SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤SOP15
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）
细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。
当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。
经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。
2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。
2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。
2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。
2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告细胞增殖实验是研究肿瘤细胞增殖和药物筛选的重要手段。
目前常见的肿瘤细胞增殖实验包括MTT法、SRB法、CCK-8法和细胞计数法。
本综述将介绍常用的MTT法和SRB法。
一、MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖和细胞存活率的方法。
其原理是MTT剂通过被细胞还原，形成紫色沉淀，而细胞活性越强，则代谢产物越多，MTT的还原能力也越强，所以其颜色越深。
MTT法的步骤如下：1. 细胞接种：将待检测的细胞分离并接种到96孔板中，对照组和实验组各重复3次，每孔加入100 μl的细胞悬液。
2. 细胞培养：将孔板置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24h，待细胞贴附后进入下一步。
3. 加入MTT：将MTT溶液加入孔板中，加入的量为100 μl/孔，最终浓度为0.5mg/ml。
4. 离心：孔板离心5min，去除上清，加入150 μl的DMSO，进行溶解。
5. 检测：将各孔450 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
MTT法适用于多种肿瘤细胞，操作简便，可用于初筛药物的活性。
然而，MTT法也存在局限性，如MTT还原能力受到某些实验条件影响，如细胞密度、孵育时间、细胞凋亡等，需要注意标准化操作。
二、SRB法SRB法是酸性快速比色法的缩写，它通过酸性溶液中蛋白质的沉淀和染色，反映了细胞的增殖情况。
该方法操作简单，速度快，结果信度较高。
步骤如下：3. 加入SRB：将SRB溶液加入各孔中，保持10 min。
4. 洗涤：将各孔反复洗涤至清晰。
6. 检测：将各孔570 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
SRB法比较适用于肿瘤细胞形态大而扁平的情况。
此外，SRB法还能够评价细胞的耐药性，并可用于筛选化合物对细胞增殖的抑制率，是一种较为全面的细胞增殖试验方法。
三、结论以上两种实验方法在检测肿瘤细胞增殖及药物筛选中具有重要的应用价值。
在操作上，需要严格地控制实验条件，确保数据的准确性和可靠性。
细胞计数与存活的测试实验方法
细胞计数与存活的测试实验方法细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。
那么细胞计数与存活的测试实验方法有哪些呢？1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。
使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。
计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。
药物SRB法实验步骤
药物SRB法实验步骤(根据原方案)SRB（黄酰罗丹明B）比色分析1.1%乙酸：量取2ml乙酸，定容到200ml。
4℃保存2.0.4%SRB200ML：称取0.8gSRB，溶于200ml乙酸中。
室温保存。
3.1 %TCA（三氯乙酸MV163.39）250ML:称取2.5gTCA加水定容至250ml，4℃棕色瓶或锡纸避光保存。
4．50%TCA100ml ：称取50gTCA，加入水定容至100ml。
4℃棕色瓶或锡纸避光保存5.10mM unbuffered Trisbase(PH10.5)500ML:称取0.6057g Trisbase（三羟甲基氨基甲烷MV121.14）加水定容至500ml4℃保存1青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚的配制青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚采用DMSO溶解，使用终浓度皆为0、3、10、30、100、300μg/ml。
阴性对照为1%的DMSO溶液。
