细胞筛选个人整理
细胞筛选个人
细胞筛选个人Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】细胞筛选一嘌呤霉素(一)确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞工程和生物医学研究中非常重要的一环。
以下是关于稳定细胞系筛选的50条注意事项，并对每一条进行详细描述：1. 选择合适的细胞系来源：在进行稳转细胞系筛选前，首先要选择合适的细胞系来源，以确保细胞系的稳定性和易转染性。
常用的细胞系来源包括HEK293、CHO、MDCK等。
2. 确定转染条件：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定适合的转染条件，包括转染试剂种类、浓度、转染时间和细胞密度等。
3. 标定荧光素酶检测试剂盒：在进行稳转细胞系筛选时，需要使用荧光素酶检测试剂盒来检测稳定转染细胞系的活性。
4. 建立适当的质粒载体：选择适当的质粒载体对稳转细胞系的构建和筛选至关重要。
常用的载体包括pCDNA3.1、pcDNA3.1+、pEGFP-N1等。
5. 筛选适宜的筛选标记物：在进行稳转细胞系筛选前，需要选择适宜的筛选标记物，如抗生素、蛋白荧光标记等。
6. 确定稳定转染细胞系的稳定性：在进行稳定转染细胞系筛选时，需要对转染细胞系的稳定性进行验证，通常采用长期培养和连续传代的方式来确保转染细胞系的稳定性。
7. 选择适合的培养基和培养条件：在进行稳转细胞系筛选时，需要选择适合的培养基和培养条件以促进细胞系的稳定生长和表达。
8. 确定荧光素酶基因的稳定插入：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保荧光素酶基因在细胞基因组中的稳定插入，通常采用PCR、Southern blotting等方法来验证。
9. 考虑基因组的稳定性：在进行稳转细胞系筛选前，需要考虑基因组的稳定性，并尽量避免对细胞基因组的不良影响。
10. 确定筛选标准：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定筛选标准，如荧光素酶基因活性的阈值、抗生素的最佳浓度等。
11. 使用酶切鉴定：使用酶切鉴定来确保质粒载体的正确构建和稳定转染细胞系的正确筛选。
12. 建立稳定转染细胞系的储备：在进行稳转细胞系筛选后，需要建立稳定转染细胞系的储备，以备后续实验使用。
细胞转染与筛选
细胞转染与筛选方法总结细胞转染：对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后，细胞计数，接种于六孔板，每孔种植2×105个细胞，加2ml/孔完全培养基培养过夜，弃去培养基，PBS 洗3次，加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。
将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg，混匀，室温放置10min，加入六孔板中。
六小时后，将细胞培养基换成DMEM完全培养基。
细胞筛选：转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况，48h后加入G418，其终浓度为1000μg/ml。
放入细胞培养箱继续培养，每两天换液，重新加入G418。
待正常组细胞全部死亡（约15d）将G418浓度调整至500μg/ml，继续培养2周后，长出抗性克隆，挑取单个克隆，在96孔板中扩增，培养2周后，单个克隆已经长满整个孔，将细胞消化后转入6孔板，使用完全培养基继续培养，继而进行其他指标的检测。
细胞转染操作方法转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
细胞筛选 个人整理
细胞筛选一嘌呤霉素(一)确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml 的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。
生理学复习 各正常指标 (个人整理)
生理学一、细胞的基本功能细胞内液（占体重40%）体液（60%）组织液（15%）→功能性细胞外液细胞外液血浆（5%）(占体重20%) 淋巴关节液无功能性细胞外液（占组织间液的10%；占体重1-2%）脑脊液血浆理化性质：酸碱度pH：7.35—7.45缓冲体系：HCO3-/H2CO3[HPO4]2-/H2PO4]-渗透压：渗透压为770kPa（29—310mosm/Kg.H2O）二、血液红细胞：男(4.0--5.5)×10^12/L 女（3.5—5.0）×10^12/L血液Hb：男120--160g/L 女110--150g/L血细胞白细胞：(4--10)×10^9/L中性粒细胞：0.5--0.7(50--70%)嗜酸粒细胞：0.005--0.05(0.5--5%)嗜碱粒细胞：0.00--0.001(0--1%)淋巴细胞：0.2--0.4(20--40%)单核细胞：0.03--0.08(3--8%)血小板：(100--300)×10^9/L血浆生理：血晶体渗透压：280--310mOsn/kg(280--310mmol/L)葡萄糖:3.9—６.１mmol/L高血糖的诊断标准：空腹血糖≥7.8mmol/L；餐后血糖≥11.1mmol/L。
