多肽的制备及其活性研究进展

多肽的制备及其功能活性的研究进展

摘要：科学研究发现生物体内存在多种具有生理活性的多肽物质，它们具有不同的结构和功能活性。人体摄入的蛋白质经酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。几乎所有细胞都受多肽调节，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。人们已从包括人、植物、动物在内的各种生物体中分离出各类活性多肽，并且对多肽的性质、制备方法、分离纯化方法、鉴定技术、功能活性及应用等方面进行了大量的研究，并取得了一定的成效。本文介绍了活性多肽的制备方法及其活性研究现状，对多肽的多种功能活性进行了介绍，概述了不同来源多肽的制备方法和其功能活性研究进展。

关键词：多肽；功能活性；分离纯化

前言

近年来，多肽在生物体内的生理功能受到越来越多的重视。大量研究结果表明，蛋白质由于其分子量大，结构复杂，摄人人体后不易被消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的有效发挥。多肽是比蛋白质结构简单，分子量小，由2～16个氨基酸通过肽键连接的一类化合物，按氨基酸组成数目可人为分为短肽(2～5个氨基酸)，多肽(6～16个氨基酸)。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。科学发现，几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等均与活性多肽密切相关，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。由于多肽具有调节植物神经系统、活化细胞免疫机能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性，这为

开发肽药物、肽类保健食品提供了理论依据。可见，进行多肽的研究和开发有着十分重要的研究意义和应用前景【1】。

一，多肽的制备方法

目前，国内外制备多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化学合成法、基因重组法、分离提取法等。酶法生产功能性多肽应用较为普遍[2]。龚吉军等人[3]利用茶籽蛋白酶酶解制备菜籽多肽，确定了最佳条件，此条件下氨基酸态氮生成率可达34．64％，制备的茶籽多肽对超氧自由基和羟基自由基具有强烈的清除作用；李书国等人[4]研究了酶法生产大豆多肽的加工工艺，分离得到纯净的酸性水解物溶液，水解率高达95％；班玉凤等人[5]研究了Alcalase水解大豆蛋白制备大豆蛋白寡肽的方法，确定了酶解的最佳条件，其水解液的水解度达到了24．1％；刘大川等[6]也利用碱性蛋白酶对富硒菜籽分离蛋白酶解制备蛋白肽，水解度达32．51％，制得的富硒菜籽蛋白肽分子量分布较好，几乎完全是小分子多肽，分子量均在1500D以下。以下是几种方法优缺点的概述。

1，化学水解：酸解，碱解，

酸解法水解度不易控制，容易使氨基酸遭到破坏；碱解法能使L-氨基酸形成D-氨基酸，可能存在营养和毒理方面有害的效应，对于食品多肽的生产不足取。所以这两种方法都很少被使用破坏L型氨基酸，2，酶法水解：能在一定条件下进行定位水解产生特定的肽，且易于控制水解进程，并且具有高度的专一性，一般不会导致营养方面的损失，也不会产生毒理学上的问题，同时酶作用具有特异性，可在温和

条件下进行，因而能较好的满足肽的生产需要。

3，发酵法：直接利用微生物发酵过程中产生的蛋白酶降解蛋白，可达到较高的水解率，该技术的要求相对较高，对菌种的依赖性较大，，本质也是酶解。

目前采用较多的是酶法。酶法因其水解条件温和，水解度易控制，无环境污染的特点，备受推崇。而酶解法中双酶或多酶协同水解的方式又多被采用。因为这种方式生产下的水解液水解度大、苦味低、多肽种类多。现在蛋白质的水解一般都用酶法水解，在多肽的生产中酶的选择是关键，它不仅影响最后产品的得率，反应速度，而且直接影响产品的风味和理化特性，现有的酶解工艺多采用单酶水解，易产生苦，涩等不良风味影响了食用的要求，因此通常采用复合酶水解，例如：内肽酶和端肽酶，alcalase与flavourzyme得组合酶等。在蛋白质的酶解过程中水解度的控制是十分重要的参数因为过度的水解会

产生苦味肽，影响水解蛋白在食品中的应用【7】。

多肽制备的一般步骤：原料-前处理-提蛋白-干燥-蛋白粉-酶解-灭酶-离心分离-多肽液-干燥-多肽粉。

二，多肽含量的测定

1.双缩脲法

双缩脲反应：在强碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应可生成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在540纳米处测吸光值。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键都可发生双缩脲反应

2.OPA法（邻苯二甲醛法）；使用于乳源性的多肽测定，反应试剂：

含有25ml100mM 的硼砂2．5m120 (w／w)SDS、40rag OPA(邻苯二甲醛溶于lml甲醇、1o0 lp一巯基乙醇用去离子水定容至 50ml，用不同浓度的胰蛋白酶水解的酪蛋胨(多肽)来制作标准曲线，50／11样品溶液与2ml试剂室温下反应2rain，在340nm 下比色，查标准曲线即可以得到多肽的含量。

3.紫外吸收法；蛋白质溶液在238nm 处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比，所以此法适用于多肽的含量测定。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列5O～500fg／ml已知浓度的5．0ml蛋白质溶液，测定238nm 的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定【8】。

三多肽的分离纯化

随着现代生物技术的发展，用于蛋白质及多肽分离纯化的方法日益先进。常用的提取分离法包括：化学萃取法(如：醇法、丙酮法)、阴阳离子交换吸附柱、Sephadex凝胶过滤柱、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等方法。Chen等人[9]利用水醇提取法，结合离子交换、凝胶过滤和RP—HPLC从人参中分离到六种

含仅氨基酸的小肽。郝林琳等人[10]采用醋酸溶液和乙醇提取了6支鲜二杠马鹿茸的主干顶部、中部、根部3个部位的多肽。金声等人[11]将