青蒿素55mg/400ul 137.5μg/ ul 分子量：282.33蒿甲醚51mg/600ul 83.33 μg/ ul 分子量：298.37双氢青蒿素30mg/ml 30μg/ ul 分子量：284.35青蒿琥酯120Mm 46.13μg/ ul 分子量：384.42青蒿琥酯50mg/200ul 250μg/ ul将每种药稀释成30μg/ ul：a．取30ul 137.5μg/ ul的青蒿素，加107.5ul的DMSOb．取30ul 83.33 μg/ ul的蒿甲醚，加53.33ul的DMSOc．取30ul 46.13 μg/ ul的青蒿琥酯，加16.13ul的DMSO药物终浓度（μg/ ul）0310********每孔药物体积（ul）00.020.06670.20.6672 5孔药物体积（ul）00.10.3331 3.3310补的DMSO体积(ul)109.99.6679 6.670备注：上述的药物为稀释成30μg/ ul的药物。
MTT法检测细胞存活率或抑制率详细步骤SOP14
Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:MTT法检测细胞存活率或抑制率●基本原理:MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethyl thiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可用DMSO（分析纯）来溶解。
利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
●试剂配制：MTT溶液：用pH=7.4的PBS配制成5mg/ml浓度的溶液，避光保存)●MTT法检测细胞存活率或抑制率详细步骤1接种细胞：用含10％胎/小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-105个细胞接种到96孔板，每孔体积100-200μl.2:培养细胞：同一般培养条件，培养1-2天（原代细胞不同，可根据试验目的和要求决定培养时间，神经元7-10天，心肌细胞8-14天）。
3 吸去原培养基，每孔加入以无血清培养基配制的不同浓度药物（原代细胞例外）。
4培养24或48h后，每孔加MTT溶液（5mg/ml，用pH=7.4的PBS配制，避光保存)10-20μl.（每孔培养基为100μl，加10μl，每孔培养基为200μl，则加20μl）。
5 37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液（对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液）。
6每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
7比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。
SRB法
SRB法肿瘤细胞的培养与抗肿瘤活性检测3.1肿瘤细胞复苏将保存有肿瘤细胞的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃恒温箱中，不停摇动，直到融化。
用75％酒精擦拭冻存管盖边缘后，吸取细胞悬液转入10mL离心管中，补加5mL培养基。
低速离心(25℃，3000r/min,5min)，弃上清，加培养基再重复离心清洗一次。
加适量培养基稀释后，用吸管将细胞吹散制成悬液，转入培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
次日更换培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。
3.2细胞的传代培养及计数人肝癌HepG2细胞为贴壁生长细胞，在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，当细胞生长至80-90%将要融合时，进行传代，约2-3天传代一次。
具体传代步骤如下：（1）吸出瓶内原有的培养液，用0.02% EDTA液洗一遍。
（2）加入适量的0.25%的胰蛋白酶消化液、0.02% EDTA于室温下消化，1-2分钟后显微镜下观察消化情况，当细胞开始变圆、细胞间隙变大时，加入2-3mLHanksPBS溶液终止消化，轻轻地晃动培养瓶，洗掉残留的消化液。
再加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。
（3）用吸管轻轻吹打瓶底和瓶壁，使细胞脱离瓶壁形成单细胞悬液。
取少量混匀的单细胞悬液用细胞计数板在显微镜下计数，用台盼蓝负染法计数活细胞，按照白细胞计数法计算细胞密度，并用培养液稀释成所需的细胞密度传代或供检测待用。
一般按1×106个细胞/瓶接种于培养瓶，每瓶加4-5ml 培养液，轻轻晃动，使其在培养瓶中分散均匀，或根据实验所需将适当的细胞量分装入新培养瓶，添加新鲜的培养液至适量，置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养[29]。
3.3 细胞冻存方法取对数生长期的细胞制成细胞悬液，取含有106-107个细胞的悬液，25℃，3000r/min，离心5min后弃上清，加入4mL冻存液，混匀后分装在2mL冻存管中，贴上标签，注明细胞名称及冻存日期。
细胞凋亡、坏死、细胞活性检查常见方法及试剂
线粒体膜电位指示染料线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件. 它在凋亡过程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。
