DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
Develop the plate.
place the TLC plate in the developing container make sure the solvent is not too deep
In this photo, it is about The solvent will rise up the 3/4 of the way up the plate. TLC plate by capillary action. In this photo, it is not quite halfway up the plate.
荧光试剂 ——DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯 蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基 结合
DNS-aa发出黄绿色荧光
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物 DNS-OH，即：
在DNS-Cl过量时，会 产生DNS-NH2，即：
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光 DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光 →可彼此区分。
注意
（1）严格控制点样位置以及点样直径。 （2）展层时勿将点样浸入溶剂系统。
（3）展层后必须经电吹风将膜吹干。
（4）使用紫外照射时要注意使用时间短.
Procedure for TLC
1. Prepare the developing container. The developing container for TLC can be a specially designed chamber, a jar with a lid, or a beaker with a watch glass on the top:
吸附剂的吸附能力
常称为活度，用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、 Ⅴ表示。 活度 含水量 强 多 弱 少
聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法 实验报告
生物化学实验报告
题目：聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法
姓名：余振洋学号：200900140156系年级：09级生科3班
查阅资料得到以下几条结论：
1. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。
2.聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。
2. 展层速度要快，单析（ 7×7cm ）一般只需 15 -20min。
3. 不会将氨基酸或者聚酰胺薄膜破坏，影响其实验结果。
4．被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有差异。
5．展层剂的组成应该是固定的，因此配制时各组分比例要正确。
6．展层剂的纯度要注意，一般溶剂采用分析纯试剂即可，必要时可精制后使用。
同组者：张刚刚时间：2011/4/16
一．【实验目的】
1.了解并掌握DNS-氨基酸制备和鉴定的原理及方法。
2.掌握聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸的操作和方法。
二．【实验原理】
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（5-dimethylamino-1-naphthylene sulfonyl chloride，Dansyl ch1oride，简称DNS-Cl）在弱碱性（pH9.0 左右）条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成带黄色荧光的 DNS- 氨基酸。
生化实验三 Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法
实验四Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法实验目的1．学习聚酰胺薄膜层析法的原理。
2．学习利用Dansyl—氨基酸分析蛋白质N末端氨基酸及蛋白质组成的原理。
3．掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。
实验原理聚酰胺是一类化学纤维原料，又称锦纶或尼龙。
它对许多极性化合物有吸附作用，具有特异的分辨性能，可用于柱层析、薄层层析及薄膜层析。
聚酰胺薄膜是将锦纶涂布于涤纶片上，形成质地均匀的紧密的多孔薄膜，层析性能十分优良。
聚酰胺的化学结构如右。
由于聚酰胺的—C=O基及—NH基可与被分离物质形成氢键，因此可以吸附酸类、酚类、醌类、硝基及胺基化合物等。
由于各种物质与聚酰胺形成氢键的能力不同，即聚酰胺对各种物质的吸附能力不同。
而在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。
因此，选择适当的层层溶剂，可使各种待分离物质在聚酰胺表面与溶剂之间有不同的分配系数，经过吸附与解吸附的展层过程，各自按一定次序分离开来。
与纸层析及纸电泳等方法相比，聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物时具有灵敏度高、分辨力强、速度快、操作方便等优点。
除用于氨基酸衍生物的分析外，还可用于碱基、核苷酸、核苷、酚类、酚类糖苷、硝基化合物、杂环化合物、环酮、抗菌素、磺胺、合成染料等十几类化合物。
荧光试剂Dansyl—C1(二甲基氨基萘磺酰氯)可与氨基酸结合成带有荧光的Dansyl —氨基酸。
Dansyl—氨基酸在酸性条件下可被乙酸乙酯萃取出来，经聚酰胺薄膜层析后斑点集中，仅10—9至10—10克分子即可被检识，所以灵敏度很高。
用作蛋白质末端基分析，比DNP氨基酸纸层析法灵敏度高100倍；用于氨基酸组成的微量分析，比茚三酮显色法灵敏度高10多倍。
聚酰胺薄膜层析的展层速度也比纸层析快得多，单向层层7厘米只需15—20分钟。
但用于定量，需要特殊仪器，目前多用于定性鉴定。
Dansyl—C1能与所有的氨基酸作用生成具荧光的衍生物。
生物化学实验一 氨基酸聚酰胺薄膜层析DNS-Cl法
实验一氨基酸聚酰胺薄膜层析DNS-Cl法13生物基地 201300140059 刘洋 2015-03-24同组者：张奕一、实验目的1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定。
2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。
