第七章 亲和层析技术

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二、亲和层析载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
• • • • • （1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。
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（二）、常用载体
• 主要用于分离与核酸有关的物质。
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2、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为 Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。
• 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种 功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 • Sepharose CL,稳定性明显增加，能在 pH3~14中应用。
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离子效应
• 配基与载体-间隔臂的不 完全结合，将无关离子 基团引入吸附剂。 • 具有离子基团的亲和吸 附剂会影响蛋白质的洗 脱行为。
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疏水基团
• 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中 的疏水区相互吸引，形成非专一性 吸附。
• 疏水基团： • （1）长的烃链结构的“手臂”： • （2）疏水性配基：
• 利用生物大分子物质具有与某些相应 的分子专一性可逆结合的特性而建立 的层析技术。 • 适用于从成份复杂且杂质含量远大于 目标物的混合物中提纯目标物。
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特点(p145)
• 经过一次处理可得到高纯度活性物质 ；
• 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度 快、分离效果好、分离条件温和； • 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
• • 改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化.
• 亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 Cl－<I－<CF3COO－<SCN－ <CCl3COO－。 • 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
• AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 • CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶联。
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•
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3、环氧活化型Sepharose 6B
• 由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体通 过醚链形成的衍生物。 • 用于小分子配基的固定化。 • 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
亲和色谱
• 利用生物分子间的特 异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯 化的技术称为亲和纯 化技术（Affinity purification）
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技术要点
• （1）找与底物专一 可逆结合的配基； • （2）将配基通过共 价键偶联到基质； • （3）配基与底物吸 附； • （4）洗脱目标物。
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碳二亚胺缩合法
• 碳二亚胺为 羧基活化剂。
• 反应中的脲 衍生物可用 有机溶剂洗 涤除去。
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（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
• Sepharose 4B 经 CNBr 活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。 2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物
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亲和纯化技术
• • • • • • 亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
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亲和层析 (affinity Chromatography)
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亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
• （ 1 ）配基固定化：配基 与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。 • （ 2 ）吸附样品：亲和层 析介质选择性吸附生物活 性物质. （ 3 ）样品解吸：选择适宜 的条件使被吸附物活性物 质解吸。
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• 3、葡聚糖凝胶： • 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小， 应用受到限制。 • 4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P • 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 • pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
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• 聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加 1mol/L 的亚 硝酸，反应液搅90s； • 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
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重氮化法
• ω- 氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得 对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 • 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 • 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
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Байду номын сангаас
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方法
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高碘酸氧化法
• 多糖载体与 0.1mol/L的高碘酸钠氧化反应 24 小 时会产生醛； • 在温和条件下，醛与赖氨酸上的 ε-NH2 生成希 夫 碱 ，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基 胺。
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环氧化法
• 碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用 生成环氧化合物； • 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
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• （四）、载体孔径的影响 • 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 • 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 • • • • （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
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六、 配基与间隔臂的连接
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甲苯磺酰氯法
• 甲苯磺酰氯法 • 在无水丙酮中进行。
• 优点：①活化反应迅速； • ②偶联条件温和； • ③偶联效率高。
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双功能试剂法
• 双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的 化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。 • 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 • 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、 酚、醇类等偶联。 •
• 亲和吸附剂及配体的性质 • 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析 流速有关。
• • • • 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。
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非专一性吸附
• 亲和层析中的非专一性吸附。 • • • 离子效应 疏水基团 复合亲和力
• 空间位阻。 • 对于分子大的配体以及小 分子配基更明显。 • “手臂”，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。 • 常用的“手臂”多为烃链 。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
• 多肽或蛋白质等大分子配基
• 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能 基团与载体连接。 • 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附 剂具有较大的亲和力。
• • • • • • • 纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——Ultrogels ACA、 magnogels ACA44
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1、纤维素
• 纤维素结构紧密、均一性差，不利于大 分子的渗入。 • 非特异性吸附力较强，空间位阻。
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102
• CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； • Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 • Affi-Gel202 具有 10 个原子的“手臂”，未端具 有羧基；
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五、 亲和层析的影响因素
• • • •
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（一）、配基的选择
• 亲和层析配基的选用主要取决于分离对 象。 • 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲 和势），KL 在10-4～10-8之间。 • 2、配基与配体的结合应是专一的 。 • 3、配基应具有化学活性 。
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（二）、配基的浓度
• 对 亲 和 势 比 较 低 的 时 候 （ KL≥104mol/L ），增加配基浓度有利于吸 附。 • 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱 困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。 • AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤 N6- 氨基接到载体上，对 脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛 3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物 活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• • • • • 溴化氰活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法
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溴化氰活化法
• 载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下 用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳 酸”中间体。 • 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨 基或芳香族氨基的配基偶联。
(p153)
• • • • • （一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基 配基的连接
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七、 亲和层析的吸附和洗脱
• 影响吸附的条件 • 亲和层析的洗脱 • 亲和吸附剂的再生
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（一）、影响吸附的条件
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通用配基（general ligand）
• 用于一类物质的分离提纯。 • 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配 基； • 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； • 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时 的通用配基等。
特殊配基（specific ligand）
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四、 载体的活化与偶联
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质 : 特殊配基和通用配 基。 • 特殊配基（special ligand）
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配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响
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（一）、配基浓度对亲和力的影响
• 为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值 ≥10。 • 配基浓度与亲和对解离常数相关。
• 对于低亲和力系统，配基浓度。
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（二）、空间障碍的影响
• 5、多孔玻璃珠：
• 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 • 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱 性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基 团少。
• 6、其它载体(p147)
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三 、 亲和配基
• • • • • • 理想配基的特点(p149)* 配基的选择 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型
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复合亲和力
• 离子效应作用，又有疏水作用。
• 配体与配基有较强生物特异性。 • 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高 选择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
• 洗脱 • 洗脱方法主要有三种： • 非专一性洗脱 • 特殊洗脱 • 专一性洗脱
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非专一性洗脱
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4、活化型亲和胶10和15
• 由 N- 羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化 酯。 • Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一 些负电荷，有利于碱性或中性蛋白偶联； • Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些 正电荷，故有利于酸性蛋白的偶联。
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（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法 • 重氮化法 (含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
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聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。
• 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
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叠氮化法