血氯：95--105 mmol/L血钠：135--145 mmol/L血钾：3.5—5.5 mmol/L血清总蛋白（TP）：60—80g/L血清白蛋白（A）：40—55g/L血清球蛋白（G）：20—30g/L 白/球（A/G）=1.5—2.5：1血细胞生理：红细胞压积: 男0.4--0.5 女0.37--0.48红细胞平均直径: 6--9 um(平均7.2um)平均红细胞血红蛋白(ＭHＣ):２７－３４pg平均红细胞容积（ＭＣV):８０－１００ｆｌ平均红细胞血红蛋白浓度(ＭＣHC): ３２０－３６０ｇ／Ｌ（３２％－３６％）网织红细胞数: 0.005--0.015(0.5--1.5%) 网织红细胞绝对值(24-84)×10^9/L出血时间: （ＢＴ）６．９±２．１ｍｉｎ（不大于九分钟）三、血液循环系统心脏生理：（一般生理）心率→60－100次/分钟每搏排血量(SV)：60～80毫升（平均为７０ｍｌ）心排血量(CO)：男**４.２－４.８L/min 女比男性少１０％左右心脏指数(CI) ：0~3.5L/(min.㎡)射血分数(LVEF) ：５５％－６５％中心静脉压（5-12cmH2O）（电生理）静息膜电位：-90mV（I K1通道，K外流）O期去极化（-90--+30mv，钠离子内流）Ⅰ期快速复极化初期（+30—0mv，一过性钾外流）动作电位：Ⅱ期平台期（0mv左右,钾外流+钙内流）Ⅲ期快速复极化末期（0-- -90mv，钾外流）Ⅳ期静息期（-90mv左右，离子内外交换）兴奋性的周期性变化：有效不应期：（O期→Ⅲ期-60mv）绝对不应期（O期→Ⅲ期-55mv无论多大刺激无新的电活动）局部动作电位（Ⅲ期－55-- -－60mv）相对不应期（Ⅲ期－60-- －80mv，阈上刺激产生新的电活动）超常期（－80mV-- －90mV，阈刺激或阈下刺激产生新的电活动）血管生理：动脉血压正常不高于140/90mmHg，不低于90/60mmHg高血压：高血压前期120～139 或80～891 期高血压140～159 或90～992 期高血压160～179或100～1093期高血压≧180 或≧110微静脉血压15～20mmHg右心房血压最低接近于零中心静脉压(CVP)：4～12cmH2O有效滤过压＝(毛细血管压＋组织液胶渗压)－(组织液静水压＋血浆胶渗压)有效滤过压＞0，组织液生成→滤过有效滤过压＜0，组织液回流→重吸收生理学四、呼吸肺通气功能：√潮气量（ＴＣ）平静呼吸时400-600ml,一般以500ml ，运动时增大。
稳定细胞株筛选流程
稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选是一种常用的实验方法，用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
这种方法可以用于基因功能研究、药物筛选和生物制品生产等领域。
本文将介绍稳定细胞株筛选的流程。
第一步：构建表达载体稳定细胞株筛选的第一步是构建表达载体。
表达载体是一种质粒，可以将目的基因导入到细胞中。
常用的表达载体有pCDNA3.1、pEGFP-N1等。
在构建表达载体时，需要将目的基因克隆到载体中，并加入适当的启动子和选择标记。
第二步：转染细胞转染是将表达载体导入到细胞中的过程。
常用的转染方法有热激转染、电穿孔转染和化学转染等。
在转染时，需要选择适当的细胞系和转染剂，并优化转染条件，以提高转染效率。
第三步：筛选稳定细胞株转染后，需要筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
常用的筛选方法有抗生素筛选和流式细胞术筛选等。
在抗生素筛选中，将选择标记加入到表达载体中，转染后加入相应的抗生素，只有表达目的基因的细胞才能存活下来。
在流式细胞术筛选中，将目的基因与荧光蛋白等标记融合，通过流式细胞术筛选出表达目的基因的细胞。
第四步：鉴定稳定细胞株筛选出稳定细胞株后，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法有PCR、Western blot和免疫荧光等。
在PCR中，通过扩增目的基因的特定片段来鉴定细胞株是否表达目的基因。
在Western blot中，通过检测目的基因的蛋白质表达来鉴定细胞株。
在免疫荧光中，通过检测目的基因的荧光信号来鉴定细胞株。
稳定细胞株筛选是一种重要的实验方法，可以用于筛选出稳定表达目的基因的细胞株。
在筛选过程中，需要注意选择适当的表达载体、转染方法和筛选方法，并进行鉴定，以确保筛选出的细胞株稳定表达目的基因。
生理学名词解释重点个人整理。
1．神经调节通过神经系统的活动对机体功能活动进行的调节，基本方式为反射。
2．体液调节指体内的一些细胞能生成并分泌某些特殊的化学物质，后者经由体液运输，到达全身的组织细胞或某些特殊的组织细胞，通过作用于细胞上相应的受体，对这些细胞的活动进行调节。
3．Feed-forward 即前馈，控制部分在反馈信息尚未到达前，已受到纠正信息的影响，及时纠正其指令可能出现的偏差的自动控制形式。
4．Negative feedback 即负反馈，指经过反馈调节，受控部分的活动方向和它原先活动相同的方向发生改变的调节方式。
5．正反馈指经过反馈调节，受控部分活动向和它原先活动相同的方向发生改变的调节方式。
6．内环境机体的内环境就是细胞外液。
7．自身调节某些细胞、组织或器官在不依赖于神经或体液调节的情况下，其自身能够对刺激产生适应性反应。
8．Homeostasis 即稳态，机体内环境各种物理化学性质保持相对稳定的状态。
9．Facilitated diffusion 易化扩散，指某些肺脂溶性小分子物质或者某些例子借助于膜结构中的特殊蛋白质的帮助顺电-化学梯度的跨膜转运，不需要细胞代谢提供能量。
10．单纯扩散simple diffusion 脂溶性小分子物质经脂质双分子层间隙进行的一种简单物理扩散。
11．Primary active transport 原发性主动转运，指离子泵利用分解ATP产生的能量将离子逆浓度梯度和电位梯度进行跨膜转运的过程。
12．继发性主动转运secondary active transport 有些物质利用原发性主动转运建立的离子浓度梯度，在离子顺浓度梯度扩散的同时将其他物质逆浓度梯度或电位梯度进行跨膜转运，这种间接利用ATP能量的过程。
