植物原生质体融合方法的研究进展
植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
植物原生质体的融合技术探析-教学范文
[标签:标题]植物原生质体的融合技术探析本文关键词：质体，探析，融合，植物，技术植物原生质体的融合技术探析本文简介：原生质体是组成细胞的一个形态结构单位,原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的主要材料。
1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体,Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液,在一定条件下培养植物原生质体的融合技术探析本文内容：原生质体是组成细胞的一个形态结构单位, 原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”, 是开展基础研究的主要材料。
1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体, Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液, 在一定条件下培养一段时间后, 发现大部分细胞的细胞壁被降解, 从而制备出大量有活力的原生质体。
1、原生质体融合的目的及意义原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力, 使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合, 进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞, 克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。
另外, 可转移优良的生物性状, 实现基因重组, 而改良现有品种。
目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等, 还可按照人们预先的期望创造出新物种。
2、原生质体的融合方法2.1、自发融合在酶解细胞壁形成原生质体的过程中, 相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体(homokaryon) 。
每个同核体内可包含两个或多个核, 这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。
多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。
如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中, 大约有50%是多核融合体。
植物细胞工程理论5
第五章原生质体的培养教学目标(1)了解原生质体培养的意义；(2)掌握原生质体分离的大致步骤；(3)掌握原生质体培养的方法；(4)掌握原生质体融合的方法。
一、原生质体培养的意义1、原生质体(protoplast)原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，是能存活的植物细胞的最小单位。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。
它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
2、原生质体研究进展植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就：1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。
1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。
直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。
1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。
1986年，Spangenberg .单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。
此外原生质体融合，体细胞杂交的技术得到广泛的应用。
据统计目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。
其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。
3、原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生成植株，不论在进行细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组培实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个小时。
难栽培食用菌原生质体融合技术研究进展
Ｚ ＯＵ ｉ ．Ｍ ＥＮＧ ｅ ． ｈ ｏ ｐ ｎ ｘ Ｌ’ Ｘｕ ＬＩ Ｓ ａ － ｅ ｇ ・ 。
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・ 收 稿 日期 ： ０ ５ １ — ３ ２０— ０ １ 基金项 目： 哈尔滨市科技攻关项 目 （ｏ ２ ２ ０ ＡＱ） ０ ） ｃ ８ Ｊ
１ 原 生质 体 的制备
１５ 年 Ｅ ｒｏ ｄ等 人用 蜗牛酶 和半纤 维素 酶 ９７ ｍｅｓｎ
得 到 了丝 状真 菌的 原 生质 体 ， 而 奠 定 了真 菌 原 生 从
园艺植物原生质体融合技术研究进展
1 引言原生质体融合（protoplast fusion）亦称细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic hybridization）、超性杂交（Para sexual hybridization）或超性融合（Para sexual fusion ），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。
植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。
原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。
原生质体融合还可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限。
原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。
经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。
1953年we bull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株，1972年Carlson等以烟草获得了体细胞杂种[4] ，1974年高国楠发现聚乙二醇（PEG）在钙离子存在的条件下能促使植物细胞原生质体融合，1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株，1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。
