实时荧光定量
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• 针对样品选用一款合适的RNA提取试剂盒 • 取相同量的组织或细胞提取总RNA • 提取的总RNA常混有基因组DNA，可以通过DNase处理去除或跨内含子
引物设计避免基因组DNA扩增 • RNA电泳检测降解情况 • Nanodrop测定RNA浓度和纯度（OD260/280≥2，OD260/230≥2） • 取相同量的RNA（如1ug）做反转录 • RNA易降解，而cDNA可于-20℃保存很久
– 荧光探针法（特异性） TaqMan probe Cycling probe ……
非特异性的荧光嵌合法 —— SYBR Green I
• SYBR Green I是一种能够结合于所有双链DNA小沟中的荧光染料，SYBR与PCR合成DNA双链结 合后，发射荧光信号，而游离的 SYBR 不会发射荧光信号，因此荧光信号的增加与PCR产物 的增加完全同步
一 实验设计，材料处理，取材冻存（-80℃）
对照组 Control
12h 6h 3h 0h 重复1 重复2
重复3
对照组
0h
#1
#2
#3
3h
#4
#5
#6
6h
#10
#11
#12
12h
#16
#17
#18
菌检健康的癌细胞
处理组 Drug1
12h 6h 3h
重复1 重复2 重复3
处理组
#7
#8
#9
#13
#14
肿瘤
正常
• 绝对定量 • 相对定量
绝对定量
• 将已知浓度的标准品进行梯度稀释，进行Real Time PCR,会得到一系列等间隔的扩增曲 线。以它们的Ct值作横坐标，初始DNA量的对数值为纵坐标，作图得到标准曲线，未知浓 度的样品进行Real Time PCR,得到Ct值，代入标准曲线，可以样品的初始DNA量。
• 试剂：RNA提取试剂盒，cDNA反转录试剂盒（≥21次反应），SYBR mix（ ≥21×2次反应）等
• 耗材：枪头，EP管等（无RNase处理），96/384孔版，透明薄膜，冰 及冰盒等
• 仪器：枪，离心机，Nanodrop核酸浓度测定仪，核酸电泳仪，荧光定 量PCR仪等
四、RNA提取，质量与浓度检测，反转录成cDNA
• 优点：特异性强，能进行多重PCR • 缺点：需设计特异性探针，成本较高 • 适用：区别同源性高的序列，SNP解析等多重PCR检测
Real Time PCR 的数学定量原理
C(t)值
阈值
C(t)值
18.12 +/- 0.04
• 重要术语: • 阈值（ Threshold ）：在扩增曲线指数增长期设定的荧光检出界限（第3～15
• 优点：简单易行，成本较低 • 缺点：与非特异性产物结合，不能进行多重PCR • 适用：不同样本同一基因相对表达量分析
特异性荧光探针法 —— TaqMan probe
• Taqman 探针是一段与目的基因配对的DNA序列，5‘端加荧光物质，3‘端加淬灭物质，完整探针 5‘端的荧光物质被3‘端淬灭物质抑制，不发荧光，当PCR合成DNA，退火时探针和DNA配对，延伸 时，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，将探针分解， 5‘端荧光物质游离出来，发出荧光，检 测荧光强度，表征PCR扩增的DNA量。
实时荧光定量 PCR:扩增DNA，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一 个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析
Y0 ×2 ×4 ×8 ×16…… Y0 ×2n
扩增曲线 平台期
背景期
线性增长期 对数增长期
Real Time PCR 的荧光化学检测原理
– 荧光嵌合法（非特异性） SYBR Green I
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始DNA量对数---Ct循环数标准曲线
• 绝对定量通过标准曲线确定初始DNA/RNA基因拷贝数或浓度，通常用于病毒，病原菌的定 量检测即转基因食品食品的检测。
相对定量
• 比较不同样本之间基因表达量的高低变化，需要做相对定量。 • 相对定量引入内参基因，即维持细胞基本代谢活动所必需的基因，其表达量在不同的
实时荧光定量
内容
• Real-time PCR 原理 • Real-time PCR 用途 • Real-time PCR 实验
