三代测序技术的比较
第三代测序技术
第三代测序
◦ 另一类非Sanger 原理的DNA 测序技 术在 2008 年成为现实，这类基于单 个分子信号检测的 DNA 测序被称为 单分子测序 (single molecule sequencing, SMS) ，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS) 。 据预测， SMS 将比 NGS 具有更快的 速度和更低的成本，从而使研究人 员能够实现目前无法进行的研究工 作。尽管从现在的进展来看， SMS 还未能完全实现预期目标，但已经 做出了许多重要的努力。这些新技 术包括 Helicos 的 tSMS ， PacBio 的 SMRT， Oxford 的 Nanopore 以及其 它一些尚处于实验室阶段的技术， 如电镜测序，蛋白质晶体管测序等 等。
dna测序时不需要经过pcr扩增实现了对每一条dna分子的单独测一一第三代测序技术的出现第三代测序技术的出现二二第三代测序技术原理第三代测序技术原理三三第三代测序技术特点第三代测序技术特点四四三代测序技术的比较三代测序技术的比较五五第三代测序技术的应用第三代测序技术的应用第四代测序技术第四代测序技术一一第三代测序技术的出现第三代测序技术的出现自从2006年第一台454gsflx测序平台上市以来基于非sanger测序原理的第二代高通量测序nextgenerationsequencingngs技术迅速成为了基因组学研究的重要工具其中包括illuminasolexaabisolidroche454以及lifetech的半导体测序仪iontorrentpgmproton
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固态纳米孔测序法
虽然α溶血素七聚体相当不错，但用于悬浮纳 米孔的磷脂双分子层并不稳定且难以操控。固 体或是人造纳米孔被认为是下一代纳米孔技术 一方面因为它们无需使用有机材料做支撑物， 而主要是它们更加稳定。固态纳米孔还能在单 个设备上平行地多重使用，这是生物纳米孔无 法达到的。人造纳米孔组装在固态物质上，如 氮化硅，硅或金属氧化物，及最近使用的石墨 烯。石墨烯是一种新的单原子厚度的材料，是 所知的最薄的膜。宾夕法尼亚大学的Marija Drndic小组发表了DNA通过石墨烯膜纳米孔的 检测实验，该膜的厚度为1 - 5纳米，纳米孔的 直径为5 - 10纳米。
质谱测序 第三代测序
第三代测序技术与质谱测序技术的介绍和比较质谱蛋白测序质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。
一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。
二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。
PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。
由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。
用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。
但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。
得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。
主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子, 如a-x,b-y,c-z 。
最常见的是a 型离子、b 型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。
将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。
质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。
此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
一代、二代、三代测序技术
三代基因组测序技术原理简介摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和 ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。
DNA测序技术的革新
DNA测序技术的革新DNA测序技术自从上世纪70年代问世以来，一直是生命科学和医学领域的重要工具。
它的革新不仅对我们认识基因组和遗传学提供了新的突破，还在医学诊断、药物研发等方面发挥着重要作用。
随着科技的进步和基因组学的快速发展，DNA测序技术也不断得到改进和创新，进一步推动了生物医学科学的发展。
一、第一代测序技术的革新第一代DNA测序技术也称为链终止法测序，是由Frederick Sanger于1975年发明的。
它利用化学方法标记DNA分子上的碱基，并通过酶的作用将DNA分子复制成多个片段。
然后，通过电泳分离不同长度的DNA片段，便可测定DNA序列。
然而，第一代测序技术存在测序速度慢、成本高和仅能测定较短DNA片段等缺点。