二、实验原理荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（dansyl-Cl，简称DNS-Cl）在弱碱性条件（pH9.0左右下与氨基酸（肽或蛋白质）的α-氨基结合成带有黄绿色荧光的DNS-氨基酸：其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。
将Edman法和DNS法结合起来（称为Edman-DNS法）应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH：在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2：DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug。
由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析工作中。
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速，从度移动而达到分离的目的。
聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成，又称锦纶66 。
因这类物质的分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。
它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的—C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。
薄层层析色谱(点板)PPT课件
吸附剂的吸附能力常称为活度，用罗马字 母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。
活度
减少
含水量
增大
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2、常用吸附剂 极性：氧化铝
硅胶 非极性：纤维素
聚酰胺：a.合成：己二酸、己二胺 b.特点：氢键吸附剂
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聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶 (又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合 而成的称锦纶66 。
因为在这类物质分子中都含有大量酰胺 基团，故统称聚酰胺。
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（二）溶剂 不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大小
各种溶剂的洗脱能力各不相同。 一般所选溶剂要求： a.纯度合格 b.黏度要小，易与样品中各组分相分离 c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应
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溶剂选择考虑因素： 1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力 2、溶剂与样品之间的作用因素 溶剂的选择可通过实验来确定。
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三、薄层层析的应用
（一）定性分析：将已知化合物作为标准品 与样品一起进行层析后对照，可初步确定 未知化合物的组成。
（二）定量分析：可直接在薄板上测定，无 须破坏薄层；
用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱， 再用其他方法测定。
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（三）临床生化上的应用 1.氨基酸的分离 2.核苷、核苷酸和核酸的分析
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2020/1/1
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Pour solvent into the beaker to a depth of just less than 0.5 cm.
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To aid in the saturation of the TLC chamber with solvent vapors, line part of the inside of the beaker with filter paper
DNS法分析蛋白质末端氨基酸
三、实验器材 ①紫外灯 ②烘箱 ③恒温箱 ④聚酰胺薄膜 ⑤层析缸
⑥吹风机
⑦毛细管。
四、材料与试剂 结晶胰岛素 0．2mol／LNaHC03 1mol／LNaOH 乙酸乙酯 DNS-C1丙酮溶液(25mg／mL) 6mol／LHCl 展层溶剂： 甲酸：水=1．5：100(V／V)(第一相) 苯：冰乙酸=9:l(V／V)(第二相)。
②DNS-胰岛素的水解和DNS-氨基酸的抽提：在 上述离心管内，加入0．2mL6mol／LHCl溶液，
使其溶解，转移到小安瓿管中，用火焰封口， 置110℃烘箱水解18h左右。水解后开管，真空 抽干或用吹风机吹干，加2滴0．2mol／ LNa2C03溶液，并用1mol／LHCl调pH至 2．0—2．5，加入5—6滴乙酸乙酯，稍微晃动， 安瓿管上层乙酸乙酯层内含DNS-末端氨基酸， 再用乙酸乙酯抽提2—3次，加入0．1mL丙酮 溶解，待用。
DNS法分析蛋白质末端 氨基酸
一、实验目的
学习用DNS法分析蛋白质及肽的N-末端， 掌握聚酰胺薄膜层析法的实际操作。
二、原理
蛋白质N-末端氨基酸的2-氨基与荧光试剂DNSCl(二甲氨基萘磺酰氯)反应后得到Dansyl-蛋白质(二甲 氨基萘-5磺氨酰蛋白)，经酸水解，得到Dansyl-氨基酸 和各种游离氨基酸。DNS-氨基酸在波长254nm或265nm的 紫外光照射下发出强烈的黄绿色荧光，并易于进行色谱 分离，用聚酰胺薄膜层析可测出含量仅为10-9-10-l0摩尔 的DNS-氨基酸，比FDNB(2，4—二硝基氟苯法)的灵敏度 高100倍左右。
③DNS-标准氨基酸的制备：由于已知胰岛素A、B 链的N-末端分别为甘氨酸和苯丙氨酸，因此将 标准甘氨酸和标准苯丙氨酸分别用0.2mol／ LNaHC03配成0.5mg／mL浓度的溶液，用lmol／ LNaOH调到pH9.0-9.5。用滴管取标准甘氨酸液 3-4滴装入安瓿管内，再取苯丙氨酸溶液3-4滴 装入另一小管中，在每个小管中加入等体积的 DNS-Cl丙酮液，摇匀，用胶布封口，置40℃温 箱保温1h。取出，蒸去丙酮，滴人lmol／L的 HCl液调pH2.0-2.5，加入乙酸乙酯5-6滴，稍晃 动，离心管上层乙酸乙酯层即含DNS-标准氨基 酸，再用乙酸乙酯抽提2—3次，蒸去乙酸乙酯， 加入0.1mL丙酮溶液，待用。
