色谱技术亲和色谱演示文稿
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亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
亲和色谱法
亲和色谱法亲和色谱法是一种用于分离、纯化生物大分子的技术，它利用生物分子之间的亲和作用来进行分离、纯化。
它的基本原理是：在柱子的表面放置一种可以与目标生物分子发生亲和作用的固定化剂，然后将待测样品通过柱子进行流动。
当目标生物分子与固定化剂发生亲和作用时，就会被吸附在柱子的表面；而其他的杂质分子则不会被吸附，经过柱子流出。
最后，再通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来，即可得到高纯度的目标生物分子。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子；缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
亲和色谱法主要应用在生物学、药学、食品工业、环境监测等领域，并在这些领域取得了巨大的成功。
在生物学领域，亲和色谱法常用于抗体分离、酶的纯化、抗原的分离等；在药学领域，亲和色谱法常用于药物的纯化、抗体药物的生产等；在食品工业中，亲和色谱法常用于食品添加剂的分离、蛋白质的纯化等；在环境监测领域，亲和色谱法常用于水质监测、空气监测等。
亲和色谱法的原理是基于生物分子之间的亲和作用，因此选择固定化剂时需要考虑到固定化剂与目标生物分子之间的亲和作用。
常用的固定化剂有抗体、酶、抗原、细胞表面蛋白等。
选择固定化剂时，需要考虑到固定化剂的稳定性、选择性、可交换性、可再生性等因素。
亲和色谱法的实验过程大致分为固定化、流动、洗脱、解离四个步骤。
在固定化步骤中，需要将固定化剂放在柱子中，然后将柱子浸泡在预处理溶液中，使固定化剂与柱子结合起来。
在流动步骤中，需要将待测样品通过柱子进行流动。
在洗脱步骤中，需要通过适当的洗脱溶液将非目标生物分子从柱子上洗脱出来。
在解离步骤中，需要通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子。
缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
因此，在使用亲和色谱法时，需要根据实际情况来选择适当的固定化剂和洗脱溶液，并适当调整流速，以提高分离效率。
亲和色谱和超临界流体色谱演示文稿
亲和色谱和超临界流体色谱演 示文稿
当前第1页\共有91页\编于星期四\15点
亲和色谱和超临界流体色谱
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概述
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与 其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为
亲和作用。
静电作用、氢键等多种作用力对亲和作用具有影响。 生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲
和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结
合作用降低。
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介质活化与耦联
活化 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质
表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 溴化氰活化法
溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺
5．适当的多孔性。 一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交
联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。
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配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异 性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制 酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在 分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化 合物。
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（2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析
（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度 特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用 免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度 纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
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亲和色谱和超临界流体色谱
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概述
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与 其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为
亲和作用。
静电作用、氢键等多种作用力对亲和作用具有影响。 生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲
和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结
合作用降低。
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介质活化与耦联
活化 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质
表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 溴化氰活化法
溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺
5．适当的多孔性。 一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交
联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。
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配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异 性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制 酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在 分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化 合物。