13．动作电位的全或无现象刺激强度未达到阈值，动作电位不会发生；刺激强度达到阈值后，即可出发动作电位，而且其幅度立即到达该细胞动作电位的最大值，也不会因刺激强度的继续增强而随之增大。
个人整理总结神经细胞和胚胎细胞培养操作注意事项及相关protocols
Drosophila S2 cell culture protocols陈文锋一、基本注意事项（一）无菌操作培养所需一切物品、液体应无菌。
操作前先列出所需物品，培养液须室温平衡，所有物品准备好后再操作，避免往复拿取用品。
有关数据的计算要事先做好。
（二）操作区消毒进入细胞室内换穿里面的拖鞋。
无菌培养室每周用0.2%的新洁而灭（苯扎溴铵）拖地面1次（拖布专用），紫外照射15-30min。
超净工作台使用前后需用75%乙醇擦洗，然后进行紫外灯照射15~30min进行消毒，操作时打开风机。
紫外照射期间不能放置培养细胞和培养液等。
所有进入操作区域的物品需经75%乙醇擦拭消毒。
工作台面均需经75%乙醇擦拭消毒，特别是液体溢出时，需立即擦拭。
移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%乙醇擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。
废液缸、污物盒每次做完实验马上清理倒掉。
（三）洗手和着装乳胶手套75%乙醇喷洒消毒。
白大褂定期高温高压灭菌。
（四）火焰消毒培养或其他无菌操作时，首先点燃酒精灯。
安装管帽、打开或封闭瓶口等，都需要在火焰近处。
二、细胞培养条件S2细胞培养在Schneider's Drosophila Medium + 10% FBS的培养基中+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，25℃无需要CO2培养。
五、FBS分装及灭活分装：初次买500ml血清，4℃完全融化（过夜差不多20h，时间比较长），期间间隔混匀。
无菌操作分装于50ml离心管（直接倒，但是注意不要让血清瓶和离心管接触）。
同时分装几管15ml的（15ml不好倒就用枪或移液管操作）。
（-80℃保存）再次分装：等15ml的分装血清用完。
把50ml的血清取出，4℃完全融化，期间间隔混匀。
无菌操作分装于15ml离心管。
灭活：把装有灭菌水的烧杯置于56℃水浴锅中，等水浴锅温度恒定，把装有血清的15ml离心管放于烧杯中，水位应超过血清的位置。
灭活30 min，每隔10min混匀一次。
细胞筛选 案例
细胞筛选案例全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：细胞筛选是生物学领域中一项重要的技术，通过对细胞进行筛选，可以找出具有特定功能或特性的细胞群体，从而在生物医学研究、药物研发、生物工程等领域中发挥重要作用。
在这篇文章中，我们将以一个关于细胞筛选的案例为例，介绍细胞筛选的原理、方法和在实际应用中的意义。
在这个案例中，研究人员希望筛选出一种具有抗癌活性的细胞。
为了实现这个目标，他们首先要确定使用的细胞类型，可以是肿瘤细胞株、白血病细胞、或者通过基因编辑获得特定功能的细胞。
然后，研究人员需要确定筛选的标准，例如抗癌活性、生长速率、耐药性等。
接下来，他们将利用一种或多种筛选方法来进行实验。
一种常用的细胞筛选方法是荧光激活细胞分选（FACS），通过标记感兴趣的细胞并利用激光技术将其从混合群体中筛选出来。
这种方法通常会使用荧光标记的抗体或基因来标记细胞，并利用细胞的荧光信号来对细胞进行筛选。
通过这种方法，研究人员可以快速有效地筛选出符合标准的细胞群体。
另一种常用的细胞筛选方法是细胞荧光显微镜筛选，通过观察细胞在显微镜下的荧光信号，来筛选出具有特定功能的细胞。
这种方法适用于需要观察细胞形态和功能的筛选研究，例如细胞凋亡、细胞分化等。
研究人员可以通过这种方法来筛选出具有不同生物学特性的细胞。
除了以上两种方法，还有许多其他的细胞筛选方法，如细胞质外播筛选、细胞自杀筛选、RNAi筛选等。
这些方法在研究细胞的功能和特性时发挥着重要的作用，为生物医学研究和药物研发提供了重要的技术支持。
在这个案例中，研究人员经过多次筛选实验，最终成功筛选出了一种具有抗癌活性的细胞群体。
通过进一步研究和验证，他们发现这种细胞具有高度的抗癌活性，并且在小鼠模型实验中表现出显著的抗肿瘤效果。
这个案例在细胞筛选领域取得了重要的突破，并为抗癌药物的研发和临床治疗提供了新的思路和方法。
第二篇示例：细胞筛选是一种广泛应用于生物医学领域的技术，利用生物学、生物化学和生物物理学等知识，通过对不同种类的细胞进行筛选，从而找出具有特定性质的细胞。
筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418 浓度：1、由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418 有效成分的比重不同，一般1g 的粉剂中有效的G418 含量大约为。
2、G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418 对细菌和真核细胞都起作用。