基于以上研究，Biotium 研发了各种的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。
MitoView ™ 633MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。
使用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒可以在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。
图 1. 使用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组使用staurosporine 作为凋亡诱导剂。
使用MitoView ™633 染色图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处理(B)的Jurkat 细胞（JC-1 染色）. FL1 (x- 轴) 为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。
(A 图) 较高的红绿荧光比例表明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明：由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的变化。
在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，可以产生红色的荧光(激发光/发射光585/590nm)。
相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，这样可以使用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。
常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
srb实验步骤
srb实验步骤SRB实验步骤SRB实验是一种用于研究肌肉功能和反射活动的实验方法。
下面将介绍SRB实验的步骤。
1. 实验准备在进行SRB实验之前，首先需要准备实验所需的材料和设备。
这些包括SRB装置、电极、实验动物（通常是小鼠或大鼠）、药物溶液、生理盐水等。
同时，还需要设置实验室的环境条件，如温度、湿度等。
2. 动物准备在进行SRB实验之前，需要对实验动物进行准备。
这包括体重测量、麻醉、固定动物在SRB装置上等。
在固定动物时，要确保动物的头部、四肢和尾部都能够被固定，并且不会对动物造成不适或伤害。
3. 电极植入在进行SRB实验之前，需要进行电极植入。
电极通常植入到动物的肌肉或神经中，以记录肌肉收缩或神经传导的电信号。
在植入电极之前，需要进行消毒和麻醉处理，以确保手术的安全性和卫生性。
4. 实验操作在进行SRB实验时，需要进行一系列的操作和刺激以观察反射活动和肌肉功能。
这包括施加刺激（如电刺激或药物注射）、记录电信号、测量肌肉收缩力等。
在实验过程中，要确保操作的准确性和一致性，以保证实验结果的可靠性和可重复性。
5. 数据分析在进行SRB实验之后，需要对实验数据进行分析。
这包括对电信号的处理和解读、对肌肉收缩力的测量和统计分析等。
通过数据分析，可以得出关于肌肉功能和反射活动的结论，并进一步研究和探索相关的生理和病理机制。
6. 结果和讨论在进行SRB实验之后，需要对实验结果进行结果和讨论。
这包括对实验数据的总结和解读，对实验结果的比较和分析，以及对实验结果的可能解释和进一步研究方向的讨论。
通过结果和讨论，可以进一步深入理解肌肉功能和反射活动的机制和调控。
7. 结论和展望在进行SRB实验之后，需要对实验结果进行结论和展望。
结论部分总结了实验结果的主要发现和意义，展望部分提出了进一步研究的方向和可能的应用前景。
通过结论和展望，可以对实验结果的意义和影响进行总结和评价，并为未来的研究提供参考和指导。
SRB实验是一种用于研究肌肉功能和反射活动的实验方法。
快速检测细胞存活率的方法
快速检测细胞存活率的方法细胞存活率的检测在生物学研究和临床实践中具有重要意义。
传统的细胞存活率检测方法通常涉及复杂的操作步骤和耗时的分析过程，不适用于快速筛查和高通量实验。
因此，发展一种快速、简便且准确的细胞存活率检测方法具有重要的研究和应用价值。
细胞膜完整性是细胞存活与否的重要指标之一。
当细胞膜完整时，细胞内的染料无法进入细胞内部，从而形成相对较弱的荧光信号。
而当细胞膜破损时，染料可以进入细胞内部，形成相对较强的荧光信号。
基于这一原理，我们可以利用染料与细胞膜的相互作用来快速检测细胞存活率。
一种常用的方法是利用细胞膜不可透性的染料如Trypan Blue或Propidium Iodide。
这些染料可以通过细胞膜破损的部位进入细胞内部，与细胞核酸结合并发出荧光信号。
通过检测染料的荧光强度，我们可以判断细胞膜的完整性，从而间接反映细胞的存活率。
这种方法简便易行，但需要对染料浓度和染色时间进行优化，以避免染料自身对细胞的毒性影响。
另一种常用的方法是利用细胞膜通透性的染料如Calcein-AM和Ethidium Homodimer-1。
Calcein-AM可以通过细胞膜进入细胞内部，在细胞内被酯酶水解释放出荧光信号。
而Ethidium Homodimer-1只能通过细胞膜破损的部位进入细胞内部，并与细胞核酸结合发出荧光信号。
