柚皮提取物的抑菌作用

分别调节牛肉膏蛋白胨培养基 p H 值为 5 、 6 、712 ,用平板稀释法测定 110 %柚皮提取物在 不同 p H 的环境中对供试 3 种细菌的抑制效 果 ,结果见图 1 。图 1 表明 ,p H 对柚皮提取物 抑菌有较明显的影响 ,偏酸性的 p H 值更有利 于抑菌 。在 p H5～6 范围内 ,柚皮提取物抑菌 效果更好 ,这可能是因为柚皮黄酮是提取物中 起抑菌作用的主要物质之一 ,而柚皮黄酮在酸 性条件下比较稳定 。同时 ,当介质 p H 分别为 5 和 6 时 ,空白对照中金黄色葡萄球菌和沙门氏 菌的菌落数也明显少于 p H712 时 ,这是因为金 黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最适生长条件是 p H 710～715 ,在酸性条件下金黄色葡萄球菌 和沙门氏菌本身的生长也受到了抑制 ,而大肠 杆菌的最适生长条件是 p H610 ～ 710 , 在 p H5 时 ,其本身的生长也受到了一定的抑制 。
( 40 ) 2004 Vol. 30 No. 1 ( Tatol 193)
制作用强于沙门氏菌 ,这与 M IC 的实验结果一 致 。但是其量效关系和 M IC 实验相比较 ,不是 很明显 。这可能是与提取物的扩散性有关 ,当 提取液在滤纸片吸附后 ,不能很好的扩散到培 养基中去 ,影响了抑菌效果 。 21113 p H 值对柚皮提取物抑菌效果的影响
表 2 滤纸圆片法测定不同浓度柚皮 提取物的抑菌圈 mm
样 品 空 白 1∶50 葡萄柚液 5 %SPE 215 %SPE 1 %SPE 015 %SPE
大肠杆菌
0 1810 1310 1312 815 710
沙门氏菌
0 2010 1117 917 912 910
金葡球菌
0 2110 1310 910 710
100 ℃的不同烘箱中处理 2 h ,取出备用 。以无
菌水稀释已活化好的大肠杆菌和沙门氏菌种制
备含活菌量 1 ×106～1 ×107 cf u/ mL 的菌悬液
备用 。
接种培养 :同 1121213 节 。
1121215 菌 种 点 接 法 测 试 对 霉 菌 的 抑 制 作
用[6 ,7 ]
霉菌菌种的活化 : 制备 PSA 培养基斜面 ,
1121211 混 平 板 稀 释 法 测 定 最 低 抑 菌 浓 度
( M IC) [4 ,5 ]
菌悬液的制备 :取大肠杆菌 、沙门氏菌和金
黄色葡萄球菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基
斜面 ,37 ℃培养约 24 h ,用接种环从斜面上挑菌
到 100 mL 无菌水中制成菌悬液 ,稀释 10 倍 ,并
基上 ,每个平皿贴全所有浓度及空白的滤纸片 ,
共计 6 张 ,每种菌做 2 个平行 ;置 37 ℃培养箱
中培养 1～2 d 观察测量抑菌圈直径大小 。
1121213 介质 p H 值对柚皮提取物抑菌效果
的影响
不同 p H 值培养基的准备 : 配制普通牛肉
膏蛋白胨培养基 ,分为 3 份 ,调节 p H 值分别为
取黑曲霉 、米曲霉 、青霉菌种接种到斜面上活化
24 h ,取活化菌再次接种到斜面上进行 2 次活
化 48 h ,备用 。
接种培养 :无菌操作下 ,用取样器吸取 5 %
柚皮提取物到 6 个灭菌平皿中 ,每种菌做两个
平行 ,另取 6 个灭菌平皿作空白 ,倒入已灭菌置
45 ℃下恒温的 PSA 培养基约 15 mL (每次实验
×100
%
1121212 滤纸片扩散法测定抑菌圈[4 ,5 ]
菌悬液及柚皮提取物的制备 :直接用接种
环挑取已经活化好的斜面菌种到无菌水中制成
菌悬液 (含活菌量较大 ,以便抑菌实验中可以致
密接种) 。用无菌水倍比稀释配制 5 %、215 %、
1 %、015 %四个浓度的柚皮提取物 ,用无菌水稀
释配制 1∶50 的葡萄柚原液 。
抑菌率/
%
=
空白菌落直径 - 样品菌落直径 空白菌落直径
×100
2 结果与分析
211 柚皮提取物对细菌的抑制作用 21111 固体稀释法测定最低抑菌浓度 (M IC)
2004 年第 30 卷第 1 期(总第 193 期) ( 3 9 )