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（2）抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析
（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度 特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用 免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度 纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
亲和色谱PPT
免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题
固定金属离子亲和色谱法
固定金属离子亲和色谱法固定金属离子亲和色谱法是一种重要的蛋白质分离、富集及纯化技术，也是一种非常有效的生物学分析方法。
该方法依赖于金属离子与蛋白分子表面，特异性结合的性质，将目标蛋白从复杂混合样品中分离出来。
在这篇文章中，我们将对固定金属离子亲和色谱法的基本原理、实验步骤及应用进行详细介绍。
一、基本原理固定金属离子亲和色谱法的基本原理是利用某些金属离子与目标蛋白表面的含有亲和性氨基酸残基（如组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸等）结合，从复杂混合样品中将目标蛋白纯化出来。
金属离子通常是Ni2+，Co2+，Cu2+，Zn2+等稳定的金属离子，在色谱柱中被固定在亲和层上。
二、实验步骤 1. 选择合适的金属离子柱：根据分离富集目标蛋白所含的具有亲和性的氨基酸残基，选择相应的金属离子进行柱的准备。
2. 准备样品：将需要富集的蛋白提取出来，去除杂质，调整其浓度。
3. 样品荷载：将样品加到已经平衡好的金属离子柱中。
4. 洗脱：通过洗脱液，使不结合目标蛋白被洗脱出来，目标蛋白则被固定在金属离子柱中。
5. 重构：在某些情况下，经过清洗的柱需要被重构，以拆卸纯化出来的蛋白结合在柱子上的离子。
6. 分析已经出现的蛋白质：然后这个样品就被送到下一个步骤，例如质谱或免疫学检测。
三、应用固定金属离子亲和色谱法已广泛应用于研究重要蛋白质的快速分离和纯化，如酵素、蛋白质结构域、靶分子、受体蛋白、蛋白质组分、活性多肽等，因其具有操作简单、富集分离效率高、适用范围广、选择性好等优点而被广泛采用。
在药物筛选、酶学研究、免疫学诊断以及生物技术中都可以应用固定金属离子亲和色谱法，如纯化蛋白质，构建蛋白质互作网络，生产工业酶，快速识别蛋白质质谱等。
总之，固定金属离子亲和色谱法作为一种有效的生物分离、富集及纯化技术，已在生物学和药物学领域发挥着重要作用，其已成为蛋白质分离、富集及纯化技术中一个重要的分支。
8 亲和色谱
4)．温度T T 使分子和原子的热运动，结合 中心的静电作用、氢键及金属配位 键，但可使疏水性作用。
5)．离子 SCN-，I-和ClO4-等半径较大的阴离 子能降低疏水相互作用。则这些离 子会降低Affinity。
6). 表面活性剂/乙二醇
7)．鳌合剂 如果Affinity源于亲和分子对与金属离子 形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸 EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使 Affinity消失。
Affinity。
许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱， 说明静电引力在Affinity中占有重要地位。
2)．pH 配体
配基
结合中心
在亲和分离操作中, 溶液pH值的选择是 非常重要的.
3).抑制氢键形成的物质
脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成. 因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐 酸胍可减弱Affinity。但他们为强烈变性剂。
是亲和技术与膜分离相结合的分离 纯化技术，是亲和层析的另一种变形.
优点(兼备亲和吸附与膜分离):
1st 亲和作用高选择性 + 不溶性微粒固定相的亲和配基，从而增 大目标分子与杂分子的尺寸差别，大大提高膜分离的选择性。 使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析；
2nd 膜分离以压差为传质推动力，速度快，易于放大和实现连续 化操作;
吸附的影响因素
亲水性 目标产物
1st 离子强度
疏水性 目标产物
疏水性 杂蛋白
亲水性 杂蛋白
2nd 离子种类
3rd pH Value 4th 杂蛋白
亲和色谱洗脱
可控制的条件
1st 离子强度 2nd pH 3rd 抑制氢键形成的物质
4th 温度
5th 离子
第9章 亲和色谱
硅胶的活化
硅烷化试剂 配基的固定化 直接固定法(慢) 间接固定法(氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
配基密度对蛋白质吸附的影响
通常情况下，目标产物的吸附容量随配基固定化密度 的提高而增大。但是，当配基固定化密度过高时，配 基之间会产生空间位阻作用(steric hindrance)，影响 配基与目标产物之间的亲和吸附，配基的有效利用率 降低； 因此，配基固定化密度也不宜过高，通常存在最佳密 度值范围。
模型分析(前述吸附理论和模型均可用于亲和色谱的分析)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.6 亲和色谱的应用
组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化-酶的抑制剂为 亲和配基
t-PA是一种糖蛋白，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋 白药物； t-PA主要存在于动物心脏组织中，但含量很低； 目前主要利用重组DNA动物细胞生产t-PA 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒常用作配基
生物分离工程 第8章 亲和色谱
间隔臂的作用(消除空间位阻的影响)
配基
目 标 分 子
间隔臂
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.4 亲和吸附平衡
吸附等温线
基本上可用Langmuir或Freundlich方程描述
色素亲和吸附平衡
色素配基研究得最多的是辛巴蓝(Cibacron Blue 3GA, CB) CB与蛋白质的结合机理
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔”的关系是亲和作用的必要条件，但并不充分， 还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整 地体现亲和结合作用，包括：
生物分离工程 第8章 亲和色谱
