第四章 酶的分子修饰与模拟
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酶工程电子教案第四章酶分子修饰教学目标：◆通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
◆通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些改变，就有可能提高酶的活力，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等。
◆通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。
◆酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰, 大分子结合修饰，侧链基团修饰，肽链有限水解修饰，核苷酸链有限水解修饰，氨基酸置换修饰，核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰等。
教学重点和难点大分子结合修饰的原理和方法；酶分子的定向进化。
教学方法教师讲授为主，结合一次上机实验，加深学生对酶分子结构与功能关系的认识，以及对酶分子修饰方法的掌握。
核酶的内容自学。
1、金属离子置换修饰◆把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
◆有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。
α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)等。
◆若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。
◆若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。
1.1金属离子置换修饰的方法：◆金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。
◆金属离子置换修饰的过程主要包括如下步骤：(1)酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
(2)除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。
(3) 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。
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酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
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最新蛋白质与酶工程 第四章 酶分子修饰教学讲义PPT课件
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶 活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收 高。 ◦ （1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于 它们的解离状态不同，反应性能也不同。 ◦ （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一 性的修饰反应。 ◦ （3）反应体系中酶与修饰剂的比例
使酶蛋白侧链上的巯基发生改变，从而改变酶的空间构 象、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。
常用的巯基修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫 酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。
常见基团的化学修饰反应：巯基
酚基修饰
蛋白质分子的酪氨酸残基上含有酚基。使酚基发生改变， 从而改变酶蛋白的空间构象的修饰方法称为酚基修饰。
酚基修饰的方法主要有碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。 例如，枯草杆菌蛋白酶的第104位酪氨酸残基上的酚基 经四硝基甲烷（ TNM ）硝化修饰后，生成硝基酚残基， 由于负电荷的引入，使酶对带正电荷的底物的结合力显 著增加；葡萄糖异构酶经过琥珀酰化修饰后，其最适 pH 值下降 0.5单位，并增加酶的稳定性。
α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子 (Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子 中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子 (Cu2+,Zn2+)
若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活 性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或 者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出 不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以 使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。
第四章：酶分子修饰
（6）分子结合修饰
定义 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 分子结合修饰：采用水溶性分子，与酶蛋白的侧 链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变， 从而改变酶的特性与功能的方法。 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 大分子结合修饰：对酶蛋白侧链基团的修饰反应 不仅可以使用小分子物质，也可使用大分子物质。 其中利用水溶性大分子与酶分子的侧链基团共价 结合，使酶分子的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合 修饰法。
(1)肽链的水解引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其 肽链的水解引起酶活性中心的破坏， 催化功能。 催化功能。 (2)肽链的一部分被水解后，仍然可以维持酶活性中 肽链的一部分被水解后， 心的空间构象， 心的空间构象，则酶的催化功能仍可以保持不变或 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。 损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。这将 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 提高某些酶特别是药用酶的使用价值。 (3)肽链的一部分水解除去以后，有利于酶活性中心 肽链的一部分水解除去以后， 与底物的结合并且形成准确的催化部位， 与底物的结合并且形成准确的催化部位，则酶可显 示出其催化功能或使酶活性提高。 示出其催化功能或使酶活性提高。
+
O2N OOC S S NO2 COO
ENZ
SH
pH﹥ 6.8
DTNB
NO2 COO
ENZ
S S
+
S
NO2
+
COO
H+
（5）分子内交联修饰
定义：利用含有双功能基团的化合物， 与酶分子中两个侧链基团反应，形成共 价交联，可使酶分子的空间构象更为稳 定，提高酶的稳定性。 修饰剂：二氨基丁烷，戊二醛，己二胺 用途：在蛋白和酶的结构与功能的基础 研究，酶的催化机制等酶学研究方面有 重要作用。
Chapter 4 酶分子修饰与应用
第四章酶分子修饰与应用1 酶分子修饰(Modification of Enzyme Molecule)：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