DNS-氨基酸的制备和鉴定
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法分离，所得层析图与 DNS-标准氨基酸层析图 谱相对比，可借此鉴定样品中氨基酸的种类，用此法鉴定蛋白质 N-端氨基酸比 FDNB 法灵敏 100 倍，仅10−10 ~10−9 mol 样品即可检出，产物也比 DNP-氨基酸稳 定，且操作简便、快速。 DNS-Cl 在 pH 过高时，水解产生副产物 DNS-OH，反应式如下：
DNS-氨基酸的制备和鉴定
刘翌 151140039
一、实验原理
1、聚酰胺是一类化学原料，又称锦纶（或尼龙） 。本实验所用的聚酰胺材料是已 二酸和乙二胺聚合成的锦纶 66，这类高分子物质中含有大量酰胺基团，故称为 聚酰胺。 聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶薄膜制成。毛面是锦纶，作为点样 面；光面是涤纶。 聚酰胺对很多极性物质具有吸附作用， 这是由于聚酰胺的-C=O 及-NH 能与被 分离物质的一定基团之间形成氢键，如酚类（包括黄酮类、鞣质等）和酸类（如 核苷酸、氨基酸等）是羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质 与酰胺键的氨基形成氢键。 被分离物质形成氢键能力的强弱，决定吸附能力的差 异。 2、荧光试剂 5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（DNS-Cl）在弱碱性（pH9.0 左右）条件下 可与氨基酸的 α -氨基反应，生成带黄绿色荧光的 DNS-氨基酸。
五、实验结果
前沿
DNS-Phe
DNS-Gly
DNS-His( α )
DNS-His( ε )
DNS-OH
(bis)DNS -His
颜色
第一向（cm）
—— 5.20 —— 5.40 ——
黄绿色 黄绿色 3.20 0.615 1.00 0.185 1.65 0.317 2.40 0.444
绿色 0.55 0.106 4.95 0.917
经典生理生化试验2
实验十九DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。
二、原理：DNS—Cl在碱性环境里蛋白质和肽的α-氨基酸的氨基起反应，生成带有荧光的、稳定的DNS-氨基酸（参看图19-1，19-2），其反应如下：蛋白质在水解前与DNS—Cl反应，产生DNS-蛋白质，它标记在N-末端氨基酸残基上，经水解和薄层层析而测知是何种氨基酸。
蛋白质水解后与DNS—Cl反应，标记的是蛋白质的氨基酸组成成分，如图19-1和图19-2所示。
这是一种较为简便的、适用的蛋白质的氨基酸组成成分分析的方法。
DNS-蛋白质水解产物中包括下列DNS-衍生物：相当于N-末端的α-DNS-氨基酸，从链内赖氨酸及酪氨酸残基形成的ε-DNS-赖氨酸和O-DNS-酪氨酸，这些衍生物相当稳定。
此外，DNS—Cl还与溶液中的氨起反应生成DNS—NH2，DNS-磺酰胺以及DNS—Cl水解生成的DNS—OH（DNS-磺酸）。
此法与氟二硝基苯法相比，有二个突出的优点，即水解产物无需提取，可用电泳或层析法直接鉴定氨基酸；另外就是灵敏度高，DNS-氨基酸的最大荧光激发值约为550nm，由于其荧光十分强烈，1—5n mol·L-1或0.2—1.0n mol·L-1 DNS-衍生物即可分别用电泳或薄层层析容易地检测。
DNS—Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物。
其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可与DNS—Cl生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些氨基酸相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度达10—9—10—10摩尔水平。
比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。
DNS-蛋白质（或肽），在5.7mol·L-1 HCl，110℃水解16—20h，DNS-蛋白质的肽键被打开。
实验三 Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法
实验四 Dansyl —氨基酸的聚酰胺薄膜层析法实验目的1．学习聚酰胺薄膜层析法的原理。
2．学习利用Dansyl —氨基酸分析蛋白质N 末端氨基酸及蛋白质组成的原理。
3．掌握制备Dansyl 氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。
实验原理聚酰胺是一类化学纤维原料，又称锦纶或尼龙。
它对许多极性化合物有吸附作用，具有特异的分辨性能，可用于柱层析、薄层层析及薄膜层析。
与纸层析及纸电泳等方法相比，聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物时具有灵敏度高、分辨力强、速度快、操作方便等优点。
除用于氨基酸衍生物的分析外，还可用于碱基、核苷酸、核苷、酚类、酚类糖苷、硝基化合物、杂环化合物、环酮、抗菌素、磺胺、合成染料等十几类化合物。
荧光试剂Dansyl —C1(二甲基氨基萘磺酰氯)可与氨基酸结合成带有荧光的Dansyl —氨基酸。
Dansyl —氨基酸在酸性条件下可被乙酸乙酯萃取出来，经聚酰胺薄膜层析后斑点集中，仅10—9至10—10克分子即可被检识，所以灵敏度很高。
用作蛋白质末端基分析，比DNP 氨基酸纸层析法灵敏度高100倍；用于氨基酸组成的微量分析，比茚三酮显色法灵敏度高10多倍。
聚酰胺薄膜层析的展层速度也比纸层析快得多，单向层层7厘米只需15—20分钟。
但用于定量，需要特殊仪器，目前多用于定性鉴定。
Dansyl —C1能与所有的氨基酸作用生成具荧光的衍生物。
这些衍生物都相当稳定，在5.7N 盐酸溶液中经105℃加热22小时，除Dansyl —色氨酸全部被破坏以及Dansyl聚酰胺薄膜是将锦纶涂布于涤纶片上，形成质地均匀的紧密的多孔薄膜，层析性能十分优良。
聚酰胺的化学结构如右。
由于聚酰胺的—C=O 基及—NH 基可与被分离物质形成氢键，因此可以吸附酸类、酚类、醌类、硝基及胺基化合物等。
由于各种物质与聚酰胺形成氢键的能力不同，即聚酰胺对各种物质的吸附能力不同。
而在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。
DNS法分析蛋白质末端氨基酸
⑤结果分析：将层析后的薄膜置于254nm或 265nm的紫外灯下观察，将绿色荧光点画在膜 上，通过样品水解N-末端氨基酸与DNS-甘氨 酸，DNS-苯丙氨酸的层析位置比较，证明胰岛 素N-末端是哪一种氨基酸?