neo 就是编码3 ‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418 。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4 ，G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418 的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000 个细胞/ml ，在100ug/ml~1mg/ml 的G418 浓度范围内进行筛选，选择出在10~14 天内使细胞全部死亡的最低G418 浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x10 6个细胞电转后，分别接种1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300 细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000 孔内应有4% 的汇合度。
筛选9 天后，观察1/4000 孔内有两三个克隆，按比例1/300 孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染之后才开24 小时始加G418 筛选。
细胞整理—综合分析
1.细胞生物学：是研究细胞基本生命活动规律的科学，它从不同层次（显微、亚显微与分子水平）上研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，细胞信号转导，细胞基因表达与调控，细胞起源与进化等。
2.细胞学说：①一切动物和植物都是由细胞构成的。
②细胞是构成有机体的基本结构和功能单位。
③任何一个细胞都是从已存在的细胞分裂而来。
3.细胞的基本共性：①具有生物膜结构。
②具有DNA和RNA两种核酸。
③具有蛋白质合成的机器——核糖体。
④以一分为二的方式进行分裂。
4.细胞的3大基本结构和功能体系：①以脂质和蛋白质成分为基础的生物膜系统，其主要功能是使细胞功能区域化。
②以核酸和蛋白质为主要成分的细胞核系统，其主要功能是控制遗传信息的表达。
③由特异的蛋白质分子构成的细胞骨架系统，其主要功能是支持细胞的有形结构，为细胞提供运输轨道。
5.原核细胞与真核细胞的比较：根本区别：①真核细胞出现了核被膜，从而把胞质与核质分开，使遗传物质及其复制与转录过程局限在一个独立区域与微环境中。
而蛋白质合成、能量代谢与供应，以及其他一系列代谢过程均在细胞质内进行。
原核细胞的DNA 分子主要盘绕在核区或均匀分布在细胞质中，没有核膜包围。
②真核细胞细胞质内以膜系统为基础进一步分化出结构与功能更专一的各种细胞器，如内质网、高尔基体、溶酶体、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等。
而原核细胞的细胞膜通过内陷折叠，与各种酶或色素结合，以完成多种功能，故原核细胞的细胞膜具有多功能性。
③真核细胞具有精细的网络状的骨架系统，包括微管、微丝和中间纤维。
④遗传信息量的扩增、遗传装置和基因表达的复杂化是真核细胞不同于原核细胞的重要标志之一。
由原核细胞的单倍性变为多倍性，DNA由游离的裸露的环状分子转变为与多种组蛋白结合的线状分子，以核小体为基本单位螺旋盘绕形成高度复杂的染色质与染色体。
原核细胞的转录与翻译可同时进行，而真核细胞基因表达严格划分为细胞核内转录与细胞质翻译两个过程，而且基因表达的调节更具复杂性和多层次性。
说明细胞株筛选的方法
说明细胞株筛选的方法一、引言细胞株筛选是生物学研究中非常重要的一步，它能够帮助科学家挑选出具有特定性质的细胞株，从而为后续的实验和研究提供基础。
本文将详细介绍如何进行细胞株筛选。
二、前期准备1. 筛选目标：在进行细胞株筛选之前，我们需要明确自己的筛选目标，例如：对某种疾病进行治疗的新型药物需要寻找具有抗体生成能力的B细胞株。
2. 培养基选择：不同类型的细胞需要不同种类的培养基来生长，因此在进行筛选之前需要先确定所需培养基，并准备好相应试剂。
3. 细胞来源：在进行筛选之前需要明确所需细胞来源，并从相应组织中获得原始样本。
三、细胞株分离1. 组织处理：将获得的原始样本用无菌PBS缓冲液洗涤去除杂质和红血球等成分。
2. 组织消化：将组织切碎并加入适量酶，如胰蛋白酶、胶原酶等，进行消化。
消化时间和温度需根据不同的组织类型进行调整。
3. 细胞分离：将消化后的组织过筛或用离心机分离出单个细胞。
四、细胞株培养1. 细胞传代：将刚分离出的细胞进行传代，即将一定数量的细胞移至新的培养皿中，并加入新鲜培养基。
2. 细胞生长：放置于恒温培养箱中，控制好温度、湿度等条件，让细胞自行生长。
注意定期更换培养基。
3. 细胞观察：观察细胞形态、数量和健康状态，判断是否需要更换或添加培养基。
五、筛选方法1. 抗体检测法：对于需要寻找具有抗体生成能力的B细胞株，可以采用抗体检测法。
将患者血清或目标蛋白加入到已经固定在96孔板上的靶抗原中，并加入待测B细胞株。
通过检测B细胞产生的抗体水平来筛选出具有较高抗体水平的细胞株。
2. 细胞增殖法：对于需要寻找能够快速生长的细胞株，可以采用细胞增殖法。
将不同的细胞株分别接种到96孔板中，每隔一定时间检测细胞数量变化，筛选出生长速度快、数量多的细胞株。
3. 药物筛选法：对于需要寻找对某种药物敏感的细胞株，可以采用药物筛选法。
将不同的细胞株分别接种到含有不同浓度药物的培养基中，观察其生长情况并计算IC50值，筛选出对该药物敏感的细胞株。
单克隆细胞株筛选实验心得
单克隆细胞株筛选实验心得
单克隆细胞株筛选实验是一项技术要求高、步骤繁琐的实验，
需要严谨的操作和耐心的观察。
以下是我进行单克隆细胞株筛选实
验的一些心得体会：
1.实验前要充分了解实验原理和步骤，熟悉各种试剂和仪器的
使用方法。
只有掌握了基本原理和操作技巧，才能更好地进行实验。
2.实验前要做好充分的准备工作，包括试剂的配制、仪器的校
准和细胞的传代等。
这些看似简单的步骤，却是实验成功的关键。
3.在进行单克隆细胞株筛选实验时，要保证实验条件的恒定，
避免污染和交叉污染。
同时，要保证细胞的生长状态良好，避免细
胞的变异和死亡。
4.在进行细胞筛选时，要选择合适的筛选方法，如有限稀释法、流式细胞术等。