为了解决这些问题，科学家们进行了大量的研究和改进。
二、第二代测序技术的革新第二代DNA测序技术的出现颠覆了第一代技术的局限性。
其中最具代表性的就是Illumina公司的测序平台。
Illumina公司的测序仪利用测序芯片，通过同时测定数百万个DNA片段，大大提高了测序效率。
同时，其采用的“桥式扩增”技术也解决了第一代技术只能测定较短DNA片段的问题。
这些创新让DNA测序技术的成本和时间大大降低，为大规模的基因组项目提供了可行的手段。
三、第三代测序技术的革新基于第二代测序技术的成功，科学家们进一步探索和改进了DNA测序技术。
于是，第三代DNA测序技术应运而生。
第三代技术的最大特点是实现了单分子测序，即不需要像第二代技术那样将DNA片段复制成多个片段。
通过使用纳米孔、合成孔等先进的装置，可以直接测定单个DNA分子的序列。
这种技术的革新大大提高了测序速度，同时也便于测序复杂的基因组和发现基因组结构的变异。
四、DNA测序技术革新的应用DNA测序技术的革新给生命科学和医学研究带来了巨大的影响。
首先，在基因组学领域，通过高通量测序技术，可以快速测定整个生物的基因组序列，深入研究基因之间的相互作用和调控机制。
三代测序
第一代测序技术1977年，Sanger发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法（chainter⁃minatorsequencing）和A.M.Maxam和W.Gilbert 报道的DNA化学降解测序法(chemicaldegradationse⁃quencing)为代表的第一代测序技术诞生，但由于化学降解法的程序复杂，后来逐渐被Sanger测序法代替。
Sanger测序法原理：双脱氧核苷酸没有3′-OH，且DNA聚合酶对其没有排斥性。
当添加放射性同位素标记的引物时，在聚合酶作用下ddNTP被合成到链上，但其后的核苷酸无法连接，合成反应也随之终止，后续再根据各个合成片段的大小不同进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后，便可根据片段大小排序及相应泳道的末端核苷酸信息读出整个片段的序列信息。
通过调节加入的dNTP和ddNTP的相对量即可获得较长或较短的末端终止片段。
一代测序的特点：速度快，但是一次只能测一条单一的序列，且最长也就能测1000-1500bp。
所以被广泛应用在单序列测序上。
在小型的细菌基因组测序、质粒测序、细菌人工染色体末端测序、突变位点验证等研究领域中较为常见。
第二代测序技术第二代测序技术也称为新一代测序技术NGS(Next Generation Sequencing)，相比第一代测序技术，总体往高通量、低成本方向发展。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列。
其特点是能一次并行几十万到几百万条DNA分子的序列测定，且一般读长较短。
通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库）富集了这些DNA片段。
接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。
最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一、初现庐山真面目——一代测序：又称Sanger测序（多分子，单克隆）历史：第一代DNA测序技术（又称Sanger测序）在1975年，由Sanger等人开创，并在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长5375个碱基。
研究人员经过30年的实践并对技术及测序策略的不断改进（如使用了不同策略的作图法、鸟枪法），2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
二、江山辈有人才出——二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但其测序成本高通量低等缺点，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及。
经过数据不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。
1、Illumina 原理：桥式PCR 4色荧光可逆终止激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DNA片段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。
而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。
2、Roche 454油包水PCR 4种dNTP车轮大战检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油独立PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。
第三代DNA测序技术的原理及应用
第三代DNA测序技术是近年来生物学领域的一项重大突破，它的原理和应用在基因研究和生物科学中具有重要意义。
本文将深入探讨第三代DNA测序技术的原理，并分析其在不同领域的应用。