静电作用：亲和作用分子对的结合部位上带有相反电 荷时，产生静电引力。如果满足“钥匙”和“锁孔” 的关系，在近距离发生的静电引力 很强烈的； 氢键：如果亲和作用分子对的一个分子中含有O原子或 N原子，结合部位之间可以产生氢键作用，形成O-H-O 或O-H-N的氢键结合，但氢键的产生与否受结合部位 之间位置关系的严格制约，O-H-O或O-H-N需排列在一 条直线上； 疏水性相互作用：如果亲和作用分子对的一个分子中 含有芳香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部位上 也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用， 如含有脯氨酸等氨基酸残基的蛋白质，胶原与单宁的 结合可通过疏水键结合； 配位键：如果亲和作用分子对均与同一金属离子配位， 则两者之间可通过金属配位键结合；
sepharose 亲和色谱法
sepharose 亲和色谱法1. 简介sepharose 亲和色谱法是一种常用的生物分离技术，利用生物分子之间的亲和性相互作用来分离和纯化目标蛋白或其他生物大分子。
sepharose 是一种基于琼脂糖的树脂，具有良好的生物相容性和化学稳定性，被广泛应用于生物学和生物化学领域。
2. sepharose 亲和色谱法的原理亲和色谱法利用生物大分子之间的特异性相互作用来分离目标分子。
这种相互作用可以是蛋白和配体之间的特异性结合，也可以是抗体和抗原之间的特异性结合。
sepharose 树脂表面可以共价结合上不同的亲和基质，如金属离子、抗体、配体等，用以与目标分子特异性结合。
通过在不同条件下改变洗脱缓冲液的成分和pH值，可以使非特异性结合的分子从树脂上洗脱下来，而目标分子保持结合状态，从而实现目标分子的纯化和分离。
3. 应用领域sepharose 亲和色谱法在生物制药、生物化学、分子生物学等领域有着广泛的应用。
它常用于分离和纯化重组蛋白、抗体、酶、激素等生物大分子，用以制备高纯度的生物药物。
sepharose 亲和色谱法也常用于研究生物分子的相互作用，如蛋白-蛋白相互作用、受体-配体相互作用等，为生物学研究提供重要的实验手段。
4. 个人观点在我看来，sepharose 亲和色谱法作为一种重要的生物分离技术，不仅在生物医药领域发挥着重要作用，也对于基础研究有着重要意义。
它通过利用生物分子之间的特异性相互作用，实现了对生物大分子的高效分离和纯化，为生物大分子的研究和应用提供了重要的基础支持。
未来，随着生物医药领域的不断发展和生物技术的不断进步，sepharose 亲和色谱法必将发挥更加重要的作用。
总结在本文中，我对sepharose 亲和色谱法的原理、应用领域和个人观点进行了详细的阐述。
通过该技术，可以高效地对生物大分子进行纯化和分离，为生物医药领域和基础研究提供了重要的支持。
我相信随着生物技术的不断发展，sepharose 亲和色谱法将发挥越来越重要的作用。
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法
亲和层析色谱法（Affinity chromatography）是一种利用生物分子的特异性相互作用进行分离和纯化的技术方法。
它基于目标分子与固定相上的亲和配体之间的特异性结合，通过这种结合来实现分离和富集目标分子。
亲和层析色谱法的原理是在固定相上引入亲和配体，这些配体可以选择性地与目标分子结合。
固定相通常是一种多孔的或者具有大表面积的材料，如琼脂糖凝胶、硅胶、聚合物等。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和标记物等，它们能够与目标分子发生特异性的结合。
在进行亲和层析色谱时，目标分子溶液会通过固定相，处于非特异性结合的状态下，不与固定相上的亲和配体结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物。
最后，通过改变溶液条件（如pH、温度等），使得目标分子与亲和配体之间的结合解离。
这样，目标分子就可以从固定相上洗脱出来。
这种方法能够实现对目标分子的高效纯化和富集。
亲和层析色谱法广泛应用于生物化学、生物技术和制药工业中，用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物分子。
它具有选择性高、纯化效果好、操作简
便等特点，已成为分离和纯化生物分子的重要方法之一。
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
亲和柱色谱
2011-6-20 13
2011-6-20
3
混合蛋白样 品
平衡 液
含配体溶液
带有配体的树 脂珠（或胶粒） 脂珠（或胶粒）
2011-6-20
洗下未结合的蛋 白
收集目的蛋 白
4
在亲和吸附过程中， 在亲和吸附过程中，需选择和使用合适的平 衡缓冲液。 衡缓冲液。平衡缓冲液是样品液通过亲和柱之前 之后用于冲洗亲和柱上杂质的溶液。 之后用于冲洗亲和柱上杂质的溶液。 在洗脱过程中， 在洗脱过程中，洗脱液的选择目的在于减弱 配基与亲和物之间的亲和力， 配基与亲和物之间的亲和力，利用其可逆性使两 者组成的络和物完全解离。 者组成的络和物完全解离。 常用的洗脱液有: 常用的洗脱液有: NaCI-磷酸缓冲液、 水、0.1～0.5mol/L NaCI-磷酸缓冲液、 0.1～ 0.lmol/L硼酸 0.1～1mol/L乙酸 稀氨水等。 硼酸、 乙酸、 0.lmol/L硼酸、0.1～1mol/L乙酸、稀氨水等。
2011-6-前，许多活化载体已商品化，可供各种配 基的固定化。 基的固定化。 商品化的亲和吸附介质种类有限， 商品化的亲和吸附介质种类有限，不能满 足各方面要求。在实际应用中， 足各方面要求。在实际应用中，特别是在科研 工作中往往需要在实验室内合成所需的亲和吸 附介质。合成的方法很多，如溴化氰活化法、 附介质。合成的方法很多，如溴化氰活化法、 环氧基活化法、间接固化法、硅胶活化法、间 环氧基活化法、间接固化法、硅胶活化法、 隔臂法等。 隔臂法等。
2011-6-20 9
④洗脱 特异性洗脱 洗脱剂中含有与亲和配基或目标产物具 有亲和作用的小分子化合物， 有亲和作用的小分子化合物，通过这些小 分子化合物与亲和配基或目标产物的竞争 性结合，脱附目标产物。 性结合，脱附目标产物。 特异性洗脱法的洗脱条件温和， 特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于 保护目标产物的生物活性。 保护目标产物的生物活性。
2011-6-20
3
混合蛋白样 品
平衡 液
含配体溶液
带有配体的树 脂珠（或胶粒） 脂珠（或胶粒）
2011-6-20
洗下未结合的蛋 白
收集目的蛋 白
4
在亲和吸附过程中， 在亲和吸附过程中，需选择和使用合适的平 衡缓冲液。 衡缓冲液。平衡缓冲液是样品液通过亲和柱之前 之后用于冲洗亲和柱上杂质的溶液。 之后用于冲洗亲和柱上杂质的溶液。 在洗脱过程中， 在洗脱过程中，洗脱液的选择目的在于减弱 配基与亲和物之间的亲和力， 配基与亲和物之间的亲和力，利用其可逆性使两 者组成的络和物完全解离。 者组成的络和物完全解离。 常用的洗脱液有: 常用的洗脱液有: NaCI-磷酸缓冲液、 水、0.1～0.5mol/L NaCI-磷酸缓冲液、 0.1～ 0.lmol/L硼酸 0.1～1mol/L乙酸 稀氨水等。 硼酸、 乙酸、 0.lmol/L硼酸、0.1～1mol/L乙酸、稀氨水等。
2011-6-前，许多活化载体已商品化，可供各种配 基的固定化。 基的固定化。 商品化的亲和吸附介质种类有限， 商品化的亲和吸附介质种类有限，不能满 足各方面要求。在实际应用中， 足各方面要求。在实际应用中，特别是在科研 工作中往往需要在实验室内合成所需的亲和吸 附介质。合成的方法很多，如溴化氰活化法、 附介质。合成的方法很多，如溴化氰活化法、 环氧基活化法、间接固化法、硅胶活化法、间 环氧基活化法、间接固化法、硅胶活化法、 隔臂法等。 隔臂法等。