Байду номын сангаас
PCR 原理
常规PCR：扩增DNA，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
变性
退火
延伸
Y0 ×2 ×4 ×8 ×16…… Y0 ×2n
Real-time PCR 原理
个循环的荧光信号标准偏差的10倍） • C(t)值（Cycle of threshold）：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的
扩增循环次数
Real Time PCR 的数学定量原理
• 初始DNA量越多，越早达到阈值， 扩增曲线越早起峰，Ct值越小
• 经数学理论证明，初始DNA量的对 数值与循环数/Ct呈反比线性关系
• 定量分析:
• 绝对定量:
• 病毒和病原菌定量; • 基因拷贝数分析; • 转基因定量分析
• 相对定量:
• 基因表达量分析
基因表达的中心法则
Real-time PCR 实验 ——以癌细胞药物处理后不同时间点某基因表达量的变化为例
• SYBR green 1 的相对定量法： • 一、实验设计，材料处理，取材冻存 • 二、目的和内参基因的选择及引物设计 • 三、准备试剂与耗材，预约仪器 • 四、RNA提取，质量与浓度检测，反转录成cDNA • 五、按反应体系准备样品 • 六、上机设定反应条件，运行程序进行反应 • 七、溶解曲线分析荧光信号产生的特异性 • 八、获得数据，计算分析结果并做图
#15
#19
#20
#21
二 目的和内参基因的选择及引物设计
• 目的基因的选择：根据实验目的 • 内参基因的选择： • 维持细胞基本代谢活动所必需的基因，如GAPDH，Actin，18S rRNA等 • 通过查文献或实验筛选
• 引物设计注意事项：
引物设计软件 Oligo 7
三、准备试剂，耗材，预约仪器
细胞里基本一样，在扩增目的基因的同时扩增内参基因，用不同样本的目的基因的扩 增量与各自内参基因的扩增量的比值对目的基因表达量进行均一化后，再比较高低， 可以对不同样本间细胞起始数，RNA提取效率，基因扩增效率的不同进行矫正。
Real-time PCR 用途
• 定性分析:
• 病毒和病原菌检测; • 单核苷酸多态性（SNP）检测; • 物种鉴定
引物设计避免基因组DNA扩增 • RNA电泳检测降解情况 • Nanodrop测定RNA浓度和纯度（OD260/280≥2，OD260/230≥2） • 取相同量的RNA（如1ug）做反转录 • RNA易降解，而cDNA可于-20℃保存很久
– 荧光探针法（特异性） TaqMan probe Cycling probe ……
非特异性的荧光嵌合法 —— SYBR Green I
• SYBR Green I是一种能够结合于所有双链DNA小沟中的荧光染料，SYBR与PCR合成DNA双链结 合后，发射荧光信号，而游离的 SYBR 不会发射荧光信号，因此荧光信号的增加与PCR产物 的增加完全同步
一 实验设计，材料处理，取材冻存（-80℃）
对照组 Control
12h 6h 3h 0h 重复1 重复2
重复3
对照组
0h
#1
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菌检健康的癌细胞
处理组 Drug1
12h 6h 3h
重复1 重复2 重复3
处理组
#7
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#9
#13
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肿瘤
正常
• 绝对定量 • 相对定量
绝对定量
• 将已知浓度的标准品进行梯度稀释，进行Real Time PCR,会得到一系列等间隔的扩增曲 线。以它们的Ct值作横坐标，初始DNA量的对数值为纵坐标，作图得到标准曲线，未知浓 度的样品进行Real Time PCR,得到Ct值，代入标准曲线，可以样品的初始DNA量。
• 试剂：RNA提取试剂盒，cDNA反转录试剂盒（≥21次反应），SYBR mix（ ≥21×2次反应）等
• 耗材：枪头，EP管等（无RNase处理），96/384孔版，透明薄膜，冰 及冰盒等
• 仪器：枪，离心机，Nanodrop核酸浓度测定仪，核酸电泳仪，荧光定 量PCR仪等
四、RNA提取，质量与浓度检测，反转录成cDNA