通过同时检测这两种染料的荧光强度，我们可以快速准确地判断细胞的存活率。
除了染料法，还可以利用细胞内酶的活性来检测细胞存活率。
比如，细胞存活率试剂盒中常用的细胞酶活性检测法。
这种方法通过测量某些细胞内酶的活性来反映细胞的存活状况。
细胞酶活性检测法可选择的酶包括乳酸脱氢酶（LDH）、细胞色素C等。
这些酶在细胞膜完整时位于细胞内，而在细胞膜破损时释放到培养基中。
通过测量培养基中酶活性的变化，可以快速准确地评估细胞的存活率。
细胞存活率的快速检测方法在细胞培养、药物筛选、细胞毒性测试等领域具有广泛的应用前景。
srb测细胞存活率
1、准备物品：1.1、96孔板1.2、化合物10mM，96孔板中1.3、10μL、100μL排枪1.4、阳性对照：紫杉醇（100μmol/L）1.5、无菌水1.6、培养基1.7、0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)1.8、TCA溶液(30%，w/v)1.9、1%的乙酸1.10、Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)2、细胞种板肿瘤细胞以每孔3000个种于96孔平底板，过夜贴壁。
3、化合物配制3.1 样品化合物用培养基配置成100μmol/L。
3.2以同样体积的DMSO用培养基配置，作为阴性对照。
3.3紫杉醇用培养基配置成10-100n mol/L，作为阳性对照。
4. 加药4.1、弃培养基，加入含有化合物的培养基，每孔100μL。
4.2、以含有等体积DMSO的培养基为阴性对照。
4.3、孵育72小时。
5、SRB方法检测5.1、细胞固定：每孔加入50μL4℃预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。
静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。
5.2、染色：待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。
5.3、检测：用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。
6、SRB检测的计算公式PG=100×(T0-Tx)/T0其中，T0：药物作用前的细胞经过固定、染色后测得平均吸光值；Tx：药物作用终点时细胞经过固定、染色后测得平均吸光值。
PG即Percentage Growth，是指药物作用的样品孔与阴性对照孔中细胞增殖量的百分率。
细胞活性检测方法以及操作流程
细胞活性检测方法以及操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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SYBR法试验流程及注意事项
具有价格优势
容易与非特异性双链DNA结合， 产生假阳性 但可以通过融解曲线 的分析，优化反应条件
对引物特异性要求较高
不能进行多重定量
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO定量检测等 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯 片结果验证，差异显示结果验证等
内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
Sample
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质粒标准品的制备
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目目的的基基因因
基因组 DNA
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使 用
质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
倍比梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
不同定量方法的比较
方法 SYBR Green I
方法
TaqMan 方法
优点
缺点
适用范围
适用性广 灵敏 方便 便宜
引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重定量
细胞复苏及存活率测定
细胞复苏及存活率测定细胞工程实验报告实验课程:细胞工程实验内容:细胞复苏及存活率测定一实验目的1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。
2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。
二实验原理在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
血球计数板:血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。
H型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。
