Promega__双萤光素酶报告基因

DLRTM For HTS
DLR™双报告基因检测系统应用举例
α－黑色素刺激激素(α-MSH)对由人酪氨酸酶启动子／增 强子控制的萤光素酶的表达的诱导(Promega eNotes)
• 目的：监测细胞对α-MSH诱导的应答 • 材料：
实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子／增强子＋Luc(+) 阳性对照：pGL3-Control 阴性对照：pGL3-Basic 内对照：pRL-SV40 B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323) DLR ™双萤光素酶检测试剂盒
荧光 - Fluorescence
Fire
萤光 - Luminescence
Worm
萤光 （Bioluminescence）
荧光 （Fluorescence）
是化学发光（Chemilumi- nescence） 吸收来自光源的光，再发射
的一种，激发能量来自化学反应
另一光子
萤光发光计（Luminometer）
实验质粒
萤火虫萤光素酶
对照质粒
海肾萤光素酶
用海肾萤光素酶作对照归一实验变化
归一反应 =
实验的 (萤火虫萤光素酶) 对照的（海肾萤光素酶)
数据处理举例
第一天 样品处理重复 对照
１ ２ ３
处理Ａ
１ ２ ３
处理B
1 2 3
第二天 对照
１ ２ •
处理Ｃ
１
２ ３
处理D
1来自百度文库
2 3
萤光素酶活性(RLU)
Ｆ
Ｒ
5,128 7,553 10,555 7,745
1) 全序列:
Promoter
luc+
Light
2) 逐步缺失:
Promoter
luc+
Light
Promoter
luc+
Firefly and Renilla
萤火虫生物萤光的化学
萤光素
萤光素酶
+ ATP + O2
Mg2+
Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Light
pRL-SV40 pRL-CMV
Renilla 萤光素酶载体系列
phRL-null phRL-TK
MCS 内含子
hRL 基因
HSV TK 启动子 T7 启动子
CMV即时早期增强子/启动子
phRL-CMV
phRL-SV40
SV40 早期 增强子/启动子
SV40 晚poly(A)
Renilla 萤光素酶载体系列
– 主动裂解
• 除去培养基..PBS洗..在1XPLB中刮下细胞..细胞转移到试 管或小瓶中..1-2次冻融..检测
• 检测
双萤光素酶检测方案
1 支试管 2 步检测 30 秒钟
Luciferase Assay Reagent II
Passive lysis buffer
Stop&Glo Reagent
2,511 3,815 5,413 3,913
5,1376 4,467 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,232
587,635 5,144 988,347 8,832 409,881 3,564 661,954 5,847
比率 （F:R)
1.98
11.52
113.21
15,529 20,433 21,897 30,841 10,760 13,620 16,062 21,631
0.76 0.71 0.79 0.74
850,239 20,843 578,951 14,830 943,873 21,788 791,021 19,154
41,30
14,865 19,3-05 8,967 12,284 13,767 20,246 12,533 17,278 0.73
荧光计（Fluorometer）
液闪仪（Scintilation Counter）
电荷耦合装置光学成像系统 （CCD opitical imaging system）
荧光显微镜
各种报告基因的优点和缺点
报告基因
优点
缺点
萤光素酶 ß-gal
•优越的灵敏度 –高信号值 –无内源活性
•灵敏度好
GUS（葡糖醛酸糖 •灵敏度好
phRL-TK(Int-)
TK 启动子
hRL 基因
phRG-B
三个读码框的 终止密码子
MCS
合成 poly(A) 信号 转录停止位点
SV40 晚 poly(A)
phRG-TK
三个读码框的
终止密码子
TK 启动子
合成 poly(A) 信号 转录停止位点
用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因
• Dual-Luciferase® 双萤光素酶报告基因系统（ 非均质检测）
• 线形范围广 （在10-16 M(10pg/L)至10-8 M(1mg/L)范围内,光 强度与萤光素酶浓度成正比）
• 一般比显微镜检测的荧光更灵敏 (对多孔板而言) • 生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发
射器 • 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力
萤光素酶报告基因的使用
• 原理:
Secondary reporter: Renilla bioluminescence
– Stable luminescence signals for both reporters (t1/2 ~ 3.5 hrs.)