1. 引言DNA测序技术是生物学研究中最基础、最重要的工具之一。
传统的第一代和第二代DNA测序技术虽然有着高效和准确的特点，但在测序速度、数据质量和测序长度方面存在一定的局限性。
而第三代DNA测序技术的出现，为我们提供了更高的测序速度、更长的测序读长和更低的测序成本。
2. 原理第三代DNA测序技术的原理与传统技术有所不同。
它不再依赖于离散的信号和化学反应，而是通过直接读取单个DNA分子中的碱基序列来实现测序。
下面将介绍几种常见的第三代DNA测序技术原理及其特点。
2.1 单分子实时测序技术单分子实时测序技术是第三代DNA测序技术中的一种重要方法。
它利用了DNA链的线性自我扩增特性，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
这种方法具有实时性好、测序速度快、数据产量高的优点，适用于高通量测序和长读长要求的研究。
2.2 纳米孔测序技术纳米孔测序技术是一种基于离子传导原理的第三代DNA测序方法。
它使得DNA分子能够通过纳米孔的通道，并且依据碱基的化学特性在电流传导上产生差异，从而实现测序。
这种方法具有高速度、低成本和无需扩增的特点，适用于快速测序和实时监测。
2.3 光学测序技术光学测序技术是第三代DNA测序技术中的又一种重要方法。
它利用了荧光染料的性质和光信号的检测来实现测序。
通过将DNA分子与特定的荧光染料标记，然后在测序仪器中激发并检测荧光信号，从而获取对应的碱基信息。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于复杂样品和高标准的测序要求。
3. 应用第三代DNA测序技术在生物学研究和医学领域的应用十分广泛，下面将介绍几个典型的应用案例。
3.1 基因组测序第三代DNA测序技术在基因组测序中具有重要意义。
其高通量、长读长和低成本的特点使得科学家们能够更快地完成全基因组的测序工作，并且能够检测到一些传统方法难以观察到的基因变异。
三代测序技术的比较
一代、二代、三代测序技术张祥瑞2013/04/22 11:43第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
三代测序技术的应用以及与二代技术的比较
微生物组
无需打断、无需组装，转录本直接反转录得全长cDNA
平均读长15K，无需PCR，均匀覆盖基因组
测序同时直接检测各种碱基修饰、脉冲间隔持续时间IPD不同来识别
快速获得基因组完成图
根据长度不同，会建600bp（Hiseq测）【HGAP、MHAP、Falcon】
Params.xml
二代、三代测序平台比较
三代测序技术
二代测序技术
A经PCR扩增后形成分子簇，变合成边测序
测序对象
单分子DNA
PCR扩增后的DNA分子簇
测序读长
平均15K，最长45K
PE150、PE300
测序准确率
单次测序准确率87.5%，测序深度15X准确度达到Q40，30X达到Q50
通常Q30
通量
一个run(8个SMRT cell) 8G
一个Lane 60G [Hiseq PE150]
一个Lane 15G[Miseq PE300]
代表
PacBio、Oxford Nanopore
三代测序也叫单分子实时测序（SMRT），PacBio SMRT技术，不需要进行PCR扩增，具备超长读长、高准确率、高敏感性、无GC偏向性和直接检测修饰碱基等特点，能解决二代测序的海量数据拼接困难、稀有突变被淹没、高GC区域无法跨越、高重复片段无法准确测定的困扰。
三代测序应用范围
全长转录组
全基因组De novo
Hiseq、Miseq
基因组组装
二代补洞、三代辅助组装提升contig N50；IRYS光学图谱，提升Scaffold N50到染色体水平【将Scaffold N50再浓缩提升延长】
读长较短，只能组做表达鉴定（可以检测低丰度、同源基因、超家族基因或等位基因表达的转录本
基因诊断中测序技术的应用及优缺点
陈跃龙 楚雄医药高等专科学校基因诊断中测序技术的应用及优缺点腺嘌呤与胸腺嘧啶（T）和胸腺嘧啶（T）相似，但与其他核苷酸相比，T在环糊精中的滞留时间为3倍。
胞嘧啶（G）和停留时间也不同。
因此，每个基因和当前的干扰幅度是唯一的。
此外，由于C-甲基化在环糊精中的停留时间大约为正常C停留时间的2倍之久，所以C-纳米孔单分子序列的甲基化可以以99.9%的准确度直接读出，而无需重复测序孔快速去除。
测序技术的发展及其优缺点DNA测序是基因诊断史上具有里程碑意义和划时代意义的技术革命，被称为基因诊断的黄金标准。
桑格在1977年发明了基因测序技术以来，基因测序技术诞生已经有40多年，它广泛应用于遗传病的基因诊断和产前/植入前诊断，特别是单基因疾病。
2007年，罗氏公司伊利米纳公司和ABI公司发明了高通量测序技术，即下一代测序技术。
然而，测序技术的发展至今仍未停止，以单分子实时测序和纳米孔技术为标志的第三代测序新产品也进入了历史阶段。
优点。
（1）DNA聚合酶的反应迅速，能较好地实现基本的测序技术，可在1秒内测量10个核苷酸。
测序速度为化学测序的速度的二万倍。
（2）DNA聚合酶反应具有持续性，可以进行长时间的基因测序，这种技术可以用来测量数千个碱基。
高精度，高达99.999999%。
这将大大减少体外转录。
（3）基因聚合酶能够测出不同基因序列，基于时间差异，可以确定模板C是否被甲基化。
可以获得许多重要的突变，节省项目成本。
（4）挖掘DNA突变和来源的频率，验证率很高。