2011-6-20 9
④洗脱 特异性洗脱 洗脱剂中含有与亲和配基或目标产物具 有亲和作用的小分子化合物， 有亲和作用的小分子化合物，通过这些小 分子化合物与亲和配基或目标产物的竞争 性结合，脱附目标产物。 性结合，脱附目标产物。 特异性洗脱法的洗脱条件温和， 特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于 保护目标产物的生物活性。 保护目标产物的生物活性。
免疫亲和色谱PPT幻灯片
2021/3/8
2021/3/8
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和IAC本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacrylபைடு நூலகம் 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。
2021/3/8
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。
用GC-MS测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析7个同化激素，用7个单独的IAC 基体合在一个柱中。
2021/3/8
IAC具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对IAC 还有更多要求。
IAC基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、ß-激动剂、皮质激素 以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产商 业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
2021/3/8
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和IAC本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacrylபைடு நூலகம் 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。
2021/3/8
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。
用GC-MS测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析7个同化激素，用7个单独的IAC 基体合在一个柱中。
2021/3/8
IAC具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对IAC 还有更多要求。
IAC基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、ß-激动剂、皮质激素 以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产商 业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
色谱分离技术—亲和色谱分离技术
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 辅酶和磷酸腺苷
某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶 和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和 配基。
主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 过度金属离子
铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表 面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。
的亲和能力有决定性影响。
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化 将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和
吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。 2.亲和吸附
即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸 附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。
亲和色谱法的操作方法
3.解吸附 解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和
柱上的目的产物洗脱出来。
亲和色谱法的操作方法
4.色谱柱再生 用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未
亲和层析介质
亲和层析介质由载体和配基组成
亲和载体
载体应具备的条件： 1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。 2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。 3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。
第九章_亲和色谱
wwwimustcnbioseparationengineeringwwwimustcn原料液细胞分离离心过滤细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一a路线一b清液胞外产物粗分离盐析萃取超过滤等纯化层析电泳脱盐凝胶过滤超过滤浓缩超过滤精制结晶干燥包含体溶解加盐酸胍脲复性生化分离过程的一般流程
9.3亲和色谱的介质
亲和吸附介质是必备材料，过程的关键。商品化 介质不能满足需要时，要自制其过程是首先选择适当 的配基，然后修饰固定相制成吸附剂。 亲和吸附介质的组成：
载体（骨架） 配基
间隔臂
（1） 载体： 载体为固定配基提供了基质，理想的载体应具备以下性 质： a.具有亲水性 b.具有大量化学基团 c.机械强度好 d.稳定性好 e.颗粒大小及孔径均匀 琼脂糖是应用最 普遍的，见右图。其他 还有纤维素、多孔玻璃 及其他化学合成介质。
C.配基的分类 ： a.特异性配基
只针对单一的物质进行特异的结合，特异性随条件变化，对不同的 分离对象为获得特异性配基常常需要实验筛选，这类配基选择性高，方 便，种类少；
b. 通用性配基或群特异性配基
可与一类或几种生物分子作用，配基为小分子。优点是容量高，花 费低。通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补特异性较差的缺点。广泛采 用的有：三嗪染料、金属螯合物组氨酸、核苷酸等。
亲和作用体系: 亲和作用体系由亲和作用的分子对组成，可以是 大分子－大分子、大分子－小分子、大分子－细胞和 细胞－细胞各种体系。 常用体系：分为两类 高度特异性体系：分 子成一对一的关系 群特异性体系： 一个分子与同类基团 的各种分子相结合。
（3）间隔臂： 引出的原因：存在几何位阻； 定义：配基和载体中间加入一定长度的有机基团，称间隔臂。 见下图。 对间隔臂的要求：长度适当，具有亲水性。 常用的间隔臂：乙二胺，己二胺，6-氨基己酸，β-羟基丙氨 酸。 理想的间隔臂：长度合适，不进行非特异的吸附，无外加的 活性吸附点，有双功能反应基团。