2 酶分子修饰的意义？（1）提高酶的活力；（2）增强酶的稳定性；（3）降低或消除酶的抗原性；（4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系。
第一节酶分子的主链修饰1 酶分子的主链修饰：利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
2 酶分子主链修饰的意义？（1）可提高酶的活力；（2）可降低或消除酶的抗原性；（3）可预测酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献。
（一）主链的切断修饰①主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
②主链断裂后，酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
这样可以提高药用酶的使用价值。
③主链断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。
（二）主链的连接修饰将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。
在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。
通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。
第二节酶的侧链基团修饰采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
酶的侧链基团的意义：（1）可以研究各种基团在酶分子中的作用，并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团。
如果某基团修饰后不引起酶活力的显著变化，则可以认为此基团属于非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。
第四章 酶的分子修饰与模拟
3 酶的蛋白质工程技术修饰
4
酶的人工模拟
4.2 酶的物理修饰与诱导构象重建
一、物理性修饰 ❖ 定义：通过各种物理方法（高温、高压、高盐、极
端pH值等），使酶分子的空间构象发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的方法。
❖ 特点：不改变酶的组分和基团，酶分子中共价键不
发生改变，副键发生某些变化和重排。
T4溶菌酶的3-Ile替换成3-Cys，再经氧化，与97Cys形成二硫键后，其热稳定性大大提高；
-内酰胺酶的70-Ser换成70-Cys后，对胰蛋白酶水 解的抵抗力可升高3倍。
本章内容提要
1
酶的化学修饰
2 酶的物理修饰与诱导构象重建
3 酶的蛋白质工程技术修饰
4Hale Waihona Puke 酶的人工模拟4.4 酶的人工模拟
半衰期 6 min 7h 14 h 24 h 35 h
相对稳定性 1 70
140 240 350
c）降低或消除抗原性
❖ 机制：抗体与抗原间的特异结合是由于它们间的特定
分子结构所引起的，酶经水溶性大分子修饰可使酶的结 构产生某些改变，从而降低甚至消除其抗原性。
❖ 实例：
▪ 精氨酸酶经PEG修饰后，抗原性显著降低 ▪ 用PEG对色氨酸酶进行修饰，可完全消除其抗原性 ▪ PEG修饰后的L-天门冬酰胺酶，也可完全消除其抗原性
❖ 方法原理：酶的变性和诱导复性
4.2 酶的物理修饰与诱导构象重建
二、诱导构象重建
❖诱导复性：特定条件下复性（非天然条件或有底物类似物、 抑制剂等存在），酶将折叠成所需的特殊结构，产生新的 性状。例如：
▪ RNase复性时加入丙酸（竞争性抑制剂），修饰后酶具有酸性磷酸 酯酶活性；
酶工程 第六节 酶分子修饰与模拟
3、酶化学修饰的应用
酶经过化学修饰后会产生的变化： 1.提高生物活性； 2.增强在不良环境中的稳定性； 3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫 原性； 4.产生新的催化能力；
在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长 它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性 和抗原性。 在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱 和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适ph等酶学 性质。 在酶结构功能研究中： 1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究； 2.确定氨基酸残基的功能； 3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。
1、化学修饰原理
凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白 共价结构发生改变（侧链基团的取代、肽链的 限制性水解、分子内或分子间的交联），都可 称为蛋白质的化学修饰。达到： 改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、 对效应物响应性能及对辅助因子的要求） 提高酶的稳定性 扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性 水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）
2.酶分子内部修饰
(1).非催化活性基团的修饰 (2).蛋白主链的修饰 (3).催化活性基团的修饰 (4).与辅因子相关的修饰
3.结合定点突变的化学修饰
通过一些可控制的方法在酶的关键活性位 点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法 将突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分 子化合物，得到一种称为化学修饰突变酶 （CMM)的新型酶。
用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶 血栓性提高了100倍 用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性 的α －NHCH2COOH后，该酶对60°C热处理的稳定性增高了 1000倍。 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、L－ 谷氨酰胺酶、L－门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG修饰后，完全 消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环 中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。
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金属离子置换修饰的过程
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经分离纯化， 除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定量金 属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中 的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、 分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除 去。此时酶往往成为无活性状态。
• 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、 金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象 的影响 structure
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第一节 酶分子的修饰方法
酶分子的修饰： 酶的表面修饰 酶的内部修饰.
