实验十八 血清胆红素测定(改良J-G法).pptx
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实验十六 血清胆红素测定 （改良 J-G 法）
【目的】 1. 熟悉血清胆红素测定的原理和方法； ２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。 【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加 速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆 红素。醋酸钠缓冲液保持反应的 pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂， 最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳 定的蓝色偶氮胆红素，在 600nm 波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于 800ml 去离子水中，加入浓盐酸 15ml ， 用去离子水补足至 1L。
5．重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液 0.5ml 和对氨基苯磺酸溶液 20ml，混匀即成。 6．5.g/L 叠氮钠溶液
7．胆红素标准液
0.8
0.4
-
相当于胆红素浓度（μ
0
34.2 68.4
103
137
171
mol/L）
混匀（不可产生气泡），按总胆红素测定法操作。每一浓度做 3 个平行管，用对照管 调零，读取各管吸光度，以各浓度吸光度均值为纵坐标，以相应的胆红素浓度为横坐标 ， 绘制标准曲线。
【正常参考范围】 血清总胆红素 5.1～17.1μmol/L 血清结合胆红素（1 分钟） 0～6μmol/L 【临床意义】 血清总胆红素测定可判断有无黄疸及反映黄疸的程度。总胆红素在 17.1～34.2μ mol/L 时为隐性黄疸；超过 34.2μmol/L 时，肉眼可见、皮肤、粘膜、巩膜黄染，称显性
2. 碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠 75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至 1L，混匀。置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L 亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠 0.5g，用去离子水溶解并定容至 100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存， 稳定期不少于 2 周。若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
黄疸。 血清总胆红素和结合胆红素同时测定，其百分比可用于鉴别黄疸类型。溶血性黄疸时
， 血清总胆红素升高，以为结合胆红素升高为主，结合胆红素占总胆红素的 20%以下；肝 细 胞黄疸时，结合胆红素占总胆红素的 35%以上；阻塞性黄疸时，结合胆红素升高更明显 ， 占总胆红素的 50%以上。
再生障碍性贫血及数种继发性贫血（主要由癌或慢性肾炎引起），血清总胆红素减少。 【结果及分析】 【思考题】 1. 简述血清胆红素测定的原理。 2. 血清胆红素测定中破坏氢键的组分是什么？ 3. 肝细胞性黄疸时，血清中何种胆红素升高？
-
1.2
混匀，600nm 波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。从标准曲线上查出相应的 胆红素浓度。
【标准曲线制作】
2
取试管 6 支，编号，按下表操作：
表 3-21 胆红素标准曲线的绘制
加人物(m1)
对照管
1
2
3
4
5
胆红素标准贮存液
－
0.4 0.8
1.2
1.6
2.0
稀释用血清
2.0
1.6 1.2
1
1 目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常 用人混合血清，对此血清的要求如下：
收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。取过滤后 的血清 1ml，加入新鲜 0.154mmol/L NaCl 溶液 24ml，混合。在 414nm 波长，1cm 光径，以 0.154mmol/L NaCl 溶液调零点，其吸光度应小于 0.100；在 460nm 的吸光度应小于 0.04。
【操作】
取试管 3 支，按下表操作：
表 3-20 改良 J-G 法测定血清胆红素
加人物(m1)
总胆红素管
结合胆红素管
血清
0.2
0.2
咖啡因苯甲酸钠试剂
1.6
-
对氨基苯磺酸
-
-
重氮试剂
0.4
0.4
混匀，准确 1 分钟
叠氮钠
-
0.05
咖啡因苯甲酸钠试剂
-
1.55
室温 10 分钟
碱性酒石酸钠
1.2
1.2
空白管 0.2 1.6 0.4 -
3
【器材】 试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。 【试剂】 1. 咖啡因试剂 称取无水水醋酸钠 41.0g，苯甲酸钠 38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶 于约 500ml 去离子水中，再加入咖啡因 25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解） ， 用去离子水补足至 1L，混匀。过滤后置棕色瓶，室温保存。
2 配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在 25℃条件下， 光径 1.000±0.001cm，波长 453nm，摩尔吸光系数应在 60700±1600 范围内；改良J-G 法 偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在 74380±866。
来自百度文库
3 胆红素标准贮存液（171μmol/L）： 准确称取符合要求的胆红素 10mg，加入二甲亚砜 1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。 加入 0.05mol/L 碳酸钠溶液 2ml，使胆红素完全溶解后，移入 100ml 容量瓶中，以稀释用 血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入 0.1mol/L 盐酸 2ml，边加边摇（勿用力摇动，以免 产生气泡）。最后以稀释血请加至刻度。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹， 置 4℃冰箱 3 天内有效，但要求配后尽快作校正曲线。