研究报告
用 稀 释 好 的 0125 %、015 %、1 %、2 %、 菌 ,沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的 M IC ,并计
6512 0 100
2% 57 8314 167 6416 6 98141
1% 99 7111 183 6111 128 66140
015 % 80 7619 228 5113 152
60124
0125 % 229 3318 287 3815 226 40154
由表 1 可见 ,柚皮提取物对大肠杆菌 ,金葡 球菌和沙门氏菌都具有一定的抑菌作用 。对大
0
注 :表中数据为抑菌圈直径平均值 ,其中 0 表示无抑菌圈 形成 。滤纸片直径为 515 mm
抗菌素抑菌圈试验结果的判定标准是 :抑 菌圈直径 > 15 mm 时为高度敏感 、10～15 mm 时为中度敏感 ,7～9 mm 时为低度敏感 、无抑菌 圈者为不敏感 。从表 2 可以看出 ,葡萄柚对供 试 3 种细菌均有很强的抑制效果 ,2 %的葡萄柚 原液抑菌圈均大于 15 mm ,属高度敏感 ,而柚皮 提取物对所试 3 种细菌均有一定的抑制效果 , 当提取物浓度为 1 %时即有一定的抑菌圈 ,而 且随着提取物浓度的增加 ,其抑菌效果也成上 升趋势 ,当浓度达 5 %时均表现为中度敏感 ,但 相比较而言 ,SPE 对大肠杆菌和金葡球菌的抑
培养基 :牛肉膏蛋白胨培养基 、葡萄糖马Fra Baidu bibliotek 薯 ( PDA) 培养基 。 112 方 法 11211 柚皮提取物的制备
称取柚皮干粉 200g ,以 60 %的酒精浸提干 粉 2 次 ,第 1 次以 20∶1 的料液比浸提 ,第 2 次 以 10∶1 的料液比浸提 ,抽滤得到柚皮提取液 。 真空浓缩 ,得到浓缩液 。将浓缩的乙醇提取液 上 N KA9 大孔树脂柱 ,用蒸馏水洗脱 ,至洗脱 液中不在含糖 ,然后用 60 %的酒精进行洗脱 , 将洗脱液重复上柱 , 收集 60 %乙醇洗脱液 ,回 收溶剂 ,冷冻干燥后制得样品 。置于干燥器中 备用 。经芦丁标准比色法测定 ,提取物中总黄 酮含量为 1019 %。
第一作者 :博士 ,副教授 。 3 湖北省自然科学基金资助项目 (No12001ABB107) 收稿时间 :2003 - 07 - 25 ,改回时间 :2003 - 12 - 04
( 38 ) 2004 Vol. 30 No. 1 ( Tatol 193)
研究报告
11212 柚皮提取物的抑菌活性研究
食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries
柚皮提取物的抑菌作用 3
李春美 杜 靖 谢笔钧
(华中农业大学食品科技学院 ,武汉 ,430070)
摘 要 用乙醇作提取剂提取柚皮 ,将提取物经过初步分离纯化得到黄酮含量为 1019 %的柚皮提 取物 (SPE) ,并对其抑制细菌和霉菌的作用进行了研究 。用滤纸片扩散法测定了相对抑菌活性 ,采 用固体稀释法确定柚皮提取物的最小抑菌浓度 (M IC) ,并进一步研究了 p H 值 、温度对柚皮提取物 抑菌作用的影响 ,采用 3 点接种法初步研究了样品对米曲霉 、黑曲霉 、青霉的抑制作用 。结果表 明 ,柚皮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强 ,其 M IC 均为 215 % ;对沙门氏菌的 抑制作用较弱 ,其 M IC > 215 % ;p H 值和温度对柚皮提取物的抑菌活性均有影响 ,SPE 在偏酸性条 件下抑菌效果较好 ;样品经 50 ℃处理对其抑菌活性影响不大 ;但处理温度提高到 80 ℃和 100 ℃时 , 其抑菌活力明显降低 。在供试的 3 种霉菌中 ,柚皮提取物对黑曲霉的抑制作用最强 ,抑制率为 6015 % ;对米曲霉的作用较差 ,抑制率为 3413 %。 关键词 柚皮 ,提取物 ,抑菌作用
司。 菌种 : 供试大肠杆菌 ( Escherichia coli ) 、伤
