MTT法检测细胞相对存活率(教材95页)
MTT法检测细胞相对存活率(教材95页)
37°C培养0.5h；
（3）于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37°C培养1h； （4）吸弃培养液，各孔加入100ml DMSO，振荡培养板， 37°C培养10min； （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过与对照组比较得到实验组的存活率。
【结果与观察】
（1）加MTT后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫 蓝色颗粒溶解； （2）各组OD值取平均值后，以下式计算存活细胞百分数： 存活细胞%=（OD实验/OD对照）×100%
表15-2 细胞凋亡和细胞坏死的区别
区别点
起因 范围 细胞膜 染色质 细胞器 细胞体积 凋亡小体
细胞凋亡
生理或病理性 单个散在细胞 保持完整，一直到形成凋亡小体 凝聚在核膜下呈半月状 无明显变化 固缩变小 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬
细胞坏死
病理性变化或剧烈损伤 大片组织或成群细胞 破损 呈絮状 肿胀、内质网崩解 肿胀变大 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬
基因组DNA
蛋白质合成 调节过程 炎症反应
有控降解，电泳图谱呈梯状
有 受基因调控 无，不释放细胞内容物
随机降解，电泳图谱呈涂抹状
无 被动进行 有，释放内容物。
图左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）
Ho.33342与PI荧光双染显示凋亡与坏死细胞 （教材168页）
【方法与步骤】
（1）传代5×104子宫颈癌细胞HeLa于含有盖玻片的24孔板， 37°C培养 过夜； （2）每孔加入5ml的大蒜素，以药物溶剂作对照， 37°C培养0.5~1h； （3）加入PBS，洗细胞5min X 3次； （4）取出细胞爬片，加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避 光放置30min； （5）加入PBS，洗细胞5min X 3次；
MTT法又称MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法其检测原理
MTT法又称MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法其检测原理MTT法，即3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑（MTT）比色法，是一种常用的检测细胞存活和生长的方法。
MTT法的基本原理是通过检测细胞内的线粒体活性来评估细胞的存活状况和生长情况。
线粒体是细胞内能量产生中心和细胞呼吸的主要场所，其功能完整与否直接影响细胞的生活能力和活动状态。
MTT法利用MTT试剂与细胞内的线粒体还原酶作用产生可溶性的蓝紫色产物，通过比色测定可间接反映细胞数量和细胞代谢活性。
MTT法的操作步骤如下：1.培养细胞：将需要检测的细胞在细胞培养板中培养至合适的生长期，使细胞处于活跃生长状态。
2.处理试样：根据实验的需要，对细胞进行不同处理，例如添加药物，感染病毒等。
3.加入MTT试剂：将MTT试剂以适当的浓度加入细胞培养板的培养液中，并保持细胞在适宜的温度和环境条件下培养一段时间，通常为2-4小时。
4.溶解MTT产物：将培养液完全移除，加入溶解剂如二甲基亚砜(DMSO)，使产生的蓝紫色MTT产物完全溶解。
5. 比色测定：将溶解后的MTT产物转移至96孔板或比色皿中，利用分光光度计在570 nm波长下测定吸光度值。
吸光度值的高低代表了细胞的存活状况和生长活性。
MTT法的优点在于操作简单、结果读取方便、对细胞破坏小等。
同时，MTT法可以应用于不同类型的细胞，包括哺乳动物细胞、微生物细胞等。
然而，MTT法也存在一定的局限性，比如不能直接反映细胞的精细结构和功能等。
总之，MTT法是一种常用的检测细胞存活和生长的方法，利用线粒体活性作为指标，通过MTT试剂的比色测定来间接评估细胞的数量和代谢活性。
在细胞研究、肿瘤学和药物筛选等领域具有广泛的应用前景。
mtt法检测细胞活性实验报告
mtt法检测细胞活性实验报告MTT法检测细胞活性实验报告细胞活性是评估细胞健康和功能的重要指标。
在细胞培养实验中，MTT法被广泛应用于评估细胞的存活率和代谢活性。
本实验旨在通过MTT法检测细胞活性，探究不同处理条件对细胞的影响，并分析实验结果。
实验材料和方法：1. 细胞培养：选取人类肺癌细胞株A549作为实验对象，通过传代培养维持细胞的生长状态。
2. 细胞处理：将A549细胞均匀分配到不同处理组，包括对照组和实验组。
实验组根据需求添加不同浓度的药物处理，对照组则不添加药物。
3. MTT法测定细胞活性：将处理后的细胞悬液均匀分配到96孔板中，每组设置3个孔位。
加入MTT溶液，孵育一定时间后，加入溶解液，最后测定吸光度。
实验结果：通过MTT法测定细胞活性，我们得到了以下结果。
1. 实验组A：添加药物A处理的细胞活性明显下降。
随着药物A浓度的增加，细胞存活率呈现逐渐下降的趋势。
最高浓度的药物A处理组，细胞存活率仅为对照组的30%。
2. 实验组B：添加药物B处理的细胞活性呈现剂量依赖性下降。
低浓度的药物B处理组，细胞存活率与对照组相近。
高浓度的药物B处理组，细胞存活率显著下降，仅为对照组的50%。
3. 实验组C：添加药物C处理的细胞活性呈现非线性变化。
低浓度的药物C处理组，细胞存活率略高于对照组。
中等浓度的药物C处理组，细胞存活率降低，但仍高于对照组。
高浓度的药物C处理组，细胞存活率显著下降，仅为对照组的40%。
讨论与分析：根据实验结果，我们可以得出以下结论。
1. 药物A对A549细胞具有明显的抑制作用。
随着药物A浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，表明药物A可能具有抗肿瘤活性。
然而，高浓度的药物A处理组细胞存活率仅为30%，可能存在细胞毒性作用。
2. 药物B对A549细胞的影响呈现剂量依赖性。
低浓度的药物B处理组细胞存活率与对照组相近，可能对细胞没有明显影响。
然而，高浓度的药物B处理组细胞存活率下降，表明药物B可能对细胞产生抑制作用。
MTT
ODM：空白组，只加培养基，用来使机器吸光值调0的被试组。
(避光)每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。(通常加入DMSO后在台子上铺张卫生纸十字振荡几次等一会儿拿到楼下的酶联免疫检测仪处在检测前机器会自动低速振荡2min)
4.