（5）基因测序技术能够有效的预防癌症的发生。
（6）区分正常和癌症遗传变异水平。
（7）基因组测序，因为它读取时间长，可以精确预测癌细胞的减少数量。
在基因组测序中，重叠群测序重叠群（重叠后）显着减少了随后的基因组装配和注释的工作量，节省了大量时间。
它比NGS快得多。
因此，基因组测序和表征被广泛用于细菌和病原体。
单分子测序的优点在突变或SNP鉴定的病理学检测中是无与伦比的。
二三代测序技术的介绍和比较
目录
I. 测序技术发展 II. 二代测序 III. 三代测序 IV. 应用
二代和三代测序技术的比较
测序技术发展
1925
DNA是 遗传物
质
1953
DNA双 螺旋
1966
遗传密 码
1977
化学降解 和
Sanger 测序
1986
第一台 自动测 序仪
1998
第一台 全自动 测序仪 3700
二代和三代测序技术的比较
三代测序—Ion Torrent
Ion Torrent是一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术。
基本特 原点 理
当➢ D不N需A要聚昂合贵酶的把物核理苷成酸像聚等合设到备延，伸成 中的本D相N对A较链低上，时体，积会小释，放操出作一简个单氢； 离➢ 子快，速反，应除池了中2天的文PH库发制生作改时变间，，位整 于池个下上的机离测子序感可受在器2-感3.受5小到时H内+离完子成； 信➢ 号不，过H整+个离芯子片信的号通再量直并接不转高化，为目数前 字信是号10，G从左而右读，出适D合N小A基序因列组。和外显
因组的试剂成本最低
困难；仪器昂贵
太平洋生物科 学公司
PacBio
SMRT
实时单分子DNA测 序
荧光/光学
~1000
并不能高效地将DNA聚合酶加到
高平均读长，比第一代的测序时间 测序阵列中；准确性一次性达标的
降低；不需要扩增；最长单个读长 机会低（81-83%）；DNA聚合酶
接近3000碱基
在阵列中降解；总体上每个碱基测
2005
2006
Roche4 54
Illumin a
Solexa GA测序
一代、二代、三代基因测序技术的发展历史及应用
备注：数据来源于罗氏官网和网络
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
ABI/SOLiD技术原理： SOLiD测序技术也是采用油包水的方式进行Emulsion PCR。
不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多， 只有1μm大小，用连接酶替代了常用的DNA聚合酶。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
① Ion Torrent测序芯片，是一块半导体芯片； ② 孔即是测序微珠的容器，又同时是一个微型的PH计。 ③ 4种dNTP依次流过Ion芯片； ④ 发生聚合反应产生H+引起PH变化，被传感器记录下来。 每个碱基的检测只需要几秒钟。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
读长
2x150bp 2x150bp 2x300bp
台式测序 2x150bp
台式测序/大规 模
2x150bp
大规模 测序
2x250bp
大规模 测序
2x150bp
测序通量 1.2Gb 7.5Gb
15Gb
120Gb
330Gb
6000Gb
16Tb
最大reads数 4M
25M
25M+
运行时间 9.5-19h 4-24h
4-55h
400M 12-30h
1.1B+ 11-48h
200亿 13-44h
260亿（单） 520亿（双）
13-48h
二代测序的技术平台——华大智造
华大基因先推出了BGISEQ-500桌面化测序系统， 之后又推出： BGISEQ-50、 MGISEQ-200、 MGISEQ-2000均取得了NMPA（原CFDA）认证， 还推出了MGISEQ-T7， 2022年10月推出DNBSEQ-T10x4、DNBSEQ-T7高通量测 序仪。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代DNA测序技术，相对于第一代和第二代DNA测序技术，它具有更高的测序速度、更低的成本和更高的基因组分辨率。
三代测序技术在遗传学、生物学和医学研究等领域中起着重要的作用。
本文将对三代测序原理和技术进行详细比较。
第一代测序技术，又称为经典测序技术，是20世纪70年代末到80年代初出现的。
代表性的方法包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。
这些方法都是基于DNA链延伸原理进行测序，通常需要大量的模板DNA和特定的剪切酶。
优点是准确性高，读长长，可达到1000到2000个碱基。
缺点是测序速度慢，成本高，并且需要大量的模板DNA。
第二代测序技术，也称为高通量测序技术，是在21世纪初出现的。
代表性的方法包括454测序、Illumina测序和SOLiD测序。
这些方法都是基于DNA扩增和测序的原理进行测序，通常需要少量的模板DNA。
优点是测序速度快，成本低，并且可以实现高通量测序。
缺点是读长短，通常只能达到几百个碱基，而且对于GC含量高的区域有较大的偏倚。
第三代测序技术，又称为单分子测序技术，是在2005年之后出现的。