随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
利用原生质体融合技术转移作物CMS性状的研究进展
该技 术培育无核或少核柑橘 新品种进 行 了展望。 ［ 关键词］ 原生质体融合 ； 质杂种 ； 质雄 性不育； 胞 胞 核质 互作
制 的农 艺性状 方 面有 明显 优势 。此 外 ， 生质 体 融合技 术 相对 于转基 因技术 而 言 ， 原 所创 造 出 的体细胞 杂种 或胞 质杂 种不 存在 可能 的 生物 安全 方 面的 问题 ， 以更 快 地得 到应 用［ 。在 利 用 原 生 质 体 融合 技 术定 向 可 ４ ］ 转移 细胞器 控 制 的农 艺 性状 中 ， 由线 粒体 基 因组 控制 的 Ｃ ＭＳ性 状 的 转 移是 研 究 和 报道 最 多 。基 于此 ， 笔 者对其 近年来 的研究 及应 用 进展作 一简要 的综 述 ， 对 其在 无籽 柑橘 育种 中 的应 用 进行 了展 望 。 并
术 可 以实 现 胞 质 基 因 组 的 重 组 ， 生新 的 核 质 互 作 。 因 此 ， 用 原 生 质 体 融 合 技 术 能 够 创 造 拥 有 潜 在 农 艺 产 利
性状 的新 Ｃ ＭＳ种质 资源。从胞质杂种 的产 生方 式、 生质体 融合转 移 Ｃ 原 ＭＳ性状 的研 究现状 及 Ｃ ＭＳ性状
［ 图分类号］ ８ 中 Ｑ７ ［ 献标识码］ 文 Ａ ［ 文章 编 号 ］ ６ ３ ４ ９ ２ ０ ） ４ ０ ６一 ５ １ ７ —１ ０ （０ ７ ０ 一Ｓ ８ Ｏ
细胞 核外 遗传 系统 包括 线 粒体 基 因组 和叶绿 体基 因组 ， 它们 控 制 着 植 物 许 多 重要 的农 艺 性 状 。细胞
到有籽的栽培品种中 ， 为无籽柑橘育种提供了一种新方法［ ］ ２ 。人们 已经确认 Ｃ 。 ＭＳ为母性 遗传 ， 因此通 过传统 的有 性杂 交方 法转 移 Ｃ Ｍｓ性 状往 往需要 进 行 多次 回交 。原 生 质体 融 合 技 术 自 ７ 代 创立 以来 ， ０年 已经创 造 了一大 批种 内、 问 、 间甚 至科 间体 细胞 杂种 或胞 质杂 种 ［ 。多年 的研 究 表 明 原 生质 体融 合 种 属 ４ ］
植物体细胞杂交
电融合法
电融合法是在20世纪80年代初由Zimerman等创造并发展起 来一种物理融合方法。由于电融合较之化学融合有操作简便、快 速、同步性好、可以大量试验、无毒害作用等特点，己经被大量 使用。20世纪90年代国内外还同时开展了空间电融合技术的研 究，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。但是，利用电 融合需要时间确定材料的最适融合条件，更主要的是电融合需要 昂贵的设备。2005年Olivaresruster等将电融合法与PEU融合法 结合起来作为一种新的方法一电气化学法，并使用此法成功得到 柑橘的体细胞杂种，且得到再生植株。同时表明电气化学融合是 一个可靠、可重复的方法，还能促进融合细胞的分裂，提高胚胎 发生率。
植物体细胞杂交的优势
植物有性杂交仅限于种内或是一些亲缘关系相近的 野生种与栽培种之间。像香蕉、甘薯、马铃薯等这些 植物有性生殖能力很低或不具备，便很难通过有性杂 交的方式来改良与培育新品种，严重限制了育种工作 的发展。而植物体细胞杂交技术不需要经过有性过程 ，只需通过体细胞的融合来制造杂种，这便打破了物 种间的生殖隔离，同时也克服了植物花期不遇与有性 杂交不亲和的状态，更为扩大遗传变异、更新种质资 源和改良作物品质开创了一条有效的途径。植物体细 胞杂交技术的出现与发展扩大了物种杂交的范围，提 高了育种效果，还可以缩短育种年限。
植物体细胞杂交技术
植物原生质体的分离方法有机械法和酶解法2种， 机械法是切割或磨碎质壁分离的细胞从而释放出原生 质体的方法，一般适用于像洋葱的鳞片、黄瓜的中皮层、 甜菜的根等具有较大的、高度液泡化的细胞。酶解法是 利用细胞壁降解酶分解植物细胞壁从而获得原生质体 的方法。当酶解法有副作用时，可以考虑使用机械法， 机械法可以避免酶制剂对原生质体的破坏作用曰。但 目前机械法基本被摒弃不用而通用酶解法。酶解法可 以有效分离出大量的植物原生质体，并且适用于几乎所 有的植物。但是酶制剂中往往含有一些核酸酶、蛋白 酶、过氧化物酶以及酚类物质，所以使用酶解法会对所 得原生质体的活力有一定影响。因此，使用酶解法分离 植物原生质体要注意根据不同植物种类、不同器官的不 同细胞壁结构与成分选择合适的酶类和酶浓度 。
植物组织培养技术及应用进展
植物组织培养技术及应用进展摘要：当前，植物组织培养技术得到了快速发展。
本文系统介绍了植物组织培养的含义，以及植物组织培养技术应用于植物育种、应用于植物脱毒和快速繁殖、应用于植物有用产物生产、应用于植物种质资源保存和交换、应用于遗传、生理、生化和病理研究。
植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将为社会创造更大的价值和效益。
关键词：植物组织；培养技术；应用；进展1、引言当前，植物组织培养技术得到了快速发展。
人们可以利用植物的组织培养技术，生产优良无性系，为人们生产需要的多种代谢物质，单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。
这样细胞融合就打破种属间的界限，促进植物新品种的培育和种性的改良。
组织培养的植物细胞能够在细胞水平上研究的理想材料，加速植物快繁、花药培养、细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术。
因此，植物组织培养技术可以在各个植物科学的领域及农业、医药等多种行业。
这样就为社会创造了巨大的经济效益和社会效益。
2、植物组织培养技术的含义3、植物组织培养技术的应用现状3.1应用于植物育种当前，我国将植物组织培养应用于作物育种，特别是在：第一，单倍体育种。
单倍体育种的优点是高速、高效率、基因型一次纯合。
因此，通过花药或花粉培养的单倍体育种，而成为一种最新的育种手段，育成大面积种植的作物新品种。
我国在单倍体育种方面取得了重大成果。
我国育成了作物新品种—单育1号烟草品种，以及中花8号水稻和京花1号、京单92-2097小麦等面积栽培的作物新品种。
第二，胚胎培养。
植物的杂交不孕使远缘杂交不容易成功。
但是，采用胚的早期离体培养能够使胚正常发育和培养出杂交后代，以无性系繁殖获得数量较多、性状一致的群体，胚培养已在多个科属中成功。
这种技术就是把未受精的胚珠分离出来，在试管内用异种花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚在试管中发育成完整植株。
用胚乳培养可以获得三倍体植株，三倍体加倍后可得到六倍体，可育成多倍体新品种。
植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展_李杰
