来说，可以在加MTT前吸去培养基，再加入MTT。
4）测定时也可以测492nm和630nm下的值，OD492-OD630即为所需要的值。
5）测定的OD值不宜过大，一般在0.8~1.2之间最好，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。