寒沙门氏菌 ( S al monella ty phi) 、金黄色葡萄球 菌 ( S taphylococcus au reus ) 、米 曲 霉 ( As2 pergill us oryz ae) 、黑曲霉 ( As pergill us ni ger) 、 灰绿青霉 ( Penicilli u m glaucu m ) 均由我校畜牧 兽医学院提供 。
通过混平皿计数 ,确定菌液的稀释度 ,使最后的
菌悬液所含活菌量在 1 ×106～1 ×107 cf u/ mL 。
接种培养 :无菌操作下 ,用取液器吸取相同
体积的菌液和不同浓度的柚皮提取物到灭菌小
离心管中 ,充分混匀后 ,迅速注入 200μL 到灭
菌平皿中 ,每种浓度的柚皮提取物做 2 个平行 ,
以菌液和同体积的无菌水的混合液注 200μL 作空白 ,也可直接注入菌液 100μL 作空白 ; 倒
滤纸片的制备及处理 :用灭菌镊子取烘干
后的灭菌滤纸片到配制好的柚皮提取物中浸 2
h ,置 30 ℃烘箱中烘干备用 。以无菌水浸过的
滤纸片做空白 。
接种培养 :无菌操作下 ,倒入灭菌过的培养
基制成平板 ,将菌悬液注 100μL 到平板上 ,用
涂布棒涂抹均匀后放置约 30 min 后以无菌操
作将含柚皮提取物的 515 mm 滤纸片贴到培养
肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强 ,其 M IC 均为 1 % ,但对沙门氏菌的抑制作用较弱 , 当浓度达到 215 %时 ,抑制率仅为 6512 %。 21112 滤纸圆片法测定抑菌圈
用稀释好的 015 %、1 %、215 %、215 %和 1∶ 50 的葡萄柚原液 5 种不同浓度的柚皮提取物 的抑菌圈直径大小 ,比较柚皮提取物的抑菌效 果 ,结果见表 2 。
215 %等 5 个浓度的柚皮提取物测定对大肠杆 算抑菌率 ,结果见表 1 。
表 1 SPE 对 3 种不同细菌的 MIC 及抑菌率
菌 种 大肠杆菌
沙门氏菌
金葡球菌
菌落数/ 个 抑菌率/ % 菌落数/ 个 抑菌率/ % 菌落数/ 个 抑菌率/ %
空 白 345
467
381
215 % 0 100 163
平皿中培养基倒入量应保持一致) ,充分混匀制
成平板 。用接种针把少量的三种霉菌接种在平
板表面上 ,成等边 3 角形的 3 点接种 ,在温度
28 ±1 ℃的培养箱中培养 2～3 d ,使各自独立形
成菌落 ,分别于第 2 天和第 3 天观察记录菌落
生长情况 ,并测量菌落直径大小 。
抑菌率通过以下公式计算 :
5 、6 、7 ,121 ℃灭菌 20 min 备用 。
菌悬液制备及接种培养 : 同 M IC 法 ,所用
柚皮提取物浓度为 1 %。
1121214 温度对柚皮提取物抑菌效果的影响
样品的处理及制备菌悬液 : 取 1 %的柚皮
提取物 ,用 4 支小离心管分装 ,1 支于室温 (20
～25 ℃) 下放置 ,另外 3 支分别置 50 ℃、80 ℃、
研究表明 ,葡萄柚提取物不仅对金黄色葡 萄球菌和大肠杆菌和伤寒杆菌有较高的抑菌活 性 ,而且是强效广谱的抗真菌药物[1 ] 。Negi 等 人也证实 ,葡萄柚中正己烷提取物的醇溶组分 有较强的抑菌活性 ,且对革兰氏阳性菌更为有 效[2 ] 。但是对于柚皮提取物抑菌的研究 ,国内 仍处于探索阶段 ,与之相关的文献报道和研究 很少 ,仅林捷等研究了柚皮的乙酸乙酯提取物 的抑菌作用 。证实了其对苏云金芽孢杆菌 、卵 黄色八叠球菌以及酸泡菜中分离的混合细菌有 很强的抑制作用[3 ] 。
研究中通过采用乙醇提取柚皮中的活性成 分 (主要为柚皮黄酮) ,选择了几种细菌 、霉菌 , 对柚皮提取物的抑菌作用进行了初步的研究 , 旨在为我国柚子的综合开发利用提供理论依 据。
1 材料与方法
111 材 料 柚皮提取物 :自制 ,总黄酮含量为 1019 %。 葡萄柚原液 :湖北庆生堂医药集团有限公
入已灭菌置 45 ℃下恒温的培养基 10 ～12 mL
(每次实验平皿中培养基倒入量应保持一致) ,
晃动平皿使混合液充分散开 ,均匀分布到平皿
上 ,待培养基凝固后 ,置 37 ℃培养箱中培养 1～
2 d 观察菌落生长情况 ,并对菌落计数 。以下式
计算抑菌率 :
抑菌率 (
%)
=
空白皿菌落数 - 样品皿菌落数 空白皿菌落数