• 优点：特异性强，能进行多重PCR • 缺点：需设计特异性探针，成本较高 • 适用：区别同源性高的序列，SNP解析等多重PCR检测
Real Time PCR 的数学定量原理
C(t)值
阈值
C(t)值
18.12 +/- 0.04
• 重要术语: • 阈值（ Threshold ）：在扩增曲线指数增长期设定的荧光检出界限（第3～15
• 优点：简单易行，成本较低 • 缺点：与非特异性产物结合，不能进行多重PCR • 适用：不同样本同一基因相对表达量分析
特异性荧光探针法 —— TaqMan probe
• Taqman 探针是一段与目的基因配对的DNA序列，5‘端加荧光物质，3‘端加淬灭物质，完整探针 5‘端的荧光物质被3‘端淬灭物质抑制，不发荧光，当PCR合成DNA，退火时探针和DNA配对，延伸 时，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，将探针分解， 5‘端荧光物质游离出来，发出荧光，检 测荧光强度，表征PCR扩增的DNA量。
实时荧光定量 PCR:扩增DNA，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一 个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析
Y0 ×2 ×4 ×8 ×16…… Y0 ×2n
扩增曲线 平台期
背景期
线性增长期 对数增长期
Real Time PCR 的荧光化学检测原理
– 荧光嵌合法（非特异性） SYBR Green I
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始DNA量对数---Ct循环数标准曲线
• 绝对定量通过标准曲线确定初始DNA/RNA基因拷贝数或浓度，通常用于病毒，病原菌的定 量检测即转基因食品食品的检测。
相对定量
• 比较不同样本之间基因表达量的高低变化，需要做相对定量。 • 相对定量引入内参基因，即维持细胞基本代谢活动所必需的基因，其表达量在不同的
实时荧光定量
内容
• Real-time PCR 原理 • Real-time PCR 用途 • Real-time PCR 实验
Байду номын сангаас
PCR 原理
常规PCR：扩增DNA，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
变性
退火
延伸
Y0 ×2 ×4 ×8 ×16…… Y0 ×2n
Real-time PCR 原理
个循环的荧光信号标准偏差的10倍） • C(t)值（Cycle of threshold）：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的
扩增循环次数
Real Time PCR 的数学定量原理
• 初始DNA量越多，越早达到阈值， 扩增曲线越早起峰，Ct值越小
• 经数学理论证明，初始DNA量的对 数值与循环数/Ct呈反比线性关系
• 定量分析:
• 绝对定量:
• 病毒和病原菌定量; • 基因拷贝数分析; • 转基因定量分析
• 相对定量:
• 基因表达量分析
基因表达的中心法则
Real-time PCR 实验 ——以癌细胞药物处理后不同时间点某基因表达量的变化为例
• SYBR green 1 的相对定量法： • 一、实验设计，材料处理，取材冻存 • 二、目的和内参基因的选择及引物设计 • 三、准备试剂与耗材，预约仪器 • 四、RNA提取，质量与浓度检测，反转录成cDNA • 五、按反应体系准备样品 • 六、上机设定反应条件，运行程序进行反应 • 七、溶解曲线分析荧光信号产生的特异性 • 八、获得数据，计算分析结果并做图
#15
#19
#20
#21
二 目的和内参基因的选择及引物设计
• 目的基因的选择：根据实验目的 • 内参基因的选择： • 维持细胞基本代谢活动所必需的基因，如GAPDH，Actin，18S rRNA等 • 通过查文献或实验筛选
• 引物设计注意事项：
引物设计软件 Oligo 7
三、准备试剂，耗材，预约仪器
细胞里基本一样，在扩增目的基因的同时扩增内参基因，用不同样本的目的基因的扩 增量与各自内参基因的扩增量的比值对目的基因表达量进行均一化后，再比较高低， 可以对不同样本间细胞起始数，RNA提取效率，基因扩增效率的不同进行矫正。
Real-time PCR 用途
• 定性分析:
• 病毒和病原菌检测; • 单核苷酸多态性（SNP）检测; • 物种鉴定