仲恺农业技术学院学报,16(4):64～71,2003Jour nal of Zhongkai Agr otechnical College文章编号:1006-0774(2003)04-0064-08收稿日期:2003-04-23基金项目:国家“863”高技术研究计划(2001A A244011)资助项目.作者简介:李 杰(1974-),男,四川巴中人,在读博士生.＊通信作者.植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展李 杰1,2,黄敏仁1＊,王明庥1,蔡 汝2(1.南京林业大学林木遗传和基因工程国家林业局重点实验室,江苏南京210037;2.江苏省兰花工程研究中心,江苏泰州225321)摘要:自20世纪70年代以来,植物原生质体培养和体细胞融合操作技术不断趋于精密化、微量化、高效化与多样化.文章侧重于实验操作技术和当前研究热点,对植物原生质体培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行了综述,并对其在理论和实践上的应用前景及未来发展趋势进行了展望.关键词:植物;原生质体培养;体细胞融合;研究进展中图分类号:S682.31 文献标识码:A 植物原生质体培养和体细胞融合技术作为细胞工程技术的重要分支,一直是20世纪70年代以来的研究热点.30多年来,随着一系列关键性实验方法的发展和技术难关的逐步突破,原生质体培养和体细胞融合技术己广泛应用于生物科学众多领域的研究,尤其是在通过这样的实验体系进行植物品种改良和创造远源杂种方面取得了可喜的进展.近年来有关该领域的研究综述颇多,但大多是针对某一具体植物研究结果的总结,而针对更具普遍指导意义的操作技术评述较少.结合国内外有关文献,侧重于实验操作技术,作者对植物原生质体培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行综述,以期为相关领域的研究提供参考.1 植物原生质体的培养据许智宏等[1]介绍,自从1971年Nagata 和Takebe 首次利用烟草叶片分离原生质体,并培养获得再生植株以来,迄今至少已有46个科160多个属的360多种植物(含变种和亚种)的原生质体再生植株问世.1.1 植物原生质体的游离原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重要环节.目前,游离植物原生质体的常规方法是酶解法.用酶解法游离原生质体时,首先要考虑植物材料的正确选择.一般情况下,当植物处于最佳生长状态时取材,分离的效果最为理想.如茄科植物一般选取生长旺盛、生理状态一致的试管苗上部叶片[2],而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材料[3].一个处于指数期快速生长的细胞培养体系,如愈伤组织或悬浮培养物,最适宜作为游离原生质体的材料.其次,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度.目前市场上出现了许多游离原生质体的酶制品,但各种酶的性质、活性、纯度及作用有很大的差别,选用时应根据植物材料和酶制品的特性进行综合考虑.此外,还必须控制好酶解条件.影响酶解过程的主要因素有温度、pH 值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等.一般情况下,酶解温度为25～30℃,酶解液的pH 值根据所用酶种类的不同可以在5.4～6.2之间变动,渗压剂的使用浓度,一般控制在0.45～0.8mmol /L 范围内.酶解前对材料进行轻微的质壁分离,酶解时低速振荡(40r /min )以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl 2和MgCl 2)等能提高原生质体的产量和质量.原生质体成功游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法.漂浮法在洗涤纯化过程中对原生质体的损伤较小,但对离心力要求严格,不易掌握,沉降界面法易造成原生质体损伤,但操作简单.具体选择方法则依实验条件而定.1.2 原生质体的培养在培养方式上,植物原生质体培养常采用固体包埋培养、液体培养、固液双层培养以及在此基础上发展起来的一些其它培养方式.固体包埋培养能提高培养初期原生质体的成活率,利于定点观察,但不利于通气和培养后期代谢物的排出.相比而言,多数实验者喜欢采用液体浅层培养法.这种方法的优点是培养物与空气接触面大,易于通气,添加更换培养基和转移操作方便,细胞悬浮培养中产生的有害代谢产物易于扩散,但不利于定点观察,易造成原生质体局部密度过高或过低.在固液双层培养法中,Shillito 等[4]建立的念珠培养法是比较好的一种方法,它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放在液体培养基中进行振荡培养.用这种方法,明显提高了矮牵牛(Petunia hybridia )、番茄(Lyc opersicum escule ntum )、芜菁(Brassica rapa )等原生质体培养的植板率[4].在上述培养方式中,均可以加入未去壁但失去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养(nurse culture ),能明显提高培养效果.Mit -sugu 等[5]用这样的方法,极大提高了百合(Lilium L .)原生质体培养初期的成活率. 在培养基的选择上,两种最常用的培养基为8P 和NT ,它们分别是由B5和MS 培养基改良而形成的.在这些基本培养基的基础上,针对不同植物材料和不同的培养阶段可以进行适当修改.大量元素中Mg 2+、Ca 2+浓度变化最多,铵态氮和硝态氮的比例及用量,不同实验也不尽相同.对碳源的要求一般不专一,多数采用蔗糖,或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为碳源营养.在激素使用上,一般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正常分裂和生长.最常用的外源生长素是2,4-D ,但对细胞分裂素的需求,各种文献报道不一致.原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变.如烟草(Nicotiana tabacum )原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消除后,会迅速生长并随之发生植株再生[6].此外,还发现一些其它化合物对原生质体的生长和分裂有一定影响.如鸟氨酸和丁二胺对木本植物的叶组织原生质体分裂和细胞团形成有利,亚精胺-精胺类多胺物质则对禾谷类植物的原生质体分裂有促进作用[6].在培养密度和条件上,根据物种和材料来源的65第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 不同,一般可在3×103～1×105个/ml 原生质体之间变动,培养初期往往要求黑暗或弱光条件,对大部分植物种来说,25℃的培养温度,pH 5.5～5.7的范围是合适的.1.3 原生质体的植株再生原生质体的植株再生途径通常有3条:①经细胞团发育形成愈伤组织,再分化成芽长成植株;②直接形成胚状体,再发育成植株;③先形成愈伤组织,再由愈伤组织分化形成胚状体,最后发育成植株.分化和再生所需培养基的营养成分一般与同种植物正常离体组织培养的要求相似,但其分化和植株再生能力受供体植物的染色体组型和基因型影响.曾有文献[7]介绍,油菜(Brassic a campe stris )的再生能力以AABB 染色体组品种最强,AACC 次之,AA 最差.Kyozuka 等[8]报道,籼稻(O ryza sativa subsp .indica )、粳稻(O .sativa subsp .japonica )和野生稻(O .minuta )的不同基因型在分化和再生能力方面表现出基因特异性.