【目的】 1. 熟悉血清胆红素测定的原理和方法； ２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。 【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加 速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆 红素。醋酸钠缓冲液保持反应的 pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂， 最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳 定的蓝色偶氮胆红素，在 600nm 波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于 800ml 去离子水中，加入浓盐酸 15ml ， 用去离子水补足至 1L。
5．重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液 0.5ml 和对氨基苯磺酸溶液 20ml，混匀即成。 6．5.g/L 叠氮钠溶液
7．胆红素标准液
0.8
0.4
-
相当于胆红素浓度（μ
0
34.2 68.4
103
137
171
mol/L）
混匀（不可产生气泡），按总胆红素测定法操作。每一浓度做 3 个平行管，用对照管 调零，读取各管吸光度，以各浓度吸光度均值为纵坐标，以相应的胆红素浓度为横坐标 ， 绘制标准曲线。
【正常参考范围】 血清总胆红素 5.1～17.1μmol/L 血清结合胆红素（1 分钟） 0～6μmol/L 【临床意义】 血清总胆红素测定可判断有无黄疸及反映黄疸的程度。总胆红素在 17.1～34.2μ mol/L 时为隐性黄疸；超过 34.2μmol/L 时，肉眼可见、皮肤、粘膜、巩膜黄染，称显性
2. 碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠 75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至 1L，混匀。置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L 亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠 0.5g，用去离子水溶解并定容至 100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存， 稳定期不少于 2 周。若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
黄疸。 血清总胆红素和结合胆红素同时测定，其百分比可用于鉴别黄疸类型。溶血性黄疸时
， 血清总胆红素升高，以为结合胆红素升高为主，结合胆红素占总胆红素的 20%以下；肝 细 胞黄疸时，结合胆红素占总胆红素的 35%以上；阻塞性黄疸时，结合胆红素升高更明显 ， 占总胆红素的 50%以上。
再生障碍性贫血及数种继发性贫血（主要由癌或慢性肾炎引起），血清总胆红素减少。 【结果及分析】 【思考题】 1. 简述血清胆红素测定的原理。 2. 血清胆红素测定中破坏氢键的组分是什么？ 3. 肝细胞性黄疸时，血清中何种胆红素升高？
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1.2
混匀，600nm 波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。从标准曲线上查出相应的 胆红素浓度。
【标准曲线制作】
2
取试管 6 支，编号，按下表操作：
表 3-21 胆红素标准曲线的绘制
加人物(m1)
对照管
1
2
3
4
5
胆红素标准贮存液
－
0.4 0.8
1.2
1.6
2.0
稀释用血清
2.0
1.6 1.2
1
1 目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常 用人混合血清，对此血清的要求如下：
收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。取过滤后 的血清 1ml，加入新鲜 0.154mmol/L NaCl 溶液 24ml，混合。在 414nm 波长，1cm 光径，以 0.154mmol/L NaCl 溶液调零点，其吸光度应小于 0.100；在 460nm 的吸光度应小于 0.04。
【操作】
取试管 3 支，按下表操作：
表 3-20 改良 J-G 法测定血清胆红素
加人物(m1)
总胆红素管
结合胆红素管
血清
0.2
0.2
咖啡因苯甲酸钠试剂
1.6
-
对氨基苯磺酸
-
-
重氮试剂
0.4
0.4
混匀，准确 1 分钟
叠氮钠
-
0.05
咖啡因苯甲酸钠试剂
-
1.55
室温 10 分钟
碱性酒石酸钠
1.2
1.2
空白管 0.2 1.6 0.4 -
3
【器材】 试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。 【试剂】 1. 咖啡因试剂 称取无水水醋酸钠 41.0g，苯甲酸钠 38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶 于约 500ml 去离子水中，再加入咖啡因 25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解） ， 用去离子水补足至 1L，混匀。过滤后置棕色瓶，室温保存。
2 配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在 25℃条件下， 光径 1.000±0.001cm，波长 453nm，摩尔吸光系数应在 60700±1600 范围内；改良J-G 法 偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在 74380±866。
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3 胆红素标准贮存液（171μmol/L）： 准确称取符合要求的胆红素 10mg，加入二甲亚砜 1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。 加入 0.05mol/L 碳酸钠溶液 2ml，使胆红素完全溶解后，移入 100ml 容量瓶中，以稀释用 血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入 0.1mol/L 盐酸 2ml，边加边摇（勿用力摇动，以免 产生气泡）。最后以稀释血请加至刻度。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹， 置 4℃冰箱 3 天内有效，但要求配后尽快作校正曲线。