色谱技术亲和色谱演示文稿

通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一 类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素 （lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、 结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专 一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条 件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结 构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便 宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。
配基的浓度
对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配 基浓度有利于吸附。
增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和结 合的部位与载体进行偶联。
腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱 氢酶和甘油激酶有吸附力。
亲和色谱
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大 分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特 性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲 和或生物特异性亲和色谱。
是亲和分离技术中最具优势的方法
平衡
混合蛋白样
液
品
带有配体的树 脂珠（或胶粒）
含配体溶液
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亲和纯化技术
亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
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配基
生物特异性配基 拟生物亲和配基
亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的 2、结合常数要适当 3、稳定性好，可进行化学改性
磷酸基接到载体上，对甘油醛-3磷酸脱氢酶有吸附力。
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配基分子的大小
选用大分子配基。 小分子物质作为配基，载
体和配基间插入一个“手 臂”以消除空间障碍。
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亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使
酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的 一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧 失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物 质称为酶的抑制剂（inhibitor）。
（3）A蛋白
A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，存 在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁 中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋 白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白 G(immunogloblin G，IgG)具有很强的亲和结合作用， 结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部 分）
色谱技术亲和色谱演示文 稿
（优选）色谱技术亲和色 谱
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱 或完成破坏。
2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH 下，亲和作用减弱或完成破坏。
3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和 作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但 是，疏水性相互作用增强
配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其 分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性 配体（general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质 等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原 和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合 都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特 异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的 重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤 其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适 的特异性配体通常需要大量的实验。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部 位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋 白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较 广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。
（2）抗体
利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间 具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～ 1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单 抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物 大分子的有效手段。
进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料 等配基。
亲和色谱介质的制备
基质的选择 理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体
结合。 5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰 胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻 璃珠等。
洗下未结合的 蛋白
收集目的蛋 白
亲和层析的基本特点
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生
物大分子 3、纯化倍数大，产物纯度高 4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳
定的层析条件 5、价格相ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并
噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群 体→氨基酸序列
SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
亲和洗脱
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结
合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物 的竞争性结合，洗脱目标产物。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子 种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用 减弱
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进 行分离的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互 作用的物质
找与底物专一可逆 结合的配基；
将配基通过共价键 偶联到基质；
配基与底物吸附； 洗脱目标物。
专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类
单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基团专一性的大分子亲和配基
亲和配基的选择
组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列