选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光值OD，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。
4.吹打次数100次左右，就可以吹打均匀了。铺板时，每接种一排复孔后反复吹打3~4次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。
5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后在台子上铺张纸，将板向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些
3.
培养16~48h后，(避光)每孔加入MTT溶液20ul(5mg/ml，用ph4.7的PBS配)，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。(若药物与MTT能够反应，则先弃去培养液，用PBS冲2~3遍后，再加入含MTT的培养液)
终止培养，小心吸去孔内培养液。
实验步骤
1.
用含10%的胎小牛血清的培养基配成单个细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，用无菌的PBS填充边缘孔。
最新MTT法检测细胞活力
实验结果统计学处理
公式如下： lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率
举例
药物浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、 0.000001umol/l，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率 为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025
关于细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了;培养板要用好的（最好进口板 ），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 且而细胞过密或者 过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。 故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定。 悬浮细胞每孔的细胞 数可达到105,贴壁细胞可为103-104。
OD值的测定
至于测定波长的选择是因显色溶液而异的。对于DMSO，溶解后呈紫（ 红）色，490nm有最大吸收值 。 DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而ＳＤＳ做为溶解液测吸收光 值，其值可在三天内保持不变。 细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另 外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细 胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔 间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很 可能是细菌污染。
MTT检测法
MTT法检测细胞存活和生长之袁州冬雪创作MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是活络度高、经济. 缺点：由于MTT经还原所发生的甲瓒产品不溶于水，需被溶解后才干检测.这不但使工作量增加，也会对实验成果的准确性发生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害. MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保管即可.在配制和保管的过程中，容器最好用铝箔纸包住.需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不克不及测定细胞相对数.在用酶标仪检测成果的时候，为了包管实验成果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内. MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保管两周内有效，或配制成5mg/ml保管在-20度长期保管，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没需要一下子配那末多,尤其当MTT变成灰绿色时就相对不克不及再用了. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操纵台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶.MTT法实验步调贴壁细胞：1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边沿孔用无菌PBS填充）. 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察. 4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h.若药物与MTT可以反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液. 5、终止培养，小心吸去孔内培养液. 6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD490nm处丈量各孔的吸光值. 7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，顺次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边沿孔用无菌水填充）.每板设对照（加100l 1640）. 2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察. 3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h.（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步调4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值. 5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔.关于MTT实验总结MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础.MTT为黄色化合物，是一种承受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不克不及将MTT还原）.还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，操纵酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目.也可以用DMSO来溶解.MTT粉末和溶液保管时都需要避光，用铝箔纸包好便可以.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，感觉这样比较好.MTT步调：1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目标和要求决议培养时间）.3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解.4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录成果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.MTT注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度.2、防止血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液停止试验.在呈色后尽可以吸尽孔内残存培养液.3、设空缺对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空缺对照.其他试验步调坚持一致，最后比色以空缺调零.4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度.把药品稀释成分歧的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50.要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06.代入计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4).其中：Xm:lg 最大剂量；I:lg(最大剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn:最小阳性反应率；抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值.公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 .例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适？根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO ，加DMSO 之前要尽可以去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒停止比色测定.一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150μl DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值.一般要低于IC50，防止非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多.我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h.一般肿瘤细胞系空缺处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较分明.