甚至同一品种的不同个体之间也表现出这样的差异.据黄白渠[6]介绍,在同一品种的苜蓿(M edic ago sativa )中,来自不同植株的原生质体分裂和形成胚状体的潜力是不同的.最初由原生质体成功地再生出植株的是茄科的一些植物,如烟草和矮牵牛,这些物种长期以来一直被用来作为研究原生质体培养和植株再生的模式植物.20世纪80年代以来,原生质体植株再生的研究在许多植物中取得突破性进展,已经获得了若干种有重要经济价值的原生质体再生植株,包括禾谷类的水稻(O .sativa )、玉米(Zea mays )、小麦(Tritic um ae stivum )、甘蔗(Sacc harum sinense )、高粱(Sacc harum bicolor ),豆科中的大豆(G lycine max )、花生(A rac his hypogaea )、蚕豆(Vicia faba )、苜蓿(M .sativa ),重要经济作物中的棉花(G .hirsulum spp .)、甜菜(Beta var .rapa )及重要木本植物咖啡(Coffea stenophylla )、苹果(Malus pumila )、梨(Pyrus spp .)、龙眼(Dim ocarpus longan )、猕猴桃(A ctinidia chinensis )、杨树(Populus spp .)、泡桐(Paulownia spp .)、白云杉(Picea glau -ca )、观赏植物菊花(Chrysanthemum morifolium )、康乃馨(Dianthus caryophyllus )、天竺葵(Pelargonium hortorum )等[1].再生植株着重于农作物和经济植物,并从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物、体细胞向生殖细胞扩展.总结原生质体植株再生成功的经验,有3个共性的关键因素:①选择合适的基因型;②利用胚性悬浮细胞或愈伤组织作为分离原生质体的材料;③培养条件适宜.尽管原生质体培养取得了令人鼓舞的成功,但原生质体培养的稳定性和可重复性差,存在很强的经验性,得到的原生质体再生植株仅占已进行原生质体培养的数百种植物中的一部分,而且原生质体分裂、分化的潜在生理生化本质和机制,以及各种影响因素需作深入的研究.2 植物体细胞的融合从原生质体再生完整植株的成功,最终引发了将不同遗传背景的细胞组合在一起的尝试.经过近30年的努力,人们建立起一套完整的体细胞杂交体系,它可能使不能通过有性过程杂交的亲本之间进行核基因的重组或胞质基因的重组.这套技术体系包括诱导原生质体的融合、选择融合体或杂种细胞及杂种植株的再生与鉴定.2.1 原生质体融合技术的进展原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程.早期使用的有Na NO 3法、高66 仲恺农业技术学院学报第16卷钙高pH 法、PE G 法等,后来相继发展了PEG 与高Ca 2+、高pH 值相结合的方法(也简称PE G 法)、电融合法以及聚集微束激光法.目前,广泛使用的是PEG 法和电融合法.PE G 法是采用聚乙二醇为融合剂的一种化学方法,使用简便、经济、可重复性强,已成功使近百个实验获得体细胞杂种.PE G 法诱导原生质体融合时,一般所用分子量为1500～6000,浓度为15%～45%.PE G 法的缺点是处理时间、PE G 分子量、诱导液的浓度等不易掌握,且易形成多元融合物,还有待于完善.电场融合是目前最流行的物理诱导融合法,它是20世纪80年代初迅速崛起的一种细胞融合技术[9].近年来,已发表了数百篇关于电融合的基本化学机理及其在医学、分子生物学、生物技术学等方面应用的科学论文.迄今为止,通过电融合反复实验,已测出了数十种植物原生质体的电融合参数,如水稻、小麦、燕麦(A vena sativa L )、马铃薯(Solanum tuberous m )、油菜(B .campestris )、胡萝卜(Daucus carota )、菜豆(Phaseolus vulgaris )、蚕豆、烟草、矮牵牛等,并成功获得部分细胞杂种[10].原生质体在融合液中的接触和融合受到外电场的作用强度、融合液的组成(如渗透剂种类、Ca 2+,Mg 2+浓度、添加的化学物质、pH 值等)的影响.电场融合的最适条件,需要分别具体材料,在实验中不断加以探索而提高,但电融合因其操作简便、快速、融合同步性好,尤其是与微培养技术相结合,将会是非常有前途的技术体系.在融合的方式上,主要有对称融合和供体-受体式融合两种.对称融合是体细胞杂交最初采用的融合方法,并由之实现了许多有性杂交不亲和的种属间的基因交流.如在马铃薯的育种中,Mattheij 等[11]用对称融合的方法获得了产量提高的四倍体细胞杂种,开辟了马铃薯商业化育种的新途径.但一般来说,对称融合在导入有用基因的同时,也带入新的全部不利基因,同时在体细胞水平上,也往往表现出一定程度的种间不亲和性.供体-受体式融合可分为细胞质杂交和不对称融合.若用致死剂量的射线处理供体原生质体,则可以形成完全没有亲本染色体的胞质杂种,若利用X 射线、紫外线打断或破坏亲本一方完整的染色体结构,使染色体部分被破坏后用于体细胞杂交,则形成不对称体细胞杂种.供体-受体式融合,可以实现胞质基因的重组,更有希望克服远缘杂交的不亲和性,因而是一条育种的简便途径,但不足之处在于供体基因丢失是一个随机的过程,丢失的程度是不可预见和难以控制的,所以有针对地转移特定的性状是亟待解决的问题.2.2 植物体细胞的杂交组合20世纪70年代,在培育体细胞杂种方面所取得的巨大成功使人们极度兴奋,许多学者一直致力于用这一方法创造新的杂种.在早期的研究中,研究兴趣和重点集中于获得亲缘关系较远的植物之间的体细胞杂种,在许多系统发育上无关的种间进行了大量的原生质体融合实验.有关例子包括大豆和烟草、大豆和大麦(H ordeum vulgare )、大豆和玉米、大豆和油菜、胡萝卜和大麦、胡萝卜和芹菜(Apium graveolens )等.多数情况下这些实验都如意料中的一样失败,融合的产物几乎不能进行分裂和生长.随后,许多学者试图从同科异属的杂种细胞再生杂种植物,杂交组合的例子有番茄+马铃薯、拟南芥+油菜、颠茄(Atropa spp .)+曼陀罗(Datura spp .)等,且获得了一些稳定的杂种细胞品系,有的还成功地再生出属间杂种植物,如广为宣传的番茄+马铃薯杂交植株.20世纪80年代中期以来,人们研究的兴趣转向选用近缘种内或种间以及较近缘属间的杂交组合.近缘体细胞杂交,具有更强的目的性,并且在实践上已经证明是一条可行的育种途径.在此期间,随着一大批经济植物如水稻、大67第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 豆、小麦、柑桔(Citrus reticulata )、猕猴桃(A .c hinensis )、樱桃(Pyrus avium )、杨树等原生质体培养的成功和对部分体细胞杂种研究的重视,重要经济植物非对称体细胞杂交成为该领域研究的主流.Zhou 等[12]、向凤宁等[13]先后以小麦为受体进行了一系列属间、种间非对称原生质体细胞融合,并获得体细胞杂种植物.邓秀新等[14]通过柑桔体细胞杂交得到抗寒、抗高温和抗病的杂种植株.肖尊安等[15]通过猕猴桃属种间原生质体融合,获得了中华猕猴桃(A .chinensis )与狗枣猕猴桃(A .kolomikta )的4个体细胞杂种无性系再生植株.