代表性的方法包括Pacific Biosciences (PacBio)测序、Oxford Nanopore Technologies (ONT)测序和Helicos测序。
这些方法都是基于单分子测序的原理进行测序，通常只需要少量的模板DNA。
优点是读长极长，可以达到数万个甚至数十万个碱基，对于复杂基因组和长读长测序有很大的优势。
此外，这些方法不需要扩增和特定的剪切酶，因此可以避免偏倚。
缺点是准确性相对较低，错误率较高。
在三代测序技术中，PacBio测序和ONT测序是目前较为成熟和广泛应用的两种方法。
PacBio测序原理是利用DNA聚合酶在测序过程中释放出的荧光信号进行测序。
当DNA聚合酶在DNA模板上合成新的DNA链时，会引起荧光信号的变化，从而实现碱基的识别和测序。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代高通量测序技术，相对于第一代和第二代测序技术，它具有更高的速度、更低的成本以及更高的准确性。
目前，主要的三代测序技术包括单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序。
下面将分别介绍这三种技术的原理和特点。
单分子测序是三代测序技术的一种，它的原理是将DNA分子直接放在一个测序装置中，通过对DNA的碱基进行逐个测序以获得DNA序列。
单分子测序技术的一大特点是能够直接对DNA进行测序，不需要进行PCR扩增和片段化等传统测序方法中的预处理步骤，因此可以减少实验时间和所需样本量。
目前，常见的单分子测序技术有SMRT（Single-Molecule Real-Time）和Nanopore（纳米孔）测序。
SMRT技术是一种可以实现单分子实时测序的技术，它利用专门设计的测序装置以及特殊的引物和酶来进行测序。
测序装置中有一个高密度排列的微小孔，每个孔中有一个DNA聚合酶复合物和一个荧光基团，当DNA碱基与引物配对时，聚合酶会添加一个荧光基团，同时释放出荧光信号，这个过程可以被装置中的摄像机捕捉到。
通过观察荧光信号的强度和持续时间，就可以推断一些位置的DNA碱基是什么。
SMRT技术的优点是测序速度快、准确性高，但缺点是数据处理复杂，读长相对较短。
纳米孔测序是一种利用纳米孔测序装置对DNA分子进行测序的技术。
纳米孔是一种非常细微的孔道，通常直径在1-2纳米之间，只能通过单个DNA分子的一条链。
当DNA分子通过纳米孔时，其碱基会对应产生电信号，通过测量电信号的特性，可以推断DNA序列。
与其他测序技术相比，纳米孔测序的优势主要在于测序速度快、设备小巧、易于存储和传输，并且具有较长的读长和较低的测序成本。
然而，纳米孔测序技术也存在一定的误读和错配率等问题需要改进。
综上所述，三代测序技术相对于传统的测序技术具有更高的速度、更低的成本和更高的准确性。
单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序是目前主要的三代测序技术，它们各具特点，适用于不同的测序需求。
第三代测序技术及其应用
第三代测序技术及其应用一、本文概述随着科技的飞速发展，测序技术已成为生物学、医学等领域的重要工具。
自第一代和第二代测序技术问世以来，它们在基因组学、转录组学、表观组学等领域发挥了巨大作用。
然而，随着研究的深入和技术的需求，第三代测序技术应运而生，以其独特的优势在多个领域展现出广阔的应用前景。
本文旨在全面介绍第三代测序技术的基本概念、原理、特点及其在各领域的应用。
我们将从技术的起源和发展入手，详细阐述第三代测序技术的核心原理和技术优势，包括长读长、高准确性、低成本等特点。
我们还将深入探讨第三代测序技术在基因组测序、转录组分析、疾病研究、农业生物技术等方面的实际应用案例，展望其未来的发展方向和潜力。
通过阅读本文，读者将对第三代测序技术有一个全面的了解，能够掌握其基本原理和应用领域，为相关领域的研究和实践提供有益的参考和借鉴。
二、第三代测序技术概述随着生物科技的飞速发展，测序技术作为生命科学领域的一项革命性技术，已经经历了两代重要的变革。
第一代测序技术，即Sanger 测序，以其高精度和准确性在基因组测序中发挥了重要作用，但其通量低、成本高的缺点限制了其在大规模基因组测序中的应用。
第二代测序技术，即高通量测序（Next-Generation Sequencing，NGS），以其高通量、低成本的优势，极大地推动了基因组学、转录组学等领域的研究。
然而，第二代测序技术仍然存在读长较短、数据解读复杂等问题。
在此背景下，第三代测序技术应运而生，以其超长读长、高准确性和实时测序的特点，为基因组学研究带来了新的突破。
第三代测序技术，也被称为单分子测序技术，主要包括单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time Sequencing，SMRT）和纳米孔测序（Nanopore Sequencing）两种主要类型。
SMRT技术利用荧光标记的单分子DNA为模板，通过实时检测荧光信号的变化来读取DNA序列，具有读长可达数万碱基的特点，使得研究者能够直接获取到完整的基因序列信息。
一代、二代、三代测序技术
一代、二代、三代测序技术(2021-01-22 10:42:13)转载▼第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先创造。