这些方法的选择要根据具体情况而定，需要综合考
虑细胞的特性和实验的目的。
5.在实验过程中，要仔细观察细胞的生长状态和形态特征，及
时发现异常情况并进行处理。
同时，要做好实验记录，包括细胞生
长曲线、试剂使用情况等，以便后续的数据分析和总结。
6.实验结束后，要及时清洗仪器和整理实验室，保持实验室的
整洁和卫生。
同时，要做好数据的整理和分析工作，总结实验结果
并撰写实验报告。
总之，单克隆细胞株筛选实验需要严谨的操作和耐心的观察。
只有掌握了基本原理和操作技巧，才能更好地进行实验。
同时，要
注意实验安全和环境保护，避免意外事故的发生。
1 / 1。
杂种细胞的筛选和鉴定.doc
杂种细胞的筛选和鉴定利用细胞融合技术可以按照人们的意愿创造新品种和提取有用的细胞代谢产物。
由于细胞间的融合率相对较低，而且不一定能得到我们预期的融合细胞，因此在实际操作中，常常用大量的细胞进行融合，一方面能够产生大量的融合细胞，可以从中分离出我们所需要的杂种细胞，从而提高实验的成功率，另一方面细胞间的融合是随机的，融合细胞的类型很多，杂种细胞的筛选和鉴定是操作流程中十分重要的环节。
2003年上海高考生物卷第36题，以杂交瘤细胞的筛选和杂种细胞染色体缺失为情境，考查学生对融合细胞的类型、杂种细胞筛选的原理、基因与酶的关系等方面的理解和应用。
现行多个版本的《现代生物科技专题》教科书中，对杂种细胞的筛选和鉴定这一环节都作了隐性化处理，如何处理教材的隐性化与考试的显性化这一矛盾，是目前许多教师思考的问题。
本文通过杂种细胞的筛选和鉴定方法的介绍，提出相关的教学建议。
1 杂种细胞的筛选方法两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如没有发生融合的亲本细胞、同核体（同源原生质体的融合体）、异核体（非同源的原生质体的融合体）、多核体（含有双亲不同比例核物质的融合体）等。
1.1利用物理特性筛选法根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异等特性来筛选杂种细胞。
如亲本1用异硫氰酸荧光素（绿色）标记，亲本2用碱性蕊香红荧光素（红色）标记，在荧光显微镜下，就可以找到杂种细胞。
这种方法的缺点物理特性常常难以满足、分离工作量大、挑选出来极少数细胞不容易增殖等。
1.2 营养缺陷互补筛选法亲本双方都有营养缺陷的情况下，只有杂种细胞能在特定的条件下生存，如亲本1是叶绿体缺陷型，亲本2是光致死型，亲本1的细胞和同核体在培养时呈白色，亲本2的细胞和其同核体在光照死亡，只有杂种细胞能培养成绿色植株。
1.3 选择培养基筛选法利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞，如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其杂种细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加入植物激素，因此使用无植物激素的培养基，可以达到筛选目的。
筛选细胞的方法是
筛选细胞的方法是
筛选细胞的方法包括：
1. 细胞培养：通过细胞培养技术，可以从细胞混合物中分离出特定的细胞，例如在培养基中特定的细胞会黏附并生长形成单一层膜。
2. 流式细胞术（FACS）：利用流式细胞术，可以通过细胞的物理性质和标记特定分子分离出不同类型的细胞。
3. 磁珠分离技术：利用特定的抗体或者其他分子与细胞表面的分子结合，再通过磁或磁场将该类型的细胞分离出来。
4. 排序：将细胞根据某些特征进行分离和筛选，例如根据细胞大小、形态、颜色等特征进行筛选。
5. PCR 扩增技术：利用特定的引物扩增目标细胞的DNA或RNA分子，从而筛选出特定类型的细胞。
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)一、消化与吹打版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。
这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。
许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。
其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。
一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论：1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。
对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。
简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。
2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。
一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。
这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。
细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。
高二生物选自我检查与总结归纳
高二生物选自我检查与总结归纳
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基因工程基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，