辛化伟[16]通过非对称杂交,获得水稻与大黍(Panicum maximum )的体细胞杂种及后代.据不完全统计,通过体细胞杂交,至少已获得44个种内、103个同属异种,48个属间、5个科间的杂种植物,其中非对称融合的体细胞杂种在90%以上.2.3 杂种细胞筛选和体细胞杂种鉴定植物原生质体融合后的杂种细胞筛选方法,迄今还没有一个在总体上可以被广泛应用的方案.目前按其各自的基本原理可分为3类:①利用或创造各种缺陷型或抗性互补细胞系,用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来.细胞系互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补及抗性互补.前两种为隐性性状,其实施的关键是作为遗传标记的有关突变的利用.将黄化的黄花烟草(N .rustica )原生质体同白化的普通烟草原生质体融合,随后筛选出绿色的种间体细胞杂种[6].抗性互补为显性性状,当两个单抗的亲本融合后产生双抗杂种细胞,用相应的选择培养基则能将杂种细胞筛选出来,如Wijbrandi 等[17]用这种方法筛选了体细胞杂种.②利用或人为地造成两亲本原生质的物理特异性差异进行选择.如Sundber 等[18]根据融合和未融合原生质体物理特性的差异,利用倒置显微镜成功挑选出油菜融合原生质体,Chuong 等[19]用荧光激活细胞分拣机FACS 实现了大量挑选杂种细胞.③利用或人为地造成细胞生长或分化能力的差异进行选择.向凤宁等[20]在小麦与3种近缘属间禾草的体细胞杂交中发现,融合克隆具有优先生长的现象,这种生长速度的差异可用作选择的依据.当由杂种细胞获得再生植株后,必须进一步的分析和鉴定以证实杂种的真实性.常用的杂种鉴定方法有表现型鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定及分子生物学鉴定.表现性鉴定是最常用的方法,是利用杂种与双亲表现型的差异进行比较分析.这种差异可以是形态学的直接特征,也可以是通过转基因人为创造的抗逆性.染色体数目和形态具有种的特性,是鉴定杂种的主要细胞学证据.此外基因组原位杂交(GISH )是分子细胞学鉴定杂种的主要方法.如Zhining 等[21]利用GISH 确认了羊草(L .chinensis )和小麦体细胞杂种.同工酶分析是最基本的生化分析方法,杂种的同工酶谱往往是双亲酶谱的总和,同时表现双亲特有的酶谱,也可能出现双亲没有的新酶带.有学者成功地通过分析油菜的PGI 、PGM 等同工酶,鉴定了体细胞杂种[7].近年来,对融合杂种植株进行分子生物学鉴定己成为强有力的手段.常用的鉴定植物体细胞杂种的分子生物学方法有限制性片段长度多态性(Restriction fragment length ploymorphism ,RFLP )、随机扩增多态性(Random amplified polymorphic DNA ,RAPD )、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length ploymorphism ,AFLP )、简单重复序列(Simple se -quence repent ,SSR )等.在这方面已经有较多成功的例子.68 仲恺农业技术学院学报第16卷3 植物原生质体培养和融合技术的应用原生质体培养和融合是细胞工程的核心内容,它在基础理论研究和实现远缘遗传重组,转移多基因控制性状,创造和改良品种中展示出广阔的应用前景.3.1 原生质体的理论研究和遗传应用离体的植物原生质体和其起源细胞一样仍然具有全能性,可作为生物试验系统而广泛用于生理学、遗传学、病理学、病毒学和育种学的研究.如当细胞脱壁时会引起细胞自身防御系统启动,诱发某些基因表达和关闭,深化了对细胞修复机理的认识[22].Fo wke [23]对白云杉(P .glauc a )以及Simmonds [24]对烟草原生质体培养的研究表明,影响原生质体植株再生的因素如基因型、材料来源、培养基成分、培养条件等在生理或分子水平上有一定的重叠性和相关性,揭示了脱分化机理、细胞分裂等发育学上的问题.原生质体又是遗传工程的理想受体.原生质体可以直接摄取外源物质,包括细胞核、细胞器基因组、DNA 片段及病毒颗粒,而且在控制条件下,以单个原生质体进行准确的遗传操作,易于转化受体的筛选和分析,避免嵌合现象.经过多年的努力,以原生质体为受体直接进行基因转化己取得较大的成功[25].3.2 植物体细胞杂交的应用从有性杂交植物时代到体细胞杂交植物时代所获得的各种研究结果,使植物育种的视野在器官和细胞水平上都得到了扩大.在理论上,体细胞杂交可以和常规的有性杂交技术一样作为遗传分析的手段,用于对遗传性状的本质、核基因、核外基因以及细胞分化和形态发生机理的研究和分析.在实践中的应用体现在3个方面:①获得新的种质.体细胞杂交技术不仅能使近缘不亲和种内或种间植物,而且可使远缘不亲和的属间甚至科间植物产生体细胞杂种,使植物能够利用远缘的有用基因,从而扩大植物可利用的基因库.如果杂种植物可育,并能稳定遗传,就可能形成农业上有用的新物种.如通过白菜型油菜(B .c ampestris )与甘蓝(B .napobrassica )进行原生质融合得到38条染色体的甘蓝型油菜,通过甘蓝型油菜(B .napus )与黑芥(B .nigra )体细胞融合得到的含3套染色体的杂种,大部分可育并结籽[7].②培育新品种.将栽培品种与相关的野生种作为亲本,经过原生质融合、选择与再生,从而获得具有抗性的新品种.如通过这样的方法,得到抗马铃薯晚疫病的体细胞杂种[26].③转移细胞质基因.通过体细胞杂交能够转移多基因控制的性状,并且是目前唯一能使双亲胞质和核基因在杂种细胞中共存的技术.原生质体融合涉及了双亲的细胞质,它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中,也可使叶绿体基因组与线粒体基因组重新组合.这为许多实验所证实并直接应用于植物育种.4 结语纵观30多年来,虽然有关植物原生质体培养和体细胞融合技术的研究始终保持了长盛不衰之势,并取得了可喜的成绩,但是在原生质体培养技术的成熟度、在体细胞杂种的育性(特别是远缘体细胞杂交中)以及非对称杂交中染色体消失的随机性等方面都存在着亟待研69第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 究和解决的问题.以原生质体植株再生技术为基础,利用体细胞杂交技术转移胞质雄性不育基因、多基因和基因组以及某些野生抗性性状等方面,将是未来研究的主流.有理由相信,原生质体培养和体细胞杂交技术与遗传转化技术相辅相成,与常规育种技术结合起来,将为植物基因组之间的结合和相互作用以及新品种的培育提供了无限的可能性.参考文献:[1] 许智宏,卫志明.植物原生质体培养和遗传操作[M ].上海:上海科学技术出版,1997.20-30.[2] SHEPARD J F .Cultivar dependent cultural refinements in potato protoplast regeneration [J ].Plant Science Letters ,1982,26:127-132.[3] FUJIMURA T .Regeneration of rice plant from protoplant [J ].Plant Tissue culture letters ,1985,2:74-75.[4] SHILLITO R D ,PASZKOOOSKI J ,POTRYKUS I .Agarose plating and a bead type culture technique enable andstimulate development of protoplast 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体细胞杂交在蔬菜作物上的研究与前景