六、思考题 1．聚酰胺薄膜层析具有哪些特点? 2．胰岛素N-末端是哪一种氨基酸?
②DNS-胰岛素的水解和DNS-氨基酸的抽提：在 上述离心管内，加入0．2mL6mol／LHCl溶液，
使其溶解，转移到小安瓿管中，用火焰封口， 置110℃烘箱水解18h左右。水解后开管，真空 抽干或用吹风机吹干，加2滴0．2mol／ LNa2C03溶液，并用1mol／LHCl调pH至 2．0—2．5，加入5—6滴乙酸乙酯，稍微晃动， 安瓿管上层乙酸乙酯层内含DNS-末端氨基酸， 再用乙酸乙酯抽提2—3次，加入0．1mL丙酮 溶解，待用。
与纸层析相比，聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物 时具有灵敏度高、分辨率强、速度快、操作方便等优点， 在生化分析中起到了越来越重要的作用。
三、实验器材 ①紫外灯 ②烘箱 ③恒温箱 ④聚酰胺薄膜 ⑤层析缸
⑥吹风机
⑦毛细管。
四、材料与试剂 结晶胰岛素 0．2mol／LNaHC03 1mol／LNaOH 乙酸乙酯 DNS-C1丙酮溶液(25mg／mL) 6mol／LHCl 展层溶剂： 甲酸：水=1．5：100(V／V)(第一相) 苯：冰乙酸=9:l(V／V)(第二相)。
③DNS-标准氨基酸的制备：由于已知胰岛素A、B 链的N-末端分别为甘氨酸和苯丙氨酸，因此将 标准甘氨酸和标准苯丙氨酸分别用0.2mol／ LNaHC03配成0.5mg／mL浓度的溶液，用lmol／ LNaOH调到pH9.0-9.5。用滴管取标准甘氨酸液 3-4滴装入安瓿管内，再取苯丙氨酸溶液3-4滴 装入另一小管中，在每个小管中加入等体积的 DNS-Cl丙酮液，摇匀，用胶布封口，置40℃温 箱保温1h。取出，蒸去丙酮，滴人lmol／L的 HCl液调pH2.0-2.5，加入乙酸乙酯5-6滴，稍晃 动，离心管上层乙酸乙酯层即含DNS-标准氨基 酸，再用乙酸乙酯抽提2—3次，蒸去乙酸乙酯， 加入0.1mL丙酮溶液，待用。
dnscl法
dnscl法
DNS-Cl法又叫蛋白质DNS分析法，也叫DNS-Cl（膜层析技术），能与所有氨基酸的氨基结合，生成荧光物质DNS-氨基酸。
DNS-Cl也能与蛋白质或多肽的游离氨基结合，生成DNS-蛋白质或DNS-肽，经酸水解后释放出DNS-氨基酸。
各种DNS-氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力个同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS-氨基酸。
DNS-氨基酸在360nm或280nm波长的紫外光照射下，发出黄色荧光，很方便进行检测。
DNS-Cl法可用于蛋白质或多肽氨基酸组成的微量分析。
在pH值过高的情况下，DNS-Cl会发生水解生成副产物DNS-NH2，DNS-OH 和DNS-Cl在紫外灯下产生蓝色荧光，可以与DNS-Cl的黄色荧光区分开来。
氨基酸聚酰胺薄膜层析
氨基酸聚酰胺薄膜层析——DNS-Cl法一、实验目