十二叶绿素的定量测定分光光度法

实验二十叶绿素含量的测定

叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。

方法Ⅰ

一、目的

掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。

二、原理

叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。

2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。

3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。

四、实验步骤

1. 叶绿素的提取

称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml 容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。

2. 测定

取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。

五、计算

将测得的吸光度A652值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·g－1Fw）。

A652

C ( mg .ml－1 ) = ———— (1)

34.5

公式中：C —叶绿素（a 和b ）的总浓度( mg ·ml－1 )

A652—表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度

34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光径为1cm, 样

品浓度为1g·L－1时的吸光度）。

C（mg.ml－1）×提取液总量（ml）叶绿素含量（mg .g－1Fw）= ———————————————— (2)

样品鲜重（g）

方法Ⅱ

一、目的

掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。

二、原理

叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a.、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：

A663 = 82.04 C a + 9.27C b……………………( 1 )

A645 = 16.75 C a + 45.6C b……………………( 2 )

（1）、（2）式中的A663. A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。

C a、、C b为叶绿素a 、b的浓度，单位为mg·L－1。

82.04 、9.27为叶绿素a 、b在波长663nm下的比吸收系数。

16.75 、45.6为叶绿素a 、b在波长645nm下的比吸收系数。

解（1）、(2 )式联立方程，得：

C a=12.70 A663– 2.69 A645……………………( 3 )

C b=22.9 A645– 4.68 A663……………………( 4 )

C T =C a + C b= 20.21 A645 + 8.02A663……………………( 5 )

C a、C b为叶绿素a 、b的浓度, C T为总叶绿素浓度，单位：（mg ·L－1），.利用上面( 3 )、（4）、（5）式可以分别计算出叶绿素a 、b及总叶绿素浓度。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：菠菜叶、芥菜叶或其他植物叶片

2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管；

试管架；玻棒等。

3. 试剂：80﹪乙醇。

四、实验步骤

1. 叶绿素的提取

从植株上选取有代表性的叶片数张（除去粗大叶脉）剪碎后混匀，快速称取0.2g (可视样品叶绿素含量高低而增减用量)，置于25ml刻度试管中，加80﹪乙醇10ml左右，加塞放入60～80℃水浴中保温提取叶绿素（或常温下放在暗处浸提12～24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，用80﹪乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。

2. 测定

取光径为1cm的比色杯，加入叶绿素提取液距比色杯口1cm处，以80﹪乙醇作为对照，分别于663nm及645nm波长下测定吸光度（A）值。

五、结果计算

将测定得到的吸光度A663、A645值分别代入上面( 3 )、( 4 )、（5 ）式计算出C a 、C b及C T (即叶绿素a 、b 及叶绿素总量浓度)。再按下式计算出叶绿素a 、b及叶绿素总含量。

C a×提取液总量(ml)

叶绿素a 含量（mg ·g－1Fw）= —————————————

样品鲜重（g）×1000

C b×提取液总量(ml)

叶绿素b 含量（mg ·g－1Fw）= ————————————－

样品鲜重（g）×1000

C T×提取液总量(ml)

叶绿素总含量（mg ·g－1 Fw）= ————————————－

样品鲜重（g）×1000

最后计算出叶绿素a / 叶绿素b的比值，并加以分析。

一、原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L 成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