体细胞杂交在蔬菜作物上的研究与前景
杨东旭;刘玉梅;韩风庆;张硕;杨琳;李占省
【期刊名称】《中国蔬菜》
【年(卷),期】2024()2
【摘要】体细胞杂交是一种将植物不同种、属,甚至科间的原生质体诱导融合,然后离体培养获得再生植株的技术。
原生质体融合能克服传统育种的杂交生理障碍问题,实现不同材料间核质基因的重组,传递优异基因,创制并获得含目标性状的新种质,拓宽育种材料的遗传背景,同时能快速创制雄性不育材料,极大地缩短育种年限,是作物进行突破育种的有效手段和强大的性状改良工具。
本文对该技术在蔬菜上的发展历程、研究和应用领域进行综述,重点总结了十字花科、茄科、伞形科蔬菜作物原生质体分离再生和体细胞杂交的研究进展,展望了体细胞杂交技术在蔬菜作物中的应用前景,讨论了该技术在应用过程中面临的问题与对策,为体细胞杂交在蔬菜上的广泛应用提供参考。
【总页数】13页(P19-31)
【作者】杨东旭;刘玉梅;韩风庆;张硕;杨琳;李占省
【作者单位】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S51
【相关文献】
1.利用闲茬种植绿肥作物药剂拌种防治地下害虫在A级绿色食品蔬菜上的应用研究
2.蔬菜作物上施用水溶性微量元素肥料肥效研究
3.简述壳寡糖诱导蔬菜作物抗性上的研究进展
4.简述化感作用在蔬菜作物上的研究进展
5.病毒诱导基因沉默在蔬菜作物上应用的研究进展
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植物原生质体非对称融合技术
植物原生质体非对称融合技术08生物工程（2）班0802012008 盛蕾摘要：植物物种间的生殖隔离在一定程度上阻碍了植物遗传育种的进程，难以经性状重组得到优良品质。
而原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径。
本文主要介绍了植物原生质体融合技术中的非对称融合技术的概念、意义、影响因素和应用等。
关键词：1原生质体2非对称融合3影响因素4应用1植物原生质体高等植物细胞经酶解法去细胞壁分离出的部分为原生质体。
1.1原生质体的制备1.1.1材料与酶液的准备虽然几乎从植物的每一部分都可以分离出原生质体，最常用的材料还是植物的叶片。
如采用叶片作材料时，注意植物的生长环境，叶片的年龄和其生理状态。
在使用这些材料前，通常使用酒精、什汞或次氯酸钠对叶片进行消毒。
制备酶液时要注意酶的种类、酶液的浓度、酶液的组成成分以及酶液的pH 值。
常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、蜗牛酶、琼脂酶和果胶酶等。
1.1.2原生质体的分离原生质体的分离有机械分离法、酶解分离法，其中常用的为酶解法。
2植物原生质体非对称融合的概念两种异源（种、属间）原生质体，在诱导剂诱发下相互接触，从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成杂种植物体，称为细胞融合，或细胞杂交。
在植物原生质体融合研究中，原生质体融合通常有两种方式：对称融合和非对称融合。
这两种融合方式常产生三种类型的杂交：对称杂种、非对称杂种和胞质杂种。
对称融合一般形成对称杂种，其结果是在导入有用基因的同时，也带入了亲本的全部不利基因。
一个杂种中有两套不尽相关的基因并不是人们所期望，这样常导致部分或完全不育，因而难以形成育种上的有用材料。
非对称融合得到的非对称杂种含有受体的全部遗传物质，而只有供体的部分遗传物质，有时还能获得供体染色体完全丢失的胞质杂种，在一定程度上可以克服细胞不亲和性，还可以得到只转移部分基因的杂种，提高育性，缩短育种时间。
3非对称融合的影响因素用射线钝化供体原生质体，造成原生质体丢失，从而影响非对称杂种的获得。
原生质体融合技术在枣育种中的应用展望
ｔ ｎ Ｔ ｅａ ｖｎａ ｅ ｐ ｓｉｉｔ ａ ｄｋ ｙｐｏｅｓｓ ｆ ｒｔｌ ｔ ｓ ｎｉｊｊｂ ｒｅｉｇ ｒ ｅｃ ｂ ｄａｃ ｒｉｇ ｉ ． ｈ ｄ ａｔｇ ， ｏｓ ｌｙ ｎ ｅ ｒｃｓｅ ｏ ａ ｉ ｕ ｅ ｅｄｎ ｅ ｓｒ ｅ ｃｏｄｎ ｏ ｂ ｉ ｏ ｐ ｐ ｓｆ ｏ ｎ ｕ ｕ ｂ ｗｅ ｄ ｉ ｔ ｏｕ ｎｓ Ｍｅｎ ｈｌ，ｈ ｒｂｅ ａ ｄｄｆ ｃｌ ｓｗ ｌａ ｅｅｒｈｐｏ ｒｓ ｏ ｒｔｐａｔ ｓ ｎｉ ｊｊ ｂ ｏｄ ｃ ｍｅｔ． ａ ｗ ｉ ｔｅｐｏ ｌ ｅ ｍ ｎ ｉ ｕｔ ａ ｅｌ ｓ ｓａｃ ｒｇｅｓ ｆ ｏｏ ｌ ｉ ｕ ｅ ｉ ｆ ｙ ｒ ｐ ｓｆ ｏ ｎｕ ｕ
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困难 ， 本文 提 出 了应 用枣 树原 生质体 融合 技术 来实 现枣树 优 良基 因的重 新组合 ， 到创造 新种 质 ， 达 获得 新 品 种 的 目的 。通 过对有 关文 献 的分析 ， 本文 主要对 原 生质 体及 原生质 体融合 技术 的研 究进展 和 这一 育种 技术
植物组织培养技术应用及进展
植物组织培养综述植物组织培养技术应用及进展摘要：本文综述了植物组织培养理论的发展，重点论述其再脱毒、快繁、育种与有机化合物工业生产以及种质资源的保存等方面的应用，本文还对植物组织培养过程中所采用的新技术进行了综述, 介绍了这些新技术的应用现状,并对应用的前景作简单的展望。
关键词:植物组织培养；应用；进展1.理论起源19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。
1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。
1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。
植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。
植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。
不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。
在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。
植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。
【精品】植物组织培养研究进展
植物组织培养研究进展摘要植物组织培养技术作为一种科研手段,发展异常迅猛。
从组织培养的原理、培养过程中遇到的问题以及前景和展望这3方面综述了我国近几年植物组织培养的新研究。
关键词:组织培养；存在问题；措施；发展20世纪后半叶，植物组织培养发展十分迅速，利用组织培养，不仅可以生产大量的优良无性系，并可获得人类需要的多种代谢物质；细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力；还可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体；组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料[1]。
