代谢控制育种

（一）解除碳源调节突变株的选育
在次级代谢中，高浓度的葡萄糖对青霉素转 酰酶、链霉素转咪基酶和放线菌色素合成酶等 抗生素的关键酶均有分解阻遏作用。
在实际生产中，采用流加葡萄糖或应用混合 碳源可以控制中间代谢产物的积累，来减少不 利影响。
根本的解决办法是筛选抗碳源分解调节突变 株。
（一）解除碳源调节突变株的选育
（一）在初级代谢调节育种的应用
1. 阻断代谢流或切断支路代谢，使代谢途 径朝着有益产物合成方向进行。
2. 还可以通过营养缺陷型解除协同反馈效 应，降低终产物的数量，以累积支路代 谢中某一末端产物。
1、在直线式生物合成途径中
谷氨酸
N-乙酰谷氨酸
N-乙酰-γ-谷氨酸磷酸
底物采用苯- β-半乳糖
二、抗分解调节突变株的选育
抗分解调节突变株：指抗分解阻遏和分解抑 制的突变 （一）解除碳源调节突变株的选育 （二）解除氮源分解调节突变株的选育 （三）解除磷酸盐调节突变株的选育
选育有关抗分解调节的突变株，其实就 是筛选合成酶产生不受碳、氮、磷的代谢阻 遏或抑制的突变株，使抗生素提前到菌体生 长期开始合成，从ห้องสมุดไป่ตู้延长了产抗期而提高产 量。
CHO HH HO H H OH H OH
CHO H OHO H3C-O H H OH H OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
葡萄糖 2-脱氧－葡萄糖 3－O－甲基－ 葡萄糖
特 性： 1、结构与葡萄糖类似。
2、不被微生物代谢， 也不阻抑微 生物生长。
3、和葡萄糖 一样 会阻遏诱导酶的 合成，其 阻遏作用 甚至比葡萄糖还 要强。
筛选芽孢杆菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶 产量的一种有效方法。因为高浓度氨基酸会抑 制芽孢的形成，并且阻遏蛋白酶的合成。
氨基酸1.5mg/ml
水解蛋白10mg/ml
（三）磷酸盐对次级代谢的调节
机制
1.通过初级代谢的变化影响次级代谢 加强初级代谢，推迟抗生素合成的起
始。 磷酸盐是许多初级代谢反应酶的 效应物。
调节体系
诱导 分解阻遏 分解抑制 反馈阻遏 反馈抑制
细胞膜渗透性
育种措施
1组成型突变株的选育 2抗分解调节突变株的选育
解除碳、氮、磷源分解调节突变株
营养缺陷突变株 渗漏缺陷突变株 回复突变株 耐自身代谢产物突变株 抗终产物结构类似物 耐前体物突变株 条件突变株
营养缺陷突变株 生物素、油酸、甘油缺陷型 温敏突变株
2.改变糖类分解代谢途径： 磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊
糖途径的活力，导致以戊糖途径为先导 的抗生素合成受抑制。
例如：四环素、金霉素、土霉素、竹桃 霉素
3.限制抗生素合成的诱导物 甲硫氨酸是头孢霉素和磷霉素的诱导物
色氨酸是麦角碱的诱导物，而磷酸盐是色氨酸 合成酶等的抑制剂；
4.抑制或阻遏磷酸酯酶类的合成 链霉素、紫霉素、新霉素等生物合成中某些
中间代谢产物需经磷酸化，因此从中间产物到 终产物需由磷酸酯酶类， 而磷酸盐抑制或阻遏 磷酸酯酶的合成。
例如磷酸盐明显抑制链霉素的生物合成通过抑 制形成链霉胍的三步 磷酸盐分解反应。
磷酸盐对ATP调节：cAMP ATP
例如：灰色链霉菌静息细胞研究磷酸盐 对杀假丝菌素合成的影响。当加入 10mol//L磷酸盐后，5minATP增加5倍， 15min抗生素合成受抑制。
抗性突变株的性质
在2-dG或3-mG平板上生长的菌落接入斜面， 对它们在含阻遏物和不含阻遏物培养基中的产 酶能力比较，结果表明，大部分变株是抗分解 阻遏突变型，并发现它们在去除阻遏物的培养 基中酶活力往往高于野生型菌株。
含葡萄糖
不含 葡萄糖
含淀粉
（二）解除氮源分解调节突变株的 选育
次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他 快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调 节作用。
发酵中磷酸盐浓度控制在亚适量水平。
解除（抗）磷酸盐调节突变株的选育
灰色链霉菌
诱变后涂布于琼脂平 板
含10mol/LNa3PO4
脱敏感 突变
不含Na3PO4
底部加浸润250mm/L 磷酸盐的滤纸
敏感菌
三、营养缺陷型在代谢调节育种中 的应用
生物遗传学上：阐述代谢途径
工业微生物代谢控制育种上：筛选 到解除反馈的菌株。
向菌落上喷射 O-硝基苯酚β-D-半乳糖苷
组成型 突变株
诱导型
诱变后的 以甘油为唯一碳源 孢子 原理 ： 组成型菌株在没有诱导物的作用下
仍能合成 β－半乳糖苷酶，将无色试剂水解 ， 放出 O－硝基苯酚。
4、筛选
将处理后的菌体移接到含有诱导能力 低，但能作为良好碳源的诱导物的培养 基中培养，突变体能良好生长，野生型 不能生长。 例：β-半乳糖苷酶组成突变株的筛选
筛选方法：
诱变 后的 菌株
培养基含有氮源、无机盐、生 长因子、低浓度的2－dG或3－ mG及一种生长碳源 ，该碳源
需诱导酶才能利用
涂布
验证
比不 较含
含阻遏物
阻
遏
物
例如： 桔林油脂酵母合成淀粉酶：玉米淀粉 、 酵母膏、蛋白胨及含有0.01%2dG的琼脂平板。
木霉合成 纤维素酶：含酸膨胀纤维素 、蛋白 胨、无机盐、胆汁 、防菌扩展剂、2-dG的琼 脂平板。
筛选方法
1、限量诱导物法
诱变 恒化器
低乳糖浓 度
突变株不需诱导物也能合成 β- 半乳糖 苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为 能源和代谢原料，而迅速生长。
野生型菌株因缺少诱导物和相应的诱导 酶，不能利用乳糖而淘汰。
2、循环培养法
诱变
含诱导物
含诱导物
不含诱
不含诱
导物
导物
3、鉴别性培养基的应用
涂布
筛选方法： 1、循环培养法
葡萄糖
乳糖
O-硝基苯
酚-β-D-半
突变株 野生株
乳糖苷
2、鉴别培养基 有半乳糖酶
喷ONPG，抗分解阻遏的菌落呈黄色，野
生 型是白色。
3、特殊氮源
组氨酸酶突变株
葡萄糖+组氨酸
分解代谢抑制物+唯一必须被分解的氮源
4、葡萄糖结构类似物
CHO H OH HO H H OH H OH
一、组成型突变株的选育
组成型突变株是指操纵基因或调节基因 突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经 诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调 节突变型。
这两种突变株在工业上都可能得到应用， 特别是在微生物酶制剂工业上。
Regulatory gene
repressor NO operator
operator NO repressor