其根本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂〔双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂〕通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行别离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反响分四组进行，每一组分别用四种ddNTP〔双脱氧核苷酸〕中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台〔massively parallel DNA sequencing platform〕的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权〞能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD 测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的根本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的根底上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
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一代、二代、三代测序技术
张祥瑞
2013/04/22 11:43
第一代测序技术-Sanger链终止法
一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred San ger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸
在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上
没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA莫板分子结合后，DNA R合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一
组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAG吩析四组样品。
从得到的PAGE交上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序
大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform ）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于
人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Scienee 公司的454基因组测序仪、美国Illumina 公司和英国Solexa techno logy 公司合作开发的Illumi na 测序仪、美国Applied Biosystems 公司的SOLiD测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger 等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待
测DNA勺序列信息。
以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。
用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。
然后将川umina测序接头与片段连接。
（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。
芯片有8个纵向泳道的硅基片。
每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。
上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成
单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。
通
过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
（3）测序，分三步：DNA 聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。
（4）数据分析
第三代测序技术-高通量、单分子测序
被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscienee 的SMR■技术和
Oxford Nan opore Tech nologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着
高通量低成本长读取长度的方向发展。
不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代分子测序，不需要进行PCR T增。
（1）Helico BioScience单分子测序技术。
该测序是基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在3'末端加上poly（A）,以及在
poly（A）的末端进行荧光标记和阻断，把这些小片段与带有poly（T）的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置，建立边合成边测序的位点加入聚合酶和被Cy3荧光标记脱氧核苷酸进行DNA合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，直接对Cy3成像，观测模板位点上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反应。
（2）Pacific BioscienceSMRTT 技术。
该测序也是基于边合成边测序的原理，这项技于使用了
Zero-ModeWaveguide（ZMW）零级波导）。
测序的过程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并释放，
聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。
（3）Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术。
大多数纳米孔测序技术的基本原理是当DNA分子或者它的组成碱基从一个孔
洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。
OxfordNanopore测序技术是以a -
溶血素来构建生物纳米孔，核酸外切酶依附在孔一侧的外表面，一种合成的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔的内表面。
这个系统被镶嵌在一个脂双分子层内，为了提供既符合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件，脂双分子层两侧为不同的盐浓度在适合的电压下，核酸外切酶消化单链DNA单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂的相互作用，影响了流过纳米孔原本的电流，腺嘌呤
与胸腺嘧啶的电信号大小很相近，但胸腺嘧啶在环糊精停留是时间是其他核苷
酸的2-3倍，所以每个碱基都因其产生电流干扰振幅是特有的而被区分开来。
不同代测序方法的原理、发展和应用
摘要：
目前为止，已经发展出了三代不同的测序技术。
第一代测序技术具有较长的测序片段和高准确率，在人类基因组计划中发挥了极大的作用。
第二代测序技术实现了高通量、高效率、高准确度，大大降低了测序成本。
第三代测序技术即纳米孔单分子测序技术，实现了对每一条DNA分子的单独测序，有着更快的数据读取速度，应用潜能也势必超越先前的测序技术。
关键词：测序技术，高通量
目前为止，已经发展出了三代不同的测序技术，这些测序技术具有不同的原理和特点，因此其适用范围也不同。
1、第一代测序技术
1975年Sanger和Coulson 发明了“ Plus and Minus”（俗称“加减法”）测定DNA序列；1977年Maxam and Gilbert发明了化学降解法测序；1977年San ger引入ddNTP（双脱氧核苷三磷酸），发明了著名的双脱氧链终止法。
双脱氧链终止法有效控制了化学降解法中化学毒素和同位素的危害，在随后的二十多
年得到很好的应用。
这些技术及在此基础上发展的相关技术统称为第一代测序技术。
第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，尤其在人类基因组计划中发挥了极大的作用和进行了发展。
但第一代测序技术成本昂贵，而且难以胜任微量DNA羊品及大规模高通量测序工作的要求。
2、第二代测序技术
随着人类基因组计划的完成，人们开始进入后基因组时代。
科学家逐渐测出多种生物的序列，传统的测序技术已无法满足高通量和高效率的大规模基因组测序, 第二代DNA测序技术就诞生了。
第二代测序技术实现了高通量、高效率、高准确度，大大降低了测序的成本，DNA测序可以向个人测序发展。
第二代测序技术中，454序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。
Solexa较454具有通
量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。
Solexa双末端测序（paired-end sequencing）可以为基因组进一步拼接提供定位信息，但是随着反应轮数增加，序列长度和质量均有所下降，而且在阅读AT区时有明显错误倾向。
SOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特别是SNP检测等，但是测序的片段短限
制了该技术在基因组拼接中的广泛应用。
3、第三代测序技术
随着在遗传学研究中，成千上万的基因组需要测出及分析，高通量的第二代测序技术还是面临成本高、效率低、准确度不是很高等问题，第三代测序技术已经开始崭露头角，即基于纳米孔（nan opore）的单分子测序技术（见下图）。
第三代测序技术真正实现了对每一条DNA分子的单独测序，有着更快的数据读取速度，应用潜能也势必超越先前的测序技术。
但是目前第三代测序技术目前还在开发阶段，尚未正式大量投入使用。