计数室:每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，(0.1ul)三、主要仪器试剂设备:血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶(玻璃、塑料)、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、离心管等。
试剂: MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。
四实验步骤(复苏), 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36,37?恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在40,60秒内尽快解冻。
, 用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀后静置，? 30min后在显微镜下检查贴壁情况? 大部分细胞贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养箱中培养? 从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。
(细胞死活鉴定及计数) , 用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
, 取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
, 如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
细胞药物敏感性评价技术研究
细胞药物敏感性评价技术研究随着生物技术、化学技术的不断发展，越来越多的新药物不断涌现。
在药物研发过程中，对目标细胞的敏感性评价是至关重要的步骤。
细胞药物敏感性评价技术作为一种能够评价药物对细胞生长、增殖和代谢等方面影响的方法，由于其直观性、全面性和重复性等优点，已经成为药物研发过程中不可或缺的一环。
一、基本原理与方法细胞药物敏感性评价技术主要有三种：MTT法、SRB法和SYBR Green I法。
MTT法是利用线粒体内过氧化物酶还原酶将MTT显色反应，间接反映出细胞数量和代谢水平。
首先，将药物处理的细胞集中洒在透明的96孔板上，补充培养液到一定的体积，诱导生长后加入一定浓度的MTT。
随后，将溶液吸干，酒精或DMSO加入后震荡溶解，最终利用UV-Vis光谱仪读出吸光度值。
吸光度值越高，颜色越深，表示药物越不敏感。
SRB法是利用SRB染料与蛋白质反应，形成一种黄色复合物，间接反映了细胞数量。
类似MTT法，首先将药物处理的细胞集中洒在透明的96孔板上，加入一定浓度的SRB染料，待固定时间后用酸洗去除未结合染料，用碱转移染料到估量板中，利用分光光度计读取吸光度值。
吸光度值越低，表示药物越不敏感。
SYBR Green I法则是利用SYBR Green I染料与DNA结合，评价细胞数量的一种方法。
方法类似于MTT法和SRB法，首先将药物处理后的细胞导入透明的96孔板中，加入一定体积的SYBR Green I染料，待固定时间后用分光光度计读取吸光度值。
吸光度值表明样品的DNA含量，从而评价细胞数量和药物敏感性二、应用与发展细胞药物敏感性评价技术的应用非常广泛，主要应用于药物筛选、疗效评价和剂量控制方面。
在药物筛选方面，细胞药物敏感性评价技术可以在大规模样品中，筛选出潜在的药物候选物质。
在疗效评价方面，细胞药物敏感性评价技术可以评价不同药物对细胞的影响，从而为药物的临床治疗提供指导。
在剂量控制方面，细胞药物敏感性评价技术可以评价不同药物浓度下的细胞增殖情况，从而为药物的合理用药提供可靠参考。
SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤SOP15
Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:
SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤
●基本原理:
SRB是一种蛋白质结合染料，可与生物大分于中的碱性氨基酸结合，其颜色的变化与活细胞中的蛋白成正比。
●溶液的配制:
SRB溶液：以1%乙酸稀释SRB粉，至浓度为0.4%。
洗脱液：乙酸用单蒸水配制至1%浓度。
Tris base液：Tris base用单蒸水配制至10mmol浓度，调pH值为10.5。
●操作步骤:
1数种药物分别配成20X溶液.
2取培养瓶中细胞，调整细胞密度至105-107个/L，180μL/孔接种至96孔板。
3预培养24h后，每孔加药物20μL(终浓度为配制浓度的1/10)，每种药物设3个复孔，每孔总液量为200μL。
4在培养箱内培养48h，吸去培养液，用PBS小心洗涤一次（勿冲洗，因细胞未固定）。
广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心
5每孔加冰冷500g/L三氯乙酸（即贴壁细胞所用浓度为5 0%，若为悬浮细胞用80%浓度三氯乙酸））50μL，4℃固定60min。
6去离子水洗4～5次，风干。
7每孔加4g/L SRB溶液100μL作用室温染色30min,10 mL/L乙酸（1%）轻洗5次,风干。
9每孔加10mmol Tris base（pH=10.5）100μL摇动混匀，在平板振荡器上振荡5min。
10在酶联免疫检测仪测定A值，用空白对照调零，所用波长为490nm.