1.1 酶的表面修饰 化学固定化 一般是通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶 共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改 变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改 变．
一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等 能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。有些来自嗜热菌 的酶具有较高稳定性，其原因正是由于保护性大分子(如 肽和聚胺)发挥作用的结果。
另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，降低了介电常数，因而 增加了相互作用力，其稳定性也就增加。因此酶的多聚体 或酶聚合体的活力和稳定性比单体高
马肝醇脱氢酶(HLADH)的Lys乙基化、糖基化和甲 基化都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加最 大，同时酶的稳定性也提高了。
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酶的大分子修饰
分为大分子非共价修饰和大分子共价修饰两类
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相 互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、 右旋糖苷等．它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能 通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。
酶分子修饰PPT课件
进行修饰实验
根据修饰方案进行实验 操作，实现酶分子的修
饰。
性能评估
对修饰后的酶进行性能 评估，包括稳定性、选 择性、催化效率等方面
的评估。
03
酶分子修饰的应用
酶分子修饰在医药领域的应用
药物设计和改造
疾病诊断和治疗
通过酶分子修饰技术，对药物分子进 行化学结构的改造和优化，提高药物 的疗效、稳定性和选择性。
为了克服现有酶分子修饰技术的局限性，需要不断探索新的修饰方法和策略，提高修饰效 果和特异性。
深入研究酶分子结构和功能关系
深入了解酶分子结构和功能关系，有助于更好地选择修饰位点和设计修饰方案，以实现酶 性能的优化。
开发酶分子修饰的应用实例
加强酶分子修饰在解决实际问题中的应用研究，例如在生物医药、环保、能源等领域的应 用实例开发。
分子，用于解决一些重要的生物学和工业问题。
提高酶的稳定性和催化效率
02
通过酶分子修饰，可以改善酶的稳定性和催化效率，使其在极
端条件下的应用更加广泛。
扩展酶的应用领域
03
随着酶分子修饰技术的发展，酶的应用领域也在不断扩展，例
如在生物医药、环保、能源等领域的应用。
酶分子修饰的未来研究方向
探索新的修饰方法和策略
酶分子修饰的类型
化学修饰
利用化学试剂对酶分子进行修饰 ，改变酶的活性、稳定性等性质 。常见的化学修饰方法包括磷酸 化、糖基化、甲基化等。
生物修饰
利用生物酶对酶分子进行修饰， 改变酶的性质。常见的生物修饰 方法包括蛋白质工程、基因敲除 和突变等。
酶分子修饰的重要性
提高酶的稳定性
通过酶分子修饰可以增加酶的稳 定性，使其在极端环境条件下仍 能保持活性，拓宽了酶的应用范
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3、修饰
将带有活化基团的大分子修饰剂与经 过分离纯化的酶液，以一定的比例混合， 在一定的温度、pH值等条件下反应一段时 间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧 链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。
4、分离
需要通过凝胶层析等方法进行分离，
将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获
得具有较好修饰效果的修饰酶。
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二、大分子结合修饰
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使 酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与 功能的方法称为大分子结合修饰。
目前应用最为广泛的酶分子修饰方法。
（一）、大分子结合修饰的方法
1、修饰剂的选择 一般为水溶性大分子。如，聚乙二醇（PEG）、
右旋糖苷、蔗糖聚合物（ficoll）、葡聚糖、环状 糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。
2019衍生物：
MPEG 的 羟 基 与 琥 珀 酰 亚 胺 反 应 ， 生 成 SS-MPEG 、 SSA － MPEG 、 SC-MPEG 等 衍 生 物 。 这些衍生物可以在pH7~10的条件下对酶分子 的氨基进行修饰。