赋予生物以新的遗传特性，创造出
更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DN
A分子水平
上进行设计和施工的，又叫做DNA
重组技术。
(一)基因工程的基本工具
1.分子手术刀限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从
原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中
特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和
平末端。
2.分子缝合针DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶
容，希望对大家有所帮助!。
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细胞筛选
一嘌呤霉素
(一)确定最优筛选浓度
当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）
2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血
清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。
3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后
向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）
4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基
溶液替换各孔中的旧的培养基。
（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。
（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
）
5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无
抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一
般生存时间而定，大概需3到14天。
在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞
死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死
所有细胞的浓度。
(二)转染细胞
1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到
70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的
旧的培养基，加入含病毒培养基。
（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，
有时候Polybrene对细胞有毒性。
这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）
(三)筛选细胞
1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。
2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，
24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。
最好设立一个对照皿，不加病
毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有
毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。
3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细
胞的培养基。
直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。
4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm
平皿内。
5.60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。
6.10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基
因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。
通常情况下，由于慢病毒
为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养
研究。
二G418
(一)确定最优筛选浓度
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
1.G418的配制：取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml（使
G418终浓度为0.1g/ml,HEPES终浓度为100mmol/L），过滤消毒，4度保存。
HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid），分子量238.31，是一
种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对细胞无毒
性作用。