有一点观点：我感觉做任何实验都需要试探适合你的实验的条件，不克不及用一个protocol去套所有的实际.拿MTT来讲，这个实验是间接检测活细胞数目标，而需要确定活细胞数目标实验的目标是各种各样的.在分歧的目标下，就需要分歧的条件.以药物筛选来讲，为了准确评价药物的作用，培养时间仅用3～5天可以是不敷的；对于某些细胞来讲，加药培养时可以用维持培养基或无血清培养基更合适.因此，诸如MTT和DMSO加入量、孵育时间等应因事而异，找到最适合你实验要求的就好.MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也经常常使用来检测细胞的增殖情况.MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀.由于一般先容园子里已经很多，笔者将自己的心得依照实验流程与大家交流交流.1、培养好细胞点板.养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法.如果知道了细胞的名字，便可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是尺度培养方法.当然可以根据自己实验要求停止修改.由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概懂得细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况.这时可以将细胞不停止计数，将消化好的细胞混匀后（可以是10 ml）直接在一个废弃（最好停止过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪一个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那末就将细胞浓度再稀释4倍便可以正式点板了，这时顺便将细胞停止计数（因为实验记录要求写啊）.这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操纵.注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不平均，代表性是很差的.建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它.点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大.2、点板规划.其实这一点很多人不懈一顾.如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要鄙吝96-孔板的四周边孔，这32个边孔不克不及使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分.因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及外面的药物会出现稀释现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边沿效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不必.3、加MTT.如果确认你考查的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有掌控，建议在加MTT前换一次液；如果你必定考查的药物的氧化还原性很强，比方谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可以是你不需要的.4、加入MTT后的反应.时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO.为了将沉淀溶解完全，尽可以将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min.提醒：如果你的细胞贴壁欠好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁欠好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体.关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差别不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了.至于DMSO的体积差别分歧为什么不影响检测值已经被数学证了然，在此我未几说，如果有人不大白我再证明给他看.当然为了养成杰出的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好.5、检测MTT.还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，需要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收.6、吸收值分析.在抱负的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可以已经超出线性范围.这个原理在朗伯-比尔定律中有诠释.7、如果你感觉MTT中出现的问题欠好处理，那末建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操纵上简化些，当然，费用也稍微高一些.请问在做MTT实验室是否遇到过下面的情况：调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变更，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，其实不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺大的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的大，如果把调零孔的值减掉之后，OD值为负值.别的加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红.对照组测出的OD值在0.4～0.5之间.接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm.我做了很多次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象.我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的成果：三个浓度下的OD值两次的都比较吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右.不知是什么原因，请分析.别的，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那末高吧，而且你复孔之间的差值一般是多少？欠好意思，你说的现象我没出现过.还得注意几点：1、MTT应该新鲜配制，在4度保管最多不克不及超出2周，也有说10天的，反正不克不及太久.2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不克不及用的，应该加入无菌PBS.3、如果有心，你可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析.4、加入DMSO之前应尽可以将培养液弃除干净.问：96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法断定板里细胞的死活了.不知道有没有什么法子?丁香网友chinaefulle认为：1、对于贴壁细胞：死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好.2、对于悬浮细胞似乎欠好直接断定.有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，染不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内便可以断定，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不容易着色.如果96-孔板养欠好，可以试着用24孔板.如果是旧板养欠好，就试着用新板.为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3 h，但不要太长，否则板就黄了.还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试.如果你的细胞欠好养，尽可以不要用旧板.问：加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变更，为黄色.我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，成果颜色就分歧错误了，干扰了MTT的检测.丁香网友chinaefulle认为：MTT为淡黄色，用0.1 M 的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20 ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200 ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了.不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，便可以导致MTT越不稳定.问：我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm，和您说的波长所测值会有很大差别吗？丁香网友chinaefulle认为：如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性.570nm的吸收也是挺高的.波长分歧吸光度会有差别，但不影响检测成果的趋势变更.如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射发生的），那末选用最大吸收波长有利于减少非特异性吸收所导致的误差.问：我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？丁香网友chinaefulle认为：单波长也是可以用的.双波长主要可以扣除非特异性吸收，比方细胞颗粒造成的吸收和板孔布景导致的非均一性吸收.如果使用96孔板前先检测板孔的布景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标识表记标帜好不必，单波长也能大体扣除因此造成的非特异吸收.