MPEG琥珀酸亚胺碳酸酯
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3、增强酶的稳定性
例如：Fe－SOD分子中的铁离子被锰离子置换， 成为Mn－SOD后，其对过氧化氢的稳定性显著增强。 对叠氮钠（NaN3）的敏感性显著降低。
4、改变酶的动力学特性
例如：用钴离子置换酰基化氨基酸水解酶的活 性中心的锌离子，其催化N－氯－乙酰丙氨酸水解的 最适pH值从8.5降低为7.0。同时该酶对N－氯－乙酰 丙氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。
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汇报人：
单击输入目录标题 酶的分子修饰概述 酶的磷酸化修饰 酶的乙酰化修饰 酶的糖基化修饰 酶的甲基化修饰
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酶的分子修饰概述
酶的分子修饰的定义
酶的分子修饰是指酶在生物体内通过化学修饰改变其结构和功能
常见的酶分子修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等
酶分子修饰可以调节酶的活性、稳定性和定位 酶分子修饰在生物体内具有重要的生理功能，如信号传导、细胞周期调 控等
酶的分子修饰的类型
磷酸化修饰：通过磷酸化酶催化，使酶分子上增加或去除磷酸基团 乙酰化修饰：通过乙酰化酶催化，使酶分子上增加或去除乙酰基团 甲基化修饰：通过甲基化酶催化，使酶分子上增加或去除甲基基团 泛素化修饰：通过泛素化酶催化，使酶分子上增加泛素分子
酶的分子修饰的意义
调节酶的活性：通过修饰改变酶的活性，以适应生理和病理条件下的变 化 参与信号传导：酶的修饰可以参与信号传导，影响细胞功能
影响代谢途径：酶的修饰可以影响代谢途径，影响细胞代谢和功能
参与疾病发生：酶的修饰异常可能导致疾病发生，如癌症、糖尿病等
酶的磷酸化修饰
磷酸化修饰的种类
磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰 磷酸化修饰的种类：磷酸化修饰可以分为磷酸化、去磷酸化和磷酸化修饰
磷酸化修饰的酶
磷酸化酶：催化磷酸化反应的酶 磷酸酶：催化去磷酸化反应的酶 磷酸化修饰的酶：在酶分子上引入或去除磷酸基团的酶 磷酸化修饰的作用：调节酶的活性、定位和稳定性
磷酸化修饰的作用
调节酶的活性：磷 酸化修饰可以改变 酶的活性，从而影 响生物体的代谢过 程
第四章酶的归纳总结
“第四章酶”归纳总结第一节酶的分子结构和催化功能酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（反应物）具有高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂中的一种类型。
生物催化剂酶＼核酶：具有催化作用的核糖核酸，主要以核酸为底物。
根据酶的组成特点辅酶、辅基——B族维生素的活性形式二、酶的活性中心必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链具有不同的化学基团，其中一些与酶活性密切相关的化学基团。
酶的活性中心：一些必需基团在酶蛋白的一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异的结合并将底物转为产物。
必需基团活性中心外的必需基团活性中心内的必需基团 结合基团：能与底物或辅酶结合形成酶复合物催化基因：参与催化化学反应完成的化学基因三、酶催化作用机制酶促反应的机制酶促反应的化学机制第二节 酶促反应的特性诱导契合学说：酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应， 进而相互结合而有利于反应的进行。
中间复合物学说：目前一般认为，酶催化某一反应时，首先在酶的活性中心 与底物结合生成酶－底物复合物，此复合物再进行分解而释放出酶，同时生成一种或数种产物。
邻近\定向效应 多元催化 表面效应：酶促反应在酶的疏水活性中心进行，防止水化膜的形成酶促反应的特性1、具有化学催化剂的特点4、特异性5、调节性2、酶促反应的条件温和：一般最佳反应条件；常温、37°C、pH近中性3、高效性——显著降低活化能C、对于可逆反应，只加快进程而不改变化学平衡常数B、只催化热力学允许的化学反应A、参与反应而无质量变化a、绝对特异性：酶只能作用于特定结构的底物分子，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物c、立体异构特异性：当底物具有立体异构体时，仅用于底物的一种立体异构体b、相对特异性：酶作用于一类化合物或一种化学键d、酶含量的调节e、同工酶：c、共价修饰调节b、酶的别构调节：对酶催化活性a、酶原与酶原激活：生理意义机体的自我保护酶原被视为酶的贮存方式一种调节方式，即当一种同工酶受抑制或破坏时，其他同工酶仍起作用。
酶分子化学修饰(1)