1mol/LHEPES的简单配置：HEPES23．83g，溶解于80ml的双蒸水中，用10mol/L的NaOH调节pH至7.2-7.4，定容至100ml，0.22um小滤器过滤。
HEPES
使用终浓度为10-50mmol/L。
2.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内按0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、
300ug/ml、400ug/ml，500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml浓度用无抗无血清培养基稀释G418制成筛选培养基。
心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
3.培养待转染（而不是转染后）的细胞。
（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）
4.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血
清的培养基制成1×104个/ml的细胞悬液。
5.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1×103个），然后向
每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养。
（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。
）
汇合度：实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。
汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！
6.培养6小时左右开始加药。
加筛选培养基筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一
次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基适量。
7.换液：每日检查细胞活力，根据细胞活力和培养基的颜色，每三天(即每隔两天)
更换筛选培养基一次。
如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。
有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响。
8.确定最佳筛选浓度：在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间
随细胞的生长率和一般生存时间而定，在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最
小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用
某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量
在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第
5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步
筛选，以确定最佳筛选浓度。
(二)转染细胞
1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到
70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。
2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene，终浓度为8μg/ml。
将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的
旧的培养基，加入含病毒培养基。
（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，
有时候Polybrene对细胞有毒性。
这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）
3.转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近70％汇合时按1：4密度传代，继
续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时开始筛选。
(三)筛选细胞
1.加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养
基（无抗无血清）(实际应用时可以比最佳筛选浓度高一级别)。
2.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
当有大
量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养基培养。
3.待其逐渐增大后，挑出单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1
个/10ul。
在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。
待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
4.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。
典型贴壁细胞平板密度。