9.3亲和色谱的介质
亲和吸附介质是必备材料，过程的关键。商品化 介质不能满足需要时，要自制其过程是首先选择适当 的配基，然后修饰固定相制成吸附剂。 亲和吸附介质的组成：
载体（骨架） 配基
间隔臂
（1） 载体： 载体为固定配基提供了基质，理想的载体应具备以下性 质： a.具有亲水性 b.具有大量化学基团 c.机械强度好 d.稳定性好 e.颗粒大小及孔径均匀 琼脂糖是应用最 普遍的，见右图。其他 还有纤维素、多孔玻璃 及其他化学合成介质。
C.配基的分类 ： a.特异性配基
只针对单一的物质进行特异的结合，特异性随条件变化，对不同的 分离对象为获得特异性配基常常需要实验筛选，这类配基选择性高，方 便，种类少；
b. 通用性配基或群特异性配基
可与一类或几种生物分子作用，配基为小分子。优点是容量高，花 费低。通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补特异性较差的缺点。广泛采 用的有：三嗪染料、金属螯合物组氨酸、核苷酸等。
亲和作用体系: 亲和作用体系由亲和作用的分子对组成，可以是 大分子－大分子、大分子－小分子、大分子－细胞和 细胞－细胞各种体系。 常用体系：分为两类 高度特异性体系：分 子成一对一的关系 群特异性体系： 一个分子与同类基团 的各种分子相结合。
（3）间隔臂： 引出的原因：存在几何位阻； 定义：配基和载体中间加入一定长度的有机基团，称间隔臂。 见下图。 对间隔臂的要求：长度适当，具有亲水性。 常用的间隔臂：乙二胺，己二胺，6-氨基己酸，β-羟基丙氨 酸。 理想的间隔臂：长度合适，不进行非特异的吸附，无外加的 活性吸附点，有双功能反应基团。
免疫亲和色谱PPT课件
3
生物工程技术
利用基因工程和蛋白质工程技术，开发具有高亲 和力和选择性的免疫亲和色谱配体，提高分离效 果。
提高免疫亲和色谱的特异性、灵敏度与重现性
优化免疫亲和色谱配体
通过蛋白质工程和基因工程技术，对免疫亲和色谱配体进行改造 和优化，提高其亲和力和选择性。
信号放大技术
结合酶促反应、化学放大等技术，提高检测信号的强度和灵敏度， 降低检测限。
免疫亲和色谱ppt课件
• 免疫亲和色谱简介 • 免疫亲和色谱的制备 • 免疫亲和色谱的操作流程 • 免疫亲和色谱的实际应用案例 • 免疫亲和色谱的未来发展与挑战
01
免疫亲和色谱简介
定义与原理
定义
免疫亲和色谱是一种基于抗原-抗 体特异性结合的分离分析技术。
原理
利用抗体或抗原与固定相上的配 基进行特异性结合，达到分离目 标物质的目的。
免疫亲和色谱的应用领域
01
02
03
04
生物药物分离纯化
用于分离纯化抗体、蛋白质、 酶等生物药物。
临床诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体，辅助疾病诊断。
环境监测
用于检测环境中的有害物质， 如毒素、重金属等。
食品安全
用于检测食品中的有害物质、 农药残留等。
免疫亲和色谱的优势与局限性
优势
高特异性、高纯度分离、操作简便、 可重复使用等。
准确性。
样品纯化
去除样品中的杂质，提高样品的纯 度，以便更好地进行后续分析。
样品标记
对样品进行标记，以便在免疫亲和 色谱分离过程中进行追踪和检测。
免疫亲和色谱分离
抗体选择
选择针对目标分子的特 异性抗体，确保分离的
准确性和高效性。
9 亲和色谱
疏水色谱 在载体表面连接上疏水的直链碳链或其 他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的 某些疏水基团相互作用，从而实现多组 分的分离。 操作要点 蛋白质的局部变性 洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行
离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 操作要点： 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值 下，其解离程度是不同的，因此既可以采 用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可 视具体情况而定 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗 脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当 解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不 是等电点）
应用举例 利用高温杀死的酵母细胞为亲和过滤介质进行 亲和过滤纯化con A的研究。 酵母细胞（直径约5 μm）表面含有多糖残基， 因此可亲和吸附con A。
亲和双水相萃取
亲和双水相萃取即在PEG或Dextran上接上 一定的亲和配基，这样使体系具有双水相处 理量大和亲和色谱专一性高的优点。
柱子：BSA-Sepharose 4B
洗脱方式：逐次降低洗脱液pH值
分离组分：BSA血清不同的抗体组分。
应用举例
组织纤溶酶原激活剂（tPA）的纯化
干扰素（IFN）的纯化 重组人白细胞干扰素，经 一步单抗免疫亲和层析， rhIFN-α比活提高了1150 倍，收率达95%。
柱子：精氨酸-Sepharose 4B亲和柱 洗脱液：盐酸胍（GuCl) 猪心组织t-PA :活性提高7 倍，收率为56%
色谱法的基本原理
色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差 异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、 分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的， 称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相） 中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度 移动而达到分离的目的。
色谱聚焦亲和色谱.PPT
洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA
.
66
.
67
.
68
四、有机染料亲和色谱 (p158)
原理 有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具 类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质 为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。
.
69
L的类似物L′，S的类似物S′ *采用酶促反应的多元专一性洗脱 ㈣. 表面活性剂
减少疏水作用、范德华力
种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等
.
58
㈤. 解离试剂
主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等
㈥. 降低温度t
较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力
㈦. 电泳解吸
+
在柱两端连上电极进行电泳
四、脱盐
㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
商品名：CNBr-Sepharose
.
47
一般步骤：