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（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰） 1 概念 •定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链 上特定的功能基团发生化学反应。 •侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有： 氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 •侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链 易被修饰，它们一般具有亲核性。
（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶
分子共价结合。
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3. 应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）
PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran 右旋糖酐 修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰 蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。
为修饰剂）。
（与前面化学蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中 的一种：
1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化 部位，酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行， 称肽链有限水解。
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但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子 内部的必需基团，不易被修饰。
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（三）交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同
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a）提高酶活力
❖ 机制：修饰剂通过共价键与酶分子结合后，可使酶的 空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和 底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得 以提高。
❖ 实例：
▪ 右旋糖酐:核糖核酸酶＝6.5 : 1，活力提高至原酶的2.25倍; ▪ 右旋糖酐:胰凝乳蛋白酶＝11:1，活力提高至原酶的5.1倍; ▪ 右旋糖酐:胰凝乳蛋白酶＝11min 7h 14 h 24 h 35 h
相对稳定性 1 70
140 240 350
c）降低或消除抗原性
❖ 机制：抗体与抗原间的特异结合是由于它们间的特定
分子结构所引起的，酶经水溶性大分子修饰可使酶的结 构产生某些改变，从而降低甚至消除其抗原性。
❖ 实例：
▪ 精氨酸酶经PEG修饰后，抗原性显著降低 ▪ 用PEG对色氨酸酶进行修饰，可完全消除其抗原性 ▪ PEG修饰后的L-天门冬酰胺酶，也可完全消除其抗原性
❖ 作用：使羧基酯化、酰基化或结合生 成其他物质。
氨基的化学修饰反应
❖ 主要修饰剂：二硝基氟苯、醋酸酐、二硫化碳、 O-甲基异脲等。
❖ 作用：产生脱氨基或共价结合将其屏蔽。
巯基的化学修饰反应
❖ 主要修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇等还原剂及酰 化、烷化剂。
❖ 作用：与巯基反应，破坏二硫键。
咪唑基的化学修饰反应
▪ 酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应实际生 产工艺要求。
本章内容提要
1 酶的化学修饰 2 酶的物理修饰与诱导构象重建 3 酶的蛋白质工程技术修饰 4 酶的人工模拟
4.1 酶的化学修饰
❖ 化学修饰是在酶分子一级结构水平上的改造 ❖ 化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适
的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在 较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良 特性，甚至创造出新的活性。 ❖ 化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各 种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶 分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团） 产生化学反应，对酶分子结构进行改造。