对于细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对成果断定的方向性不会有太大影响.下图A 是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对于你的酶标仪建议使用470 nm.氧化型MTT的吸收曲线还原型的MTT吸收曲线问：MTT用PBS配制,原先培养基中10%FBS会影响成果吗?丁香网友chinaefulle认为：不会，因为上清会弃去，每个孔中都平行有10%FBS，即使有影响，其影响的大小也是可以通过阴性对照扣除掉.问：我一直在想一个问题，为什么网上见的protocol 绝大部分都是MTT加10～20ul，然后放3～4h再测？是为了节俭试剂？我想在某种程度上时间能更重要些，但为什么不增加MTT的量，减少孵育时间呢？从我的实验来看，增加MTT、降低孵育时间是可行的.但是现在也存在一个问题，就是即使用到5000/well，现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上.是否有MTT增加的原因？这个还在停止验证.希望有我这种实验履历和想法的同行一起讨论.丁香网友chinaefulle认为：你提的这个问题很好，值得探索.但是今朝都是约定加入10%体积的MTT，然后反应3-4h.我个人猜测可以与以下原因有关（纯属猜测，因为没做过实验）：1、根据我的经历，MTT的溶解度不是太好，所以0.5%的MTT母液（相当于10X）已经可以接近最大溶解极限，而直接用含血清的培养液配制因为带入的成分复杂，MTT保管的稳定性可以存在疑问.所以使用孵育3-4h的条件.2、MTT是琥珀酸脱氢酶的人工底物，底物浓度过高可以导致酶抑制，当然，MTT是否有此作用值得实验验证，但大多数酶的底物浓度过高时会发生酶的抑制作用（直接的抑制作用）.问：我的MTT是用PBS配的，5mg/ml，因为每孔的溶液量为100ul，所以我加了10ul.现在我的调零孔孵育4小时后为黄色，但是加入DMSO之后，还是红色的，490nm下的吸收值为0.2左右.莫非是我买的培养基或是血清有问题，我用的是GIBCO的1640培养基，杭州四季青的血清.丁香网友chinaefulle认为：1、MTT温孵4h可以会发生自发的氧化还原作用而发生颜色.因为你是和培养基血清一起孵育的，你的空缺孔470nm吸收在0.2左右，因该说是预期值，要减少它，在你的条件下只能靠减少反应时间.但是要注意你的“有细胞但不加药的孔”吸光度是多少，如果吸光度小，比方低于0.8，那末建议你增加细胞浓度.2、尽可以不要用延长反应时间来增加吸光度，因为MTT 会自发转化，尤其是有血清的帮忙下（血清中含有NADH、Fe3+等物质，这些物质能促进MTT转化），通过增加细胞数减少反应时间来提高检测孔和空缺孔的相对差值是可行的，而通过增加反应时间可以很难凑效.这一点许多书上没说.你除去培养基后是否在加入同体积的PBS.我曾试过，把培养基吸出，然后加同体积的PBS，再加入MTT，测出的值要比有培养基可孔的值低，当时好像能低0.2左右（490nm）.丁香网友山百合的做法是：去除培养基后，直接加用PBS稀释的MTT（MTT母液也是用PBS配制的）200微升，放置1h再加200微升的DMSO.丁香网友chinaefulle认为：估计采取提高MTT浓度以减少孵育时间的做法可以不成行.仅供参考，来由如下：我们惯例加入的MTT是过量的，反应4h后96孔板的溶液仍是黄色，改变较小，这标明MTT加入的量的确是过量的.过量的底物与酶反应实际上是零级动力学过程，即酶已经被底物饱和.如果再增加底物浓度实际上也改变不了一定时间内的产品量.也就是说，底物再增加10倍，要想获得原先的吸光度，以前用3h，现在可以还是要用将近3h.因此意义较小.当然，我用的是实际分析，应该以实验为依据.仅供你参考，如果能分明缩短反应时间那末还是很有意义的.问：我前两天做了两板，孵育四小时候，把液体倒出時发现MTT还原物也被倒出了一些！成果很欠好！而且用移液枪吸出的也带有还原物！我该怎么办呢？问题2：由于我所作的药溶解度非常低一百多微克每毫升就析出！使等倍稀释很不准！有什么法子处理？我们在Hanks液里加了牛血清白蛋白提高溶解度可行吗？不是说血清会影响成果吗？丁香网友山百合认为：1、注意细胞状态，细胞状态好的时候不会掉；或者倒液前离心；2、药物可用DMSO溶解成母液，一般为使用浓度的0.1%左右，不过液有文献报导用1%，我看的文献有用1%、0.5%、0.1%的，尽可以要使工作液中DMSO的含量低，以免影响细胞生长状态.不要加蛋白促溶，一方面是否能起促溶作用不明白，另外一方面蛋白可以吸附药物，尤其是小分子药物问：大家都是用DMSO吗？怎么看到有的文献是用HCl-isopropanol溶液，然后570nm测定？丁香网友chinaefulle认为：DMSO的使用比盐酸-异丙醇方便，至少盐酸-异丙醇溶液你还得配置，而DMSO拿来便可以用，而且使用浓盐酸时你得小心一点，要注意平安.而DMSO就没有这么费事.当然DMSO和盐酸-异丙醇都可以用来裂解细胞溶解被还原的MTT，如果手头上没有DMSO，用盐酸-异丙醇溶液也是可以的.至于盐酸-异丙醇如何配置可以查查书.问：MTT还能用于组织标本中的细胞增殖检测啊?该怎么弄呢?丁香网友chinaefulle认为：应当可以，只要组织是活的，因为MTT检测与琥珀酸脱氢酶活性有关，只要组织中有此酶，MTT反应同样会发生.当然组织需要匀浆.申明以下，以上是实际推测，我还没试过，如有人试过，无妨也来交流交流.MTT试验的一些细节问题(一)细胞1.选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于分歧细胞贴壁后面积差别很大，因此，在停止MTT试验前，要停止预实验检测其贴壁率、倍增时间以及分歧接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以包管培养终止致细胞过满.这样，才干包管MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差别.2.药物浓度的设定.一定要多看文献，参考他人的成果再定个比较大的范围先初筛.根据自己初筛的成果缩小浓度和时间范围再细筛.切记！否则，可以你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间.3. 时间点的设定.在分歧时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到分歧时间点的抑制率变更情况，画出变更的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）阿谁时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表示的最分明）.4.培养时间.200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来讲，很难维持68h，如果营养不敷的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于运动，影响成果，我们是在48h换液的.5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不克不及测定细胞相对数.做MTT时，尽可以无菌操纵，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高.6.实际未必都是对的.要根据自己的实际情况调整.设置调零孔，对照孔，加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜.对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，分歧的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入分歧浓度的药物.8.防止血清干扰.用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液停止.在呈色后，尽可以吸净培养孔内残存培养液.(二)实验步调贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边沿孔用无菌PBS填充）.。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
MTT检测细胞活性的操作方法
MTT检测细胞活性的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/mL，须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg，250mg或1g。
1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mL PBS来溶解。
具体做法：预先在50mL离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20mL PBS，从中先吸取500-1000uL PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50mL离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1mL，所以分装时可考虑每管分装1mL。
mtt检测细胞活性原理
mtt检测细胞活性原理细胞活性检测是评价细胞生存和增殖能力的一种常用方法。
而4,5-二苯基四唑溴化盐（MTT）检测法是其中一种常见的细胞活性检测方法。
本文将介绍MTT检测细胞活性的原理和具体操作步骤。
一. MTT检测细胞活性的原理在MTT检测法中，MTT是一种无色的化合物，可以通过细胞内的酶系统还原为有色的甲基四唑（formazan）晶体。
这种甲基四唑晶体以紫色或蓝紫色的形式存在，并可以通过吸光度测定来间接反映细胞的活性水平。
1. MTT的还原机制MTT分子进入活细胞后，会被活细胞内的线粒体脱氢酶（mitochondrial dehydrogenases）和其他一些内质网酶所还原。
这个还原过程是由细胞内的NAD(P)H和酶的存在而促进的。
在这个过程中，MTT的双键C=C将被还原为两个甲基基团（CH3）。
2. 甲基四唑晶体的形成经过还原，MTT成为可溶于有机溶剂的甲基四唑盐。
这种盐可以在溶液中凝聚成晶体，晶体的颜色由浅紫色到暗紫色不等，与MTT还原的程度和细胞的代谢活性有关。
晶体的形成是细胞代谢活性的直接指标。
3. 吸光度测定为了测定细胞活性，甲基四唑晶体通常需要被提取到有机溶剂（如二甲基亚砜）中。
而后，溶液的吸光度将通过分光光度计进行测定。
一般来说，吸光度与细胞的代谢活性成正比。
二. MTT检测细胞活性的步骤下面将详细介绍MTT检测细胞活性的操作步骤。
1. 细胞培养首先，准备好所需的细胞培养基和含有测试物的培养基。
将细胞在含有培养基的培养皿中进行培养，并使其达到所需的细胞数。
2. 处理样本将要测试的样本处理成适当的浓度，可以是溶液、药物或其他化合物。