11将所获细胞生长抑制率定义为药物对细胞的体外抑制率.抑制率（%）=（无药细胞对照孔A值平均值-用药孔A值平均值）/无药细胞对照孔A值平均值×100%.。
SRB实验方法创新方法
SRB实验方法：1.细胞铺板96孔板：H1975细胞系：配制成80000个/ml的细胞悬液，使用排枪加样，每孔加入100μl细胞悬液，使每空细胞总数为8000个。
A431细胞系：配制成100000个/ml的细胞悬液，使用排枪加样，每孔加入100μl细胞悬液，使每孔细胞总数为10000个。
37℃孵箱，5%CO2培养过夜。
2.加药前：换液：使用排枪吸去96孔板中培养基，注意尽量吸干净，加入含有0.1%FBS的培养基150μl。
3.药物稀释：（1）、母液配制：根据化合物分子量，重量以及纯度，加入适量DMSO，配制成10mM浓度的母液，4度冰箱保存。
（2）、化合物稀释：化合物检测最高浓度为10μM，5倍稀释共十个梯度。
首先于EP管中用含0.1%FBS的培养基稀释待测化合物，并使其为终浓度4倍，即500μl 0.1%FBS培养基中加入2μl化合物母液，于振荡器中振荡均匀，取1深孔板，加入400μl 含0.1%FBS+4%DMSO的培养基（第一列孔除外），将EP管中稀释好的化合物加入第一列孔中，用排枪取100μl，加入到第二列孔中，振荡混匀后，换新枪尖再将第二列中培养基化合物取100μl加入到第三列中，振荡混匀，依次类推，直至10个浓度全部稀释完毕。
（3）、加药：加药前，用30μl 50% TCA固定6孔细胞，作为加药前T0对照。
将稀释好的化合物加入到铺有细胞的96孔板中，每孔50μl。
加药后，96孔板放入37度5%CO2的孵箱中，孵育72h。
4.孵育结束后，每孔加入50μl 50%TCA，置于4℃冰箱中固定1h。
5.弃液，300μl ddH2O洗5次，室温或于烘箱中放置，直至孔板完全干燥。
6.每空加入50μl 0.4%SRB，染色20min。
7.弃染液，用1%乙酸洗4次，室温干燥透。
8.加入200ul 10mM unbuffered Trisbase（PH=10.5），平板振荡至完全溶解。
9.酶标仪测定490nm吸光度。
最新药物SRB法实验步骤
药物SRB法实验步骤(根据原方案)SRB（黄酰罗丹明B）比色分析1.1%乙酸：量取2ml乙酸，定容到200ml。
4℃保存2.0.4%SRB200ML：称取0.8gSRB，溶于200ml乙酸中。
室温保存。
3.1 %TCA（三氯乙酸MV163.39）250ML:称取2.5gTCA加水定容至250ml，4℃棕色瓶或锡纸避光保存。
4．50%TCA100ml ：称取50gTCA，加入水定容至100ml。
4℃棕色瓶或锡纸避光保存5.10mM unbuffered Trisbase(PH10.5)500ML:称取0.6057g Trisbase（三羟甲基氨基甲烷MV121.14）加水定容至500ml4℃保存1青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚的配制青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚采用DMSO溶解，使用终浓度皆为0、3、10、30、100、300μg/ml。
阴性对照为1%的DMSO溶液。
青蒿素55mg/400ul 137.5μg/ ul 分子量：282.33蒿甲醚51mg/600ul 83.33 μg/ ul 分子量：298.37双氢青蒿素30mg/ml 30μg/ ul 分子量：284.35青蒿琥酯120Mm 46.13μg/ ul 分子量：384.42青蒿琥酯50mg/200ul 250μg/ ul将每种药稀释成30μg/ ul：a．取30ul 137.5μg/ ul的青蒿素，加107.5ul的DMSOb．取30ul 83.33 μg/ ul的蒿甲醚，加53.33ul的DMSOc．取30ul 46.13 μg/ ul的青蒿琥酯，加16.13ul的DMSO药物终浓度（μg/ ul）0 3 10 30 100 300 每孔药物体积（ul）0 0.02 0.0667 0.2 0.667 2 5孔药物体积（ul）0 0.1 0.333 1 3.33 10 补的DMSO体积(ul) 10 9.9 9.667 9 6.67 0 备注：上述的药物为稀释成30μg/ ul的药物。