4.1 酶的化学修饰
❖ 金属离子置换修饰 ❖ 大分子结合修饰 ❖ 酶蛋白侧连基团修饰 ❖ 肽链有限水解修饰 ❖ 氨基酸置换修饰
大分子结合修饰
❖定义：利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，
使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶 的特性与功能的方法。
❖常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖
❖ 主要修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯等。 ❖ 作用：使咪唑基发生烷基化、卤代反应。
酚羟基的化学修饰反应
❖ 主要修饰剂：四硝基甲烷等。 ❖ 作用：使酚基碘化、硝化或琥珀酰化。
胍基的化学修饰反应
❖ 主要修饰剂：二羰基化合物：环己二酮、乙二醛、苯 乙二醛等。
❖ 作用：与胍基缩合生成稳定的杂环。
色氨酸吲哚基的化学修饰反应
Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。
❖一般操作方法：
酶液加入EDTA透析或超滤加入不同的金属离子
金属离子置换修饰
❖置换后结果
▪ 酶活性降低或完全失活 ▪ 酶活性提高或稳定性增加
• 锌型蛋白酶置换成钙型蛋白酶，活力提高20~30%； 制成结晶，活力提高2~ 3倍；
• -淀粉酶由杂离子型置换为钙离子型，结晶后活 力提高3倍以上，并且稳定性大大增加。
大分子结合修饰
❖ 大分子结合修饰的作用：
a) 提高酶活力 b) 增加酶的稳定性 c) 降低或消除抗原性
4.1 酶的化学修饰
❖ 金属离子置换修饰 ❖ 大分子结合修饰 ❖ 酶蛋白侧连基团修饰 ❖ 肽链有限水解修饰 ❖ 氨基酸置换修饰
酶蛋白侧连基团修饰
❖ 定义：用小分子化合物对酶蛋白侧链基团进行修饰。可引
起副键的改变，使酶分子空间结构发生某些改变，从而引 起酶的特性和功能的改变。
❖ 被修饰的侧链基团：主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、
酚基等
❖ 经常被修饰的残基是：
▪ 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His ▪ 亲电的Tyr、Trp
羧基的化学修饰反应
❖ 主要修饰剂：乙醇-盐酸、碳化二亚 胺等。
b）增加酶的稳定性
❖ 机制：酶可与大分子修饰剂形成复合物，起保护酶的天然构
象的作用，从而增加其稳定性。
▪ 酶活力减少到原来的一半所经过的时间称为酶的半衰期。 ▪ 酶的半衰期长，说明其稳定性好。反之，稳定性差其半衰
期就短。
❖ 实例：
酶 天然SOD 右旋糖酐-SOD Ficoll(低分子量)–SOD Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD
4.1 酶的化学修饰
❖ 金属离子置换修饰 ❖ 大分子结合修饰 ❖ 酶蛋白侧连基团修饰 ❖ 肽链有限水解修饰 ❖ 氨基酸置换修饰
金属离子置换修饰
❖定义：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特
性和功能发生改变的方法。
❖应用范围：只适用于分子结构中本来含金属离子的酶 ❖常用金属离子：二价金属离子，如：Ca2+，Mg2+，
修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与酶液混合，控 制一定条件，使修饰剂活化基团与酶分子的侧链基团以 共价键结合，对酶分子进行修饰。
分离：通过凝胶层析等方法将具有不同修饰度的酶分子 分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
大分子结合修饰
❖ 大分子结合修饰的作用：
a) 提高酶活力 b) 增加酶的稳定性 c) 降低或消除抗原性
聚合物、聚氨基酸等。（使用前一般需经过活化， 然后在一定条件下与酶分子共价结合。）
❖修饰条件控制：修饰剂的种类与浓度、温度、pH
和反应时间等。
大分子结合修饰
❖ 大分子结合修饰的过程：
修饰剂的选择：根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择 适宜的水溶性大分子。
修饰剂的活化：大分子修饰剂在使用之前一般需要经过 活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。
第四章 酶的分子修饰与模拟
为什么要对酶分子进行修饰？
❖ 酶的分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生 改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称 为酶分子修饰。
❖ 天然酶在应用中的限制因素：
▪ 容易变性失效：一般经不起高温、强酸、强碱、有机溶 剂及时间等的考验；
▪ 作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识 别降解；