根据实验需求和样本特性选择合适的处理方式。
3. 孵育将处理好的样本加入细胞培养皿中，并将其孵育在适当的条件下。
根据需要，可以选择不同的孵育时间。
4. 加入MTT溶液在孵育结束后，在细胞培养皿中加入MTT溶液。
溶液中MTT的最终浓度可以根据具体实验需求进行调整，一般在0.5~1.0 mg/ml之间。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg /ml，抽滤除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（适用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
mtt法检测细胞活性原理
mtt法检测细胞活性原理
MTT法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理基于细胞内的代谢活性。
以下为实验步骤及原理解释，其中省略了标题：
1. 细胞培养：首先，将需要进行活力检测的细胞进行培养。
常见的细胞培养基包含营养成分和适宜的生长条件，如适温、适湿度和适透气性。
2. 处理样本：将细胞培养至一定密度后，根据实验需要进行不同的处理。
例如，给予药物处理，确保适当时间和浓度。
3. MTT染色液制备：MTT（3-(4,5-二甲基硫酰基)-2,5-二苯基-2H-四唑）是一种黄色体内还原剂，可穿透细胞膜并转化为紫色的维甲酸鞘。
将MTT按照实验需要溶解于无菌磷酸盐缓冲液中，制备MTT染色液。
4. 细胞处理：将处理后的细胞溶液均匀地分配到96孔板中。
为了排除干扰，设置空白对照及阳性对照。
5. MTT染色：向细胞孔中加入MTT染色液，使其与细胞内的还原剂反应。
将细胞培养在37°C的细胞培养箱中，一般为4小时。
6. 结晶溶解：将培养液中的MTT染色产物溶解。
加入溶液（如二甲基亚硫酰胺）使产生的紫色颗粒溶解。
7. 光密度测定：使用酶标仪等工具，测量液体的光密度（OD
值）。
OD值正比于细胞活力。
8. 数据分析：根据不同处理组的OD值，计算细胞活力的百分比。
活力高的样本表现出较高的OD值。
MTT法通过测量细胞内活性代谢物的转化，能够准确反映细胞生长状态和代谢活力。
这种方法广泛应用于药物筛选、细胞毒性测试和细胞增殖研究等领域。
MTT法检测细胞活力 ppt课件
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关于细胞的接种(铺板)
• 细胞过了30代以后就不要用了;培养板要用好的（最好进口 板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
• 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 且而细胞过密或 者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳 。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
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实验结果统计学处理
• 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分 析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显 著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞 生线曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或 计算抑制率。 OD对照组-OD实验组 ×100 % • 抑制率 % = OD对照组
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OD值的测定
• 至于测定波长的选择是因显色溶液而异的。对于DMSO，溶解后呈紫 （红）色，490nm有最大吸收值 。 • DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而ＳＤＳ做为溶解液测吸 收光值，其值可在三天内保持不变。 • 细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小； 另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的； 细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的 孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高， 很可能是细菌污染。
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活细胞+MTT
琥珀酸脱
氢酶
紫蓝色结晶物 Formazan
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贴壁细胞操作步骤
1. 接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血 清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接 种于96孔培养板中，每孔体积90 ul。 （边缘孔用PBS或空白 培养基填充）。 2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2 及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板 ，大约12h），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即 可加药，每孔加药10 ul，一般设5个复孔。 3. 5%CO2，37℃孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观 察。
MTT法检测细胞活性
MTT法MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
什么是MTT法?又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT检测法
MTT法检测细胞存活和生长之迟辟智美创作MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并堆积在细胞中，而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、年夜规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济. 缺点：由于MTT经还原所发生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才华检测.这不单使工作量增加，也会对实验结果的准确性发生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害. MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保管即可.在配制和保管的过程中，容器最好用铝箔纸包住.需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数.在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内.MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC 避光保管两周内有效，或配制成5mg/ml保管在-20度长期保管，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没需要一下子配那么多,尤其当MTT酿成灰绿色时就绝对不能再用了. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，究竟时间较短，或者你不放心的时候可以把把持台上的照明灯关失落.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶.MTT法实验步伐贴壁细胞：1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）. 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，第二天上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，颠倒显微镜下观察.4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h.若药物与MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液.5、终止培养，小心吸去孔内培养液.6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充沛溶解.在酶联免疫检测仪OD490nm处丈量各孔的吸光值.7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对比孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，顺次第将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释(贮存液100g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）.每板设对比（加100l 1640）.2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，颠倒显微镜下观察.3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h.（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步伐4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸失落上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充沛溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值.5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对比孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔.关于MTT实验总结MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础.MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）.还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目.也可以用DMSO来溶解.MTT粉末和溶液保管时都需要避光，用铝箔纸包好就可以.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比力好.MTT步伐：1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）.3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml 用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充沛融解.4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.MTT注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度.2、防止血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验.在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液.3、设空白对比：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对比.其他试验步伐坚持一致，最后比色以空白调零.4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超越这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度.把药品稀释成份歧的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后获得50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50.要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最年夜浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06.代入计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4).其中：Xm:lg 最年夜剂量；I:lg(最年夜剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最年夜阳性反应率；Pn:最小阳性反应率；抑制率=1-加药组OD值/对比组OD值.公式中的最年夜最小阳性反应率就是最年夜最小抑制率 .例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加几多1640培养基，几多MTT和DMSO合适？根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO ，加DMSO之前要尽量去失落培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定.一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗失落上清液，注意不要将甲瓉洗失落，然后每孔加150μl DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值.一般要低于IC50，防止非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多.我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h.一般肿瘤细胞系空白处置的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比力明显.有一点看法：我觉得做任何实验都需要摸索适合你的实验的条件，不能用一个protocol去套所有的实际.拿MTT来说，这个实验是间接检测活细胞数目的，而需要确定活细胞数目的实验的目的是各种各样的.在分歧的目的下，就需要分歧的条件.以药物筛选来说，为了准确评价药物的作用，培养时间仅用3～5天可能是不够的；对某些细胞来说，加药培养时可能用维持培养基或无血清培养基更合适.因此，诸如MTT和DMSO加入量、孵育时间等应因事而异，找到最适合你实验要求的就好.MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也经经常使用来检测细胞的增殖情况.MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀.由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得依照实验流程与年夜家交流交流.1、培养好细胞点板.养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法.如果知道了细胞的名字，就可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法.固然可以根据自己实验要求进行修改.由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，年夜概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞年夜概能长满96-孔板的80-90%，如果筹算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况.这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处置）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比力合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）.这样就OK 了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上把持.注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的.建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它.点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂年夜.2、点板规划.其实这一点很多人不懈一顾.如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分.因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会呈现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂年夜，既然如此，不如不用.3、加MTT.如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有掌控，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的.4、加入MTT后的反应.时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO.为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min.提醒：如果你的细胞贴壁欠好，此时的沉淀在弃去液体时易丧失，因此贴壁欠好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处置处置，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体.关于DMSO的量，每孔的体积有点儿不同不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了.至于DMSO的体积不同分歧为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我未几说，如果有人不明白我再证明给他看.固然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好.5、检测MTT.还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最年夜细说波长检测就是了，最年夜波长，年夜概在550nm附近，需要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收.6、吸收值分析.在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处置组的吸收值应该在，太小检测误差占的比例较多，太年夜吸收值可能已经超越线性范围.这个原理在朗伯-比尔定律中有解释.7、如果你觉得MTT中呈现的问题欠好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但把持上简化些，固然，费用也稍微高一些.请问在做MTT实验室是否遇到过下面的情况：调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太年夜变动，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，其实不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺年夜的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的年夜，如果把调零孔的值减失落之后，OD值为负值.另外加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红.对比组测出的OD值在0.4～0.5之间.接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm.我做了很屡次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象.我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的结果：三个浓度下的OD值两次的都比力吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右.