冻干粉 溶胀洗涤 溶解L ①
混合反应 ②
掩蔽 ③
洗去L（未结合）
成品
.
48
亲和吸附剂的制备过程
.
49
㈠. 溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
.
53
第五节 一般实验方法
是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无
选L 选偶联Gel
偶联L 装柱
.
54
安装仪器
平衡（2～3Vt） 加样吸附
洗去非吸附物
亲和柱
洗脱液
再生
脱盐
.
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68
四、有机染料亲和色谱 (p158)
原理 有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具 类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质 为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。
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69
L的类似物L′，S的类似物S′ *采用酶促反应的多元专一性洗脱 ㈣. 表面活性剂
减少疏水作用、范德华力
种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等
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58
㈤. 解离试剂
主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等
㈥. 降低温度t
较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力
㈦. 电泳解吸
+
在柱两端连上电极进行电泳
四、脱盐
㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
商品名：CNBr-Sepharose
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47
一般步骤：
冻干粉 溶胀洗涤 溶解L ①
混合反应 ②
掩蔽 ③
洗去L（未结合）
成品
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48
亲和吸附剂的制备过程
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49
㈠. 溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
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53
第五节 一般实验方法
是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无
选L 选偶联Gel
偶联L 装柱
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54
安装仪器
平衡（2～3Vt） 加样吸附
洗去非吸附物
亲和柱
洗脱液
再生
脱盐
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5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用 减弱
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进 行分离的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互 作用的物质
找与底物专一可逆 结合的配基；
将配基通过共价键 偶联到基质；
配基与底物吸附； 洗脱目标物。
配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其 分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性 配体（general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质 等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原 和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合 都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特 异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的 重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤 其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适 的特异性配体通常需要大量的实验。
配基的浓度
对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配 基浓度有利于吸附。
增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
21
配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和结 合的部位与载体进行偶联。
腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱 氢酶和甘油激酶有吸附力。
色谱技术亲和色谱演示文 稿
（优选）色谱技术亲和色 谱
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱 或完成破坏。
2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH 下，亲和作用减弱或完成破坏。
3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和 作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但 是，疏水性相互作用增强
专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类
单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基团专一性的大分子亲和配基
亲和配基的选择
组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列
6
亲和纯化技术
亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
7
配基
生物特异性配基 拟生物亲和配基
亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的 2、结合常数要适当 3、稳定性好，可进行化学改性