因此，植物组织培养广泛应用于植物科学的各个分支，如植物学、植物生理学、遗传学、育种学、栽培学、胚胎学、解剖学、病理学等，并广泛应用在农业、林业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，被认为是一项很有潜力的高新技术。
1 组织培养的基本原理1.1 植物组织培养的概念植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织或潜伏芽等，或长成完整的植株的技术[2]。
1.2 植物组织培养的依据植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。
1902年，德国著名植物学家GHaberlanclt根据细胞学理论[3]，大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞在适当的条件下具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜力的观点。
1943年，美国人White在烟草愈伤组织培养中,偶然发现形成一个芽,证实了GHaberlanclt的论点[4]。
在许多科学家的努力下，植物组织培养技术得到了迅速发展，其理论和方法趋于完善和成熟，并广泛应用产生了巨大的经济效益和社会效益。
植物原生质体融合技术的研究进展
植物原生质体融合技术的研究进展黄国文【摘要】植物原生质体融合（protoplast fusion）技术能够克服植物远缘杂交不亲和的障碍,实现遗传物质重组,创造和培养植物新品种,对多基因控制农艺性状的改良和植物基因互作研究具有重要的意义。
本文主要综述了原生质体融合方法、融合机理和融合方式等的研究进展,并且分析了其应用和发展前景。
【期刊名称】《湖南科技学院学报》【年(卷),期】2011(032)012【总页数】5页(P30-34)【关键词】原生质体;融合方法;融合方式;融合机制;应用【作者】黄国文【作者单位】湖南科技学院生命科学和化学工程学院,湖南永州425100【正文语种】中文【中图分类】Q2-3原生质体是指去掉了细胞壁后细胞膜所包围的裸露细胞。
最早期利用机械法制备原生质体，将植物组织放在高渗糖溶液中浸泡一定时间，细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形；然后用机械破碎组织，一些完整原生质体从伤口处释放出来[1]，但用这种方法得到的原生质体的数量较少，且受植物种类的限制。
1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体[2]。
这种方法是把材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间来降解细胞壁，可以释放大量有活力的原生质体。
目前，人们对原生质体的制备和培养进行了不少研究,而且对原生质体的融合也开展了大量的研究。
原生质体融合在品种改良、基因转化和基因相互作用等生物工程领域得到了广泛的应用。
两种异源（种、属间）原生质体，在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成体细胞杂种。
通过细胞培养技术，杂种细胞可进一步发育成杂种植物体。
这个杂种后代有可能兼有两个亲代的一些优良性状。
原生质体融合可以克服远缘杂交时有性生殖不亲和性障碍，扩大了遗传物质的重组范围，创造有性杂交方法无法获得的新型杂种植物。
通过原生质体融合可以从一个品种向另外一个品种转移一些有用的基因，例如，疾病抗性基因、固氮基因、抗冻和抗干旱等基因。
植物原生质体融合研究进展
原生质体融合简介
原生质体分离 原生质体纯化 原生质体融合 原生质体融合应用 目录
1.原生质体融合简介
体细胞杂交与有性杂交的异同
比较内容
时间
体细胞杂交
无季节限制 一定程度上可以 克服有性/嫁接不 亲和性 细胞核、细胞质 均可以重组、倍 性增加
有性杂交
花期限制，特别 是母本的花期 受亲和性影响
• 原生质体融合由于不涉及到雌雄性配子， 可以克服上述生殖障碍。 • 柑橘原生质体融合的方式以对称融合为主， 只有刘继红等开展了原生质体非对称融合 （也称作供- 受体融合）。
• 融合再生三倍体杂种 原生质体融合再生三倍体主要有两条途径： 一是配子- 体细胞融合 二是单倍体体细胞与二倍体体细胞融合。 邓秀新等进行伏令夏甜橙悬浮系原生质体 与文旦柚四分体原生质体融合，得到了三 倍体植株。
离心沉淀法
漂浮法
界面法
界面法
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其 中一种溶液密度大于原生质体的密度， 另一种溶液小于原生质体的密度。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
4.原生质体融合
• 植物体细胞杂交技术包括以下三个环节：
• • • 诱导原生质体融合； 选择融合体或杂种细胞； 杂种细胞的培养与鉴定。
+ + + + -
+ + -
+ + -
4.3原生质体的融合过程
异种原生质体先经膜融合形成共同的质膜， 然后经胞质融合，产生细胞壁，最后是核融合。 细胞核的融合是异种原生质体融合的关键。 融合体只有成为单核细胞后才能继续生长，才能 合成DNA、RNA，并进行细胞分裂，这就要求 两个核必须同步分裂，如果两个核所处时期不同， 一个开始合成DNA， 另一个还处于合成的中途 或已完成了复制，它们之间就会相互影响，导致 最终不能进行细胞分裂。
简述植物原生质体
简述植物原生质体作者：关紫荆崔楠张雪来源：《中国科技博览》2016年第25期[摘要]植物细胞主要由细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核组成。
原生质体由于去掉了细胞壁，细胞膜成为细胞活物质与外界环境的唯一屏障。
原生质体可以用来观察各种细胞过程和活动，在不同种类植物中响应光、胁迫、激素等因素的离子通道的调控等研究领域有着重要的应用。
酶解液中的离析酶和纤维素酶的浓度是影响原生质体分离的最重要因素之一，不同浓度的酶液组合对原生质体产量和质量的影响有显著差异。
中图分类号：TN784.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）25-0264-011. 前言原生质体可以用来观察各种细胞过程和活动，如在细胞壁的合成，细胞分裂，再生组织的分化，Ca2+ 信号转导和调控，在不同种类植物中响应光、胁迫、激素等因素的离子通道的调控等研究领域有着重要的应用。
Cocking自1960年首次用酶法制备番茄根原生质体获得成功之后，植物原生质体的研究才逐渐变得活跃起来。
虽然当时还没有有效的DNA导入方法，但原生质体已经成为细胞壁再生、细胞分裂、胚的生成、分化及植物病毒研究的有效工具，经过许多研究者的不断努力，已建立起了酶解分离出原生质体的基本程序。
但几乎所有的研究都表明，由于植物本身存在差异性，不同的种类，甚至同种植物不同的供试组织，其原生质体分离所需的条件都存在着很大差异。
原生质体是植物遗传改良的重要实验体系之一，并且为定量研究植物细胞的许多生理和生化过程提供了适宜的实验体系，尤其是与光/叶绿体相关的过程。