不知是什么原因，请分析.另外，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那么高吧，而且你复孔之间的差值一般是几多？欠好意思，你说的现象我没呈现过.还得注意几点：1、MTT应该新鲜配制，在4度保管最多不能超越2周，也有说10天的，反正不能太久.2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不能用的，应该加入无菌PBS.3、如果有心，你可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减失落参比吸收后再分析.4、加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净.问：96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法判断板里细胞的死活了.不知道有没有什么法子?丁香网友chinaefulle认为：1、对贴壁细胞：死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好.2、对悬浮细胞似乎欠好直接判断.有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，染不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内就可以判断，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不容易着色.如果96-孔板养欠好，可以试着用24孔板.如果是旧板养欠好，就试着用新板.为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3 h，但不要太长，否则板就黄了.还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试.如果你的细胞欠好养，尽量不要用旧板.问：加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太年夜变动，为黄色.我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，结果颜色就分歧毛病了，干扰了MTT的检测.丁香网友chinaefulle认为：MTT为淡黄色，用0.1 M的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20 ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200 ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了.不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，就可能招致MTT 越不稳定.问：我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm，和您说的波长所测值会有很年夜不同吗？丁香网友chinaefulle认为：如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性.570nm的吸收也是挺高的.波长分歧吸光度会有不同，但不影响检测结果的趋势变动.如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射发生的），那么选用最年夜吸收波长有利于减少非特异性吸收所招致的误差.问：我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？丁香网友chinaefulle认为：单波长也是可以用的.双波长主要可以扣除非特异性吸收，比如细胞颗粒造成的吸收和板孔布景招致的非均一性吸收.如果使用96孔板前先检测板孔的布景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标识表记标帜好不用，单波长也能年夜体扣除因此造成的非特异吸收.对细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对结果判断的方向性不会有太年夜影响.下图A是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对你的酶标仪建议使用470 nm.氧化型MTT的吸收曲线还原型的MTT吸收曲线问：MTT用PBS配制,原先培养基中10%FBS会影响结果吗?丁香网友chinaefulle认为：不会，因为上清会弃去，每一个孔中都平行有10%FBS，即使有影响，其影响的年夜小也是可以通过阴性对比扣除失落.问：我一直在想一个问题，为什么网上见的protocol绝年夜部份都是MTT加10～20ul，然后放3～4h再测？是为了节省试剂？我想在某种水平上时间能更重要些，但为什么不增加MTT的量，减少孵育时间呢？从我的实验来看，增加MTT、降低孵育时间是可行的.可是现在也存在一个问题，就是即使用到5000/well，现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上.是否有MTT增加的原因？这个还在进行验证.希望有我这种实验经历和想法的同行一起讨论.丁香网友chinaefulle认为：你提的这个问题很好，值得探索.可是目前都是约定加入10%体积的MTT，然后反应3-4h.我个人猜想可能与以下原因有关（纯属猜想，因为没做过实验）：1、根据我的经验，MTT的溶解度不是太好，所以0.5%的MTT母液（相当于10X）已经可能接近最年夜溶解极限，而直接用含血清的培养液配制因为带入的成份复杂，MTT保管的稳定性可能存在疑问.所以使用孵育3-4h的条件.2、MTT是琥珀酸脱氢酶的人工底物，底物浓渡过高可能招致酶抑制，固然，MTT是否有此作用值得实验验证，但年夜大都酶的底物浓渡过高时会发生酶的抑制作用（直接的抑制作用）.问：我的MTT是用PBS配的，5mg/ml，因为每孔的溶液量为100ul，所以我加了10ul.现在我的调零孔孵育4小时后为黄色，可是加入DMSO之后，还是红色的，490nm下的吸收值为0.2左右.难道是我买的培养基或是血清有问题，我用的是GIBCO的1640培养基，杭州四季青的血清.丁香网友chinaefulle认为：1、MTT温孵4h可能会发生自发的氧化还原作用而发生颜色.因为你是和培养基血清一起孵育的，你的空白孔470nm吸收在0.2左右，因该说是预期值，要减少它，在你的条件下只能靠减少反应时间.可是要注意你的“有细胞但不加药的孔”吸光度是几多，如果吸光度小，比如低于0.8，那么建议你增加细胞浓度.2、尽量不要用延长反应时间来增加吸光度，因为MTT 会自发转化，尤其是有血清的帮手下（血清中含有NADH、Fe3+等物质，这些物质能增进MTT转化），通过增加细胞数减少反应时间来提高检测孔和空白孔的相对差值是可行的，而通过增加反应时间可能很难凑效.这一点许多书上没说.你除去培养基后是否在加入同体积的PBS.我曾试过，把培养基吸出，然后加同体积的PBS，再加入MTT，测出的值要比有培养基可孔的值低，那时好像能低0.2左右（490nm）.丁香网友山百合的做法是：去除培养基后，直接加用PBS稀释的MTT（MTT母液也是用PBS配制的）200微升，放置1h再加200微升的DMSO.丁香网友chinaefulle认为：估计采纳提高MTT浓度以减少孵育时间的做法可能不成行.仅供参考，理由如下：我们惯例加入的MTT是过量的，反应4h后96孔板的溶液仍是黄色，改变较小，这标明MTT加入的量简直是过量的.过量的底物与酶反应实际上是零级动力学过程，即酶已经被底物饱和.如果再增加底物浓度实际上也改变不了一按时间内的产物量.也就是说，底物再增加10倍，要想获得原先的吸光度，以前用3h，现在可能还是要用将近3h.因此意义较小.固然，我用的是理论分析，应该以实验为依据.仅供你参考，如果能明显缩短反应时间那么还是很有意义的.问：我前两天做了两板，孵育四小时候，把液体倒出時发现MTT还原物也被倒出了一些！结果很欠好！而且用移液枪吸出的也带有还原物！我该怎么办呢？问题2：由于我所作的药溶解度非常低一百多微克每毫升就析出！使等倍稀释很禁绝！有什么法子解决？我们在Hanks液里加了牛血清白卵白提高溶解度可行吗？不是说血清会影响结果吗？丁香网友山百合认为：1、注意细胞状态，细胞状态好的时候不会失落；或者倒液前离心；2、药物可用DMSO溶解成母液，一般为使用浓度的0.1%左右，不外液有文献报道用1%，我看的文献有用1%、0.5%、0.1%的，尽可能要使工作液中DMSO的含量低，以免影响细胞生长状态.不要加卵白促溶，一方面是否能起促溶作用不明确，另一方面卵白可以吸附药物，尤其是小分子药物问：年夜家都是用DMSO吗？怎么看到有的文献是用HCl-isopropanol溶液，然后570nm测定？丁香网友chinaefulle认为：DMSO的使用比盐酸-异丙醇方便，至少盐酸-异丙醇溶液你还得配置，而DMSO拿来就可以用，而且使用浓盐酸时你得小心一点，要注意平安.而DMSO就没有这么麻烦.固然DMSO和盐酸-异丙醇都可以用来裂解细胞溶解被还原的MTT，如果手头上没有DMSO，用盐酸-异丙醇溶液也是可以的.至于盐酸-异丙醇如何配置可以查查书.问：MTT还能用于组织标本中的细胞增殖检测啊?该怎么弄呢?丁香网友chinaefulle认为：应当可以，只要组织是活的，因为MTT检测与琥珀酸脱氢酶活性有关，只要组织中有此酶，MTT反应同样会发生.固然组织需要匀浆.申明以下，以上是理论推测，我还没试过，如有人试过，无妨也来交流交流.MTT试验的一些细节问题(一)细胞1.选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于分歧细胞贴壁后面积不同很年夜，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及分歧接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满.这样，才华保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到不同.2.药物浓度的设定.一定要多看文献，参考他人的结果再定个比力年夜的范围先初筛.根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛.切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间.3. 时间点的设定.在分歧时间点的测定OD值，输入excel表，最后获得分歧时间点的抑制率变动情况，画出变动的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制暗示的最明显）.4.培养时间.200ul的培养液对10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的.5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数.做MTT时，尽量无菌把持，因为细菌也可以招致MTT比色OD值的升高.6.理论未必都是对的.要根据自己的实际情况调整.设置调零孔，对比孔，加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜.对比孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，分歧的是对比孔加溶解药物的介质，而加药组加入分歧浓度的药物.8.防止血清干扰.用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行.在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液.(二)实验步伐贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）.。