– >10,000-fold signal separation between the firefly and Renilla bioluminescence
Firefly
Renilla
为什么要使用双报告基因
报告基因 A (首要信号)
报告基因 B (第二信号)
特异生物学反馈 + 非特异生物学反馈
非特异生物学反馈 检测结果
比较首要与第二信号确定 特异生物学反馈
传统的双报告基因的缺点
• 细胞可能有内源脱乙酰基酶 -Gal 或 GUS 活性. • CAT, -Gal 和 GUS 检测是终点检测. • 不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-
Dual-Glo assay-选择性淬灭萤火虫萤光
Selective quench of firefly luminescence
Dual-Glo™萤光素酶检测系统
试剂盒组成
• Dual-Glo™萤光素酶缓冲液 • Dual-Glo™萤光素酶底物（冻干粉） • Dual-Glo™Stop-Glo®缓冲液 • Dual-Glo™Stop-Glo®底物
归一的活性 变化倍数
1.00 5.82 57.18
1.00 55,81 0.99
Δ活性倍数
(F/R)样品
= F/R)对照
第二天处理Ｃ计算如下：
Δ
活性倍数
=
(791,021/19,154) （16,062/21,631)
= 55.81
GloMax ™ 20/20 Single tube luminometer
萤光素酶: 辅-底物:
萤光素:
单体, 61,000 Daltons ATP . Mg 2+
海肾萤光素酶反应
Coelenterazine +
O2
萤光素酶:
萤光素酶
Coelenteramide + CO2 + Light
单体, 36,000 Daltons
萤光素: (Coelenterazine)
Enzyme structures
GloMax ™ 96 luminometer
White microplates for luminescence
Promega公司出品的双报告基因实验产品
• 质粒
– 萤火虫萤光素酶质粒 – 海肾萤光素酶质粒 – 叩头虫萤光素酶质粒
• 检测系统
– 非均质双报告基因检测系统（通量较低） – 均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化）
– 制备含有 luc/ Rluc 的DNA
调节序列
Luc２
– 转染
– 提供刺激
– 测量萤光
在活细胞中做报告基因检测
外界刺激(导引物)
受体
蛋白-蛋白 相互作用
信号转导 转录因子
病毒感染 和增殖
调节序列
萤光素酶基因 RNAi 抑制
蛋白质折叠
加工 翻译
转录
RNA 酶 反义 RNA
启动子/增强子分析
“碰撞启动子”:
Dual-Luciferase®报告基因检测系统组分
• 检测缓冲液II • 底物（冻干粉） • Stop&Glo®缓冲液 • Stop&Glo®底物,50X • 被动裂解液,5X
Dual-Luciferase®报告基因检测步骤
• 裂解细胞
– 被动裂解
• 除去培养基..PBS洗..加1XPLB, 振荡15分钟..检测
– E1910，100次 – E1960，E1980，1000次
• Dual-GloTM 萤光素酶检测系统 （均质检测）
– E2920，10ml – E2940，100ml – EE2980，10X100ml
均质检测与非均质检测
均质检测
细胞+培养基
添加试剂
发光
非均质检测
发光 细胞+培养基 除去培养基 清洗细胞 裂解细胞 添加试剂
•放射性的 •灵敏度底 •50ｈ半衰期
•背景可能高 •折叠 “情形” 可导致信号差别
萤光素酶报告基因的主要优点
• 非放射性 • 检测快（比CAT等） • 灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍） • 半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶
分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰 期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）
载体 - 萤火虫萤光素酶载体
•pGL3 家族
pGL3-Basic pGL3-Control pGL3-Enhancer pGL3-Promoter
pGL3-Basic Map
pGL3-Control Map
pGL3-Enhancer Map
pGL3-Promoter Map
内对照载体可能存在的问题
苷酶）
•植物中内源活性低
SEAP（分泌性碱 •分泌性报告基因 (不需裂
性磷酸酶）
解)
CAT（氯霉素转乙 酰基酶）
GFP（绿色荧光蛋 白）
-真核细胞没有背景表达 -易于使用 -设备现成(液闪仪,层析)
•显微镜: 亚细胞定位 •不需底物
•需要底物
•细菌，血清等内源活性高 •需要底物 • 90% 的 E.coli, 人／动物细胞中 有内源活性 •酶的扩散可引起 “过度报告” •需要底物 •在 HeLa , 癌 和其它细胞类型 中有高的内源活性 •需要底物
• 辅助报告基因的相对萤光单位 (RLU) • 启动子交叉交谈或互相干扰 • 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节
载体 - 海肾萤光素酶报告基因载体
第二代
phRL-null phRL-TK phRL-TK (int-) phRL-SV40 phRL-CMV phRG-B phRG-TK
第一代
pRL-null pRL-TK
操作步骤
• 试剂制备简单
– 将Dual-Glo™ 萤光素酶缓冲液倒入 Dual-Glo™ 萤 光素酶底物中
– 用Dual-Glo™ Stop &Glo® 缓冲液按1:100 稀释 Dual-Glo™ Stop &Glo® 底物
– 所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于 –20°C
• 两步加入试剂: 加, 读, 加, 读
• 步骤
前一天：接种细胞，六孔板X3 第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40 （分成两组）
pGL3-Control 和 pRL-SV40 pGL3-Basic 和 pRL-SV40
裂解细胞，测量萤光
Dual-Glo™萤光素酶检测系统
检测特点 •均质检测，为高通量检测而设计 •萤光信号稳定，2hrs内检测 •自发萤光低于检测水平
Dual-Glo Assay: 同一样品中检测两种萤光信号
Cells in culture medium
Add firefly assay reagent
Primary reporter: Firefly bioluminescence
Add combination firefly quench reagent & Renilla assay reagent
Report Smartly －萤光素酶报告基因技术
自然界的萤光
发光真菌
发光节虫
发光海星
发光甲壳虫
自然界的萤光
发 光 鱼
发 光 甲 虫
自然界的萤光
萤 火 虫
报告基因的作用
• 细胞信号转导途径 • 启动子/增强子 • 受体结合 • 病毒/细胞相互作用 • 转录因子 • 药物诱导作用或”效果”
Luminescence vs. Fluorescence
Gal ,的两个报告基因的检测都灵敏而快速．
双萤光素酶报告基因系统比用CAT和ß-Gal做内对照 的优点
• 速度
– 样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内 完成
• 灵敏
– 两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内 源萤光素酶背景极低
• 方便
– 一管完成检测，样品不必分份
用两个萤光素酶做报告基因 （萤火虫+海肾）