例如，烟草中光诱导的叶绿体运动；玉米中光诱导的基因表达等。
通过原生质体融合可以克服远缘杂交难以克服的障碍等。
在小麦离体培养中，可以通过根、茎、叶、花药、胚、穗等各种外植体均可实现植株再生。
2. 离体的原生质体的特点离体的原生质体具有以下特点：（1）在悬浮液中彼此完全分离，每个原生质体可看作一个纯粹单细胞，易于定量操作和控制；（2）在保持培养基中，原生质体内RNA和蛋自质合成能力及光合活性与原组织中的细胞水平接近；（3）在增殖培养基中，原生质体能以高频率再生胞壁和细胞分裂进而增殖成愈伤组织，在分化培养皿上能再生完整植株；（4）在诱导条件下，原生质体能发生同源或异源融合，形成聚核体或杂核体，因此是体细胞杂交的理想材料；（5）原生质体不仅能摄取核酸、蛋白质等高分子物质而且还能摄取病毒、叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的理想工具；（6）培养中的原生质体会发生变异，若原生质体是纯粹单细胞，则变异原生质体再生植株的变异性状更纯；（7）原生质体极易被破坏，便于核酸、蛋白质（含酶）等高分子物质及胞核、叶绿体、线粒体、液泡和膜等的分离。
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植物原生质体融合方法的研究进展
作者：李琦
来源：《种子科技》2018年第06期
摘要：原生质体融合（protoplast fusion）是指通过物理或化学方法使两个细胞的原生质体进行融合，经培养获得具有双亲全部或部分遗传物质后代的方法。
应用植物原生质体融合技术，可以克服远缘杂交不亲和的障碍，打破物种之间的生殖隔离，扩大杂交亲本范围，实现基因在物种间的转移和遗传重组，培育新品种和创造新物种。
主要就植物原生质体融合的方法进行了阐述。
关键词：植物原生质体；融合方法；研究进展
文章编号： 1005-2690（2018）06-0038-02 中图分类号： Q943 文献标志码： A
原生质体是组成细胞的一个形态结构单位，原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的主要材料。
1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体，Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液，在一定条件下培养一段时间后，发现大部分细胞的细胞壁被降解，从而制备出大量有活力的原生质体。
1 原生质体融合的目的及意义
原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力，使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合，进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞，克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。
另外，可转移优良的生物性状，实现基因重组，而改良现有品种。
目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等，还可按照人们预先的期望创造出新物种。
2 原生质体的融合方法
2.1 自发融合
在酶解细胞壁形成原生质体的过程中，相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体（homokaryon）。
每个同核体内可包含两个或多个核，这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。
多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。
如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中，大约有50%是多核融合体。
2.2 高pH-高Ca2+法
通常情况下，Ca2+影响细胞融合的效率比Na+和K+ 要低，但是在高pH环境下，高浓度的Ca2+影响细胞融合的效率大大升高。
该法以钙盐作诱导剂，在高Ca2+高pH的条件下，使原生质体发生融合。
该种方法在1973年是由Keller和Melchers进行诱导烟草原生质体融合时创造的。
具体是将两个原生质体的混合物放于含有7.35 g/L CaCl2·2H2O和72.87 g/L甘露醇的溶液中，pH值为10.5，在200 rpm/min低速下离心3 min，然后将离心管保持在37 ℃水浴锅中40～50 min。
但这种方法仅适合叶肉原生质体的融合，并且要注意高pH环境对某些细胞生理活性产生的影响。
2.3 聚乙二醇（PEG）法
PEG是一种大分子量的水溶性多聚化合物。
采用PEG法，需将两种不同的原生质体以合适比例混合后，加入28%～58%的PEG溶液处理15～30 min，然后用培养基进行清洗后即可培养。
后来有学者对PEG法进行了改进，即逐步降低PEG的浓度，提高溶液中Ca2+的浓度和pH值，使融合效果得到有效的提高。
由于该法易于控制、操作简单、促进细胞融合的能力较强、诱导的融合没有特异性，故被广泛选用。
2.4 电融合法
电融合法是指用细胞融合仪产生交变电压和高压脉冲电场，使粘连的原生质体膜瞬间破裂，然后与相邻的不同原生质体连接闭合产生融合体。
黄家总等成功地利用电击细胞融合，使紫罗兰和桂竹香的原生质体融合。
该种方法的优点是没有化学残留、对细胞的毒害作用较小、操作简单、融合率高、一次可融合大量原生质体。
2.5 激光微束穿刺法
激光微束穿刺法是利用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺，引起细胞膜的可逆性穿孔，从而导入外源DNA的一种基因直接转化方法。
侯丙凯等首次用激光微束穿刺法照射油菜子叶叶柄，将杀虫蛋白基因导入油菜，经植物再生和卡那霉素筛选，成功获得了抗虫转基因植株。
此法对细胞的损伤较小，并且可以准确定位于被照射的细胞，但是因设备昂贵，故在大量培养生产中使用较少。
2.6 亚原生质体融合
植物亚原生质体主要包括3种，分别是核质体、胞质体和微原生质体，其中最常用的是胞质体和微原生质体。
胞质体-原生质体融合被认为是获得胞质杂种、转移胞质因子最为有效的方法。
如Sigareva等将大白菜原生质体与抗寒且具有Ogura型CMS特性的花椰菜胞质体融合，获得的胞质杂种具有抗寒与胞质雄性不育的特性，与传统方法相比，此法育种过程较短，生产效率更高。
另外，微原生质体-原生质体融合也被称为微核技术，是指将供体原生质体经处理后仅含有一条或几条染色体，用膜包被后与另一完整原生质体融合的技术。
Ramulu等利用该技术在茄科不同属植物间完成了目标染色体的转移，并成功获得植株。
该技术虽可在不同
种属间转移一条或多条染色体，并获得性状稳定的再生植株，但制备微原生质体的难度较大，因此该技术在实际应用中具有一定的局限性。
3 展望
除上述植物原生质体融合方法外，还包括植物介导的遗传转化法、盐类融合法、多聚化合物法、PEG-高Ca2+-高pH融合法，目前发展的如高通量细胞融合芯片方法和基于微流控芯片进行融合法。
关于对植物原生质体融合方法的研究，是许多学者的研究对象，相信将来如果在原生质体融合效率和成本控制、多个原生质体间的融合与如何将优良性状基因精准地导入植物细胞融合方面取得进展，植物原生质体融合会起到更加重要的作用，创造更大的价值。
（收稿日期：2018-05-08）。