MTT法检测细胞活性
MTT法检测细胞活性之阳早格格创做【真验手段】相识体中筛选抗肿瘤药物（细胞毒）的要领，掌握酶标仪的使用要领及MTT真验的本理.【真验本理】MTT是3-（4，5-两甲基噻唑-2）-2，5-两苯基四氮唑溴盐的简称，它是一种能交受氢本子的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使中源性的MTT还本为易溶性的蓝紫色结晶物并重积正在细胞中，而牺牲细胞无此功能.两甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物.正在一定的细胞数范畴内，MTT结晶物的量取细胞数成正比，故用酶联免疫检测仪正在490/570nm波少下测定其吸光值，可间交反映活细胞的数量.体中培植的肿瘤细胞具备无限删殖的功能，正在培植历程中赋予一定浓度的海洋药物，用MTT法不妨精确那些药物是可不妨压造细胞删殖，并比较分歧药物压造效率的强强.【真验器材取药品】人胃癌细胞.细胞用1640培植基（加10%胎牛血浑，100 U/ml青霉素战100mg/ml链霉素）正在37℃、5％CO2鼓战火汽CO2培植箱中惯例培植，细胞传代以0.25％胰酶消化、酶标仪，96孔细胞培植板，加样枪、DMSO，MTT(5mg/ml)【真验要领取步调】1. 将胃癌细胞以5×103/ml稀度交种于96孔板（每孔加200ul），培植至指数死少久（24H），加进分歧浓度的丁酸钠(促进胃细胞死少)（200,120,80,40mM）.每组3个复孔.共时设空黑对于照组.（交种办法如图）2. 24或者48小时后，留神吸来上浑，加进90μl新陈培植液，再加进10ul MTT溶液，继承培植4 h弃上浑，每孔加进100ul两甲基亚砜，置摇床上矮速振荡10 min，使结晶物充分溶解.正在酶联免疫检测仪490 nm 处丈量各孔的吸光值.（CCK-8试剂中含有WST–8：化教名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-两磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它正在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸两甲酯（1-Methoxy PMS）的效率下被细胞线粒体中的脱氢酶还本为具备下度火溶性的黄色甲臜产品（Formazan）.死成的甲臜物的数量取活细胞的数量成正比.用酶联免疫检测仪正在450nm波少处测定其光吸支值，可间交反映活细胞数量.）3. 共时树立调整孔（培植基、MTT、两甲基亚砜），对于照孔（细胞、相共浓度的药物溶解介量、培植液、MTT、两甲基亚砜），每组设定复孔.细胞死少压造率=(对于照组的A值-真验组的A值)/对于照组的A值100 %.【真验截止】1．画造药物对于细胞压造直线2．比较分歧药物对于细胞死少压造情况3．比较共一药物效率分歧时间对于细胞删殖情况的效率【注意事项】1. 由于使用96孔板举止检测，如果细胞培植时间较少，一定要注意挥收的问题.一圆里，由于96孔板周围一圈最简单挥收，不妨采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，火或者培植液；另一圆里，不妨把96孔板置于靠拢培植箱内火源的场合，以慢解挥收.2. MTT溶液为黄色需躲光保存，万古间光照会引导做废.当颜色形成灰绿色时，请勿使用.3. 两甲亚砜溶解液结冻或者爆收重淀时不妨37℃火浴孵育以促进溶解，而且必须正在局部溶解并混匀后使用.【思索题】比较细胞计数取MTT法尝试截止的闭系.。
MTT法检测细胞存活及生长
MTT法检测细胞存活及生长【分享】MTT法检测细胞存活及生长什么是MTT?MTT全称为-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
什么是MTT法? 又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT检测法
MTT法检测细胞存活和生长之欧侯瑞魂创作MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所发生的甲瓒产品不溶于水，需被溶解后才干检测。
这不但使工作量增加，也会对实验结果的准确性发生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保管即可。
在配制和保管的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不克不及测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了包管实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保管两周内有效，或配制成5mg/ml保管在-20度长期保管，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没需要一下子配那么多,尤其当MTT变成灰绿色时就绝对不克不及再用了。
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（6）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片上，将爬片上
的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气泡，树胶封固后荧光显微镜 观察。
1 A
2
3
4
5
6
1组
B
2组 5
3组 6
4
C
7
D与观察】
• 在紫外光激发下，HeLa正常细胞发出柔和的蓝色荧光，凋亡细胞细 胞核发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞发红色荧光；
• 正常细胞核荧光均匀，而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周 围可见带蓝色荧光的凋亡小体。
实验八
1. MTT法检测细胞相对存活率（教材95页） 2. 细胞凋亡诱导分析检测技术（教材162页）
MTT法检测细胞相对存活率（教材95页）
【方法与步骤】
（1）传代5×104个/100ml 人子宫颈癌细胞HeLa于96孔板， 37°C培养过夜； （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（1、10、20 ml），每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照，
对照组
实验组
大蒜素 剂量 1ul
第1组
2
3
4
5ul 10ul 1ul
5
6
7
8
5ul 10ul
10ul
10ul 对照组
1ul
9
10
5ul
细胞凋亡诱导分析检测技术
Cell Death
•
细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质 颗粒增多，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋 白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质 呈均一的深伊红色，原有的微细结构消失。在含水量高的细胞，可因胞质内水泡不断 增大，并发生溶解，导致细胞结构完全消失，最后细胞膜和细胞器破裂，DNA降解， 细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。
基因组DNA
蛋白质合成 调节过程 炎症反应
有控降解，电泳图谱呈梯状
有 受基因调控 无，不释放细胞内容物
随机降解，电泳图谱呈涂抹状
无 被动进行 有，释放内容物。
图左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）
Ho.33342与PI荧光双染显示凋亡与坏死细胞 （教材168页）
【方法与步骤】
（1）传代5×104子宫颈癌细胞HeLa于含有盖玻片的24孔板， 37°C培养 过夜； （2）每孔加入5ml的大蒜素，以药物溶剂作对照， 37°C培养0.5~1h； （3）加入PBS，洗细胞5min X 3次； （4）取出细胞爬片，加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避 光放置30min； （5）加入PBS，洗细胞5min X 3次；
表15-2 细胞凋亡和细胞坏死的区别
区别点
起因 范围 细胞膜 染色质 细胞器 细胞体积 凋亡小体
细胞凋亡
生理或病理性 单个散在细胞 保持完整，一直到形成凋亡小体 凝聚在核膜下呈半月状 无明显变化 固缩变小 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬
细胞坏死
病理性变化或剧烈损伤 大片组织或成群细胞 破损 呈絮状 肿胀、内质网崩解 肿胀变大 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬
37°C培养0.5h；
（3）于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37°C培养1h； （4）吸弃培养液，各孔加入100ml DMSO，振荡培养板， 37°C培养10min； （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过与对照组比较得到实验组的存活率。
【结果与观察】
（1）加MTT后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫 蓝色颗粒溶解； （2）各组OD值取平均值后，以下式计算存活细胞百分数： 存活细胞%=（OD实验/OD对照）×100%