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一 类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素 （lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、 结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专 一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条 件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结 构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便 宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。
磷酸基接到载体上，对甘油醛-3磷酸脱氢酶有吸附力。
22
配基分子的大小
选用大分子配基。 小分子物质作为配基，载
体和配基间插入一个“手 臂”以消除空间障碍。
23
亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使
酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的 一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧 失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物 质称为酶的抑制剂（inhibitor）。
（3）A蛋白
A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，存 在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁 中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋 白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白 G(immunogloblin G，IgG)具有很强的亲和结合作用， 结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部 分）
洗下未结合的 蛋白
收集目的蛋 白
亲和层析的基本特点
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生
物大分子 3、纯化倍数大，产物纯度高 4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳
定的层析条件 5、价格相对较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并
亲和色谱
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大 分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特 性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲 和或生物特异性亲和色谱。
是亲和分离技术中最具优势的方法
平衡混合蛋白样源自液品带有配体的树 脂珠（或胶粒）
含配体溶液
噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群 体→氨基酸序列
SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
亲和洗脱
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结
合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物 的竞争性结合，洗脱目标产物。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子 种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料 等配基。
亲和色谱介质的制备
基质的选择 理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体
结合。 5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰 胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻 璃珠等。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部 位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋 白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较 广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。
（2）抗体
利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间 具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～ 1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单 抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物 大分子的有效手段。
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进 行分离的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互 作用的物质
找与底物专一可逆 结合的配基；
将配基通过共价键 偶联到基质；
配基与底物吸附； 洗脱目标物。
配基的选择
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其 分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性 配体（general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质 等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原 和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合 都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特 异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的 重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤 其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适 的特异性配体通常需要大量的实验。
配基的浓度
对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配 基浓度有利于吸附。
增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
21
配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和结 合的部位与载体进行偶联。
腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱 氢酶和甘油激酶有吸附力。
色谱技术亲和色谱演示文 稿
（优选）色谱技术亲和色 谱
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱 或完成破坏。
2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH 下，亲和作用减弱或完成破坏。
3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和 作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但 是，疏水性相互作用增强
专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类
单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基团专一性的大分子亲和配基
亲和配基的选择
组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列
6
亲和纯化技术
亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
7
配基
生物特异性配基 拟生物亲和配基
亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的 2、结合常数要适当 3、稳定性好，可进行化学改性
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一 类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素 （lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、 结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专 一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条 件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结 构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便 宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。
磷酸基接到载体上，对甘油醛-3磷酸脱氢酶有吸附力。
22
配基分子的大小
选用大分子配基。 小分子物质作为配基，载
体和配基间插入一个“手 臂”以消除空间障碍。
23
亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使
酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的 一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧 失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物 质称为酶的抑制剂（inhibitor）。
（3）A蛋白
A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，存 在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁 中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋 白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白 G(immunogloblin G，IgG)具有很强的亲和结合作用， 结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部 分）
洗下未结合的 蛋白
收集目的蛋 白
亲和层析的基本特点
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生
物大分子 3、纯化倍数大，产物纯度高 4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳
定的层析条件 5、价格相对较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并
亲和色谱
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大 分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特 性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲 和或生物特异性亲和色谱。
是亲和分离技术中最具优势的方法
平衡混合蛋白样源自液品带有配体的树 脂珠（或胶粒）
含配体溶液
噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群 体→氨基酸序列
SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
亲和洗脱
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结
合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物 的竞争性结合，洗脱目标产物。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子 种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料 等配基。
亲和色谱介质的制备
基质的选择 理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体
结合。 5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰 胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻 璃珠等。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部 位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋 白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较 广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。
（2）抗体
利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析 （Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间 具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～ 1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单 抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物 大分子的有效手段。