细胞计数和存活率的测定
细胞计数和存活率的测定目的学会细胞计数和鉴别细胞死活的方法。
实验前的思考体外培养细胞常常需要测定细胞的培养密度，即单位体积内的细胞数，同时还需要鉴别细胞的死活，从而了解细胞的存活情况。
细胞密度测定最常用的工具是血球计数板，细胞死活测定的最简单方法是染料排斥法，常用鉴别染料为台酚蓝。
材料器具蟾蜍或小白鼠的骨髓细胞；显微镜，血球计数板，吸管，培养皿，试管，软布或擦镜纸；0.4%台酚蓝染液，两栖动物生理盐水（0.65%氯化钠溶液）或哺乳动物生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。
步骤1.制备骨髓细胞悬液具体方法参见第660页实验“赡蜍骨髓细胞染色体的制备”。
2.细胞计数准备取一副血球计数板，用软布或擦镜纸擦净，把盖玻片盖在血球计数板中央的计数室上。
把上述制得骨髓细胞悬液摇匀，用吸管吸取少量细胞悬液轻轻地滴在计数室边缘的斜面上，让它自然地流入盖玻片下的空隙，均匀地充满在计数室内。
悬液不能过多或过少，过多会使盖玻片浮起，过少会出现空隙或气泡。
如果有上述现象必须洗去，擦干重做，否则会影响计数准确性。
3.细胞计数方法静置2～3分钟，待细胞在计数室下沉后，在低倍镜下计数（详见本书第777页实验《血细胞的计数》。
4.细胞存活力鉴别取0.5毫升骨髓细胞悬液放入小试管里，再加0.4%台酚蓝染液0.5毫升，用吸管轻轻吹打混匀，染色2～3分钟。
然后把悬液摇匀，吸取悬液滴一滴在干净载玻片上，加盖玻片，在低倍镜下，随机计数上、下、左、中、右五个视野内的细胞总数和被染成蓝色的细胞数，蓝色细胞为死细胞，按以下公式计算细胞存活率：上述细胞计数和细胞存活力测定也可以合并在一起做。
分析和讨论1.细胞计数时，应该先调焦，看清计数板上的格线。
细胞密度太高时，计数不便，应该先把原液稀释若干倍后再计数，随后把测得结果乘以稀释倍数即为原液细胞密度。
计数时，以每大格点数在几十到一百多为宜。
2.台酚蓝染液一般不能渗透到活细胞里，所以活细胞不会着色。
但是如果延长染色时间或提高染液的浓度，造成活细胞膜损伤时，活细胞也可着色。
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Standard Operation Protocol（SOP）●技术方法名称:
SRB法检测细胞存活率或抑制率详细步骤
●基本原理:
SRB是一种蛋白质结合染料，可与生物大分于中的碱性氨基酸结合，其颜色的变化与活细胞中的蛋白成正比。
●溶液的配制:
SRB溶液：以1%乙酸稀释SRB粉，至浓度为0.4%。
洗脱液：乙酸用单蒸水配制至1%浓度。
Tris base液：Tris base用单蒸水配制至10mmol浓度，调pH值为10.5。
●操作步骤:
1数种药物分别配成20X溶液.
2取培养瓶中细胞，调整细胞密度至105-107个/L，180μL/孔接种至96孔板。
3预培养24h后，每孔加药物20μL(终浓度为配制浓度的1/10)，每种药物设3个复孔，每孔总液量为200μL。
4在培养箱内培养48h，吸去培养液，用PBS小心洗涤一次（勿冲洗，因细胞未固定）。
广东药学院药科学院新药筛选与药效评价中心
5每孔加冰冷500g/L三氯乙酸（即贴壁细胞所用浓度为5 0%，若为悬浮细胞用80%浓度三氯乙酸））50μL，4℃固定60min。
6去离子水洗4～5次，风干。
7每孔加4g/L SRB溶液100μL作用室温染色30min,10 mL/L乙酸（1%）轻洗5次,风干。
9每孔加10mmol Tris base（pH=10.5）100μL摇动混匀，在平板振荡器上振荡5min。
10在酶联免疫检测仪测定A值，用空白对照调零，所用波长为490nm.
11将所获细胞生长抑制率定义为药物对细胞的体外抑制率.抑制率（%）=（无药细胞对照孔A值平均值-用药孔A值平均值）/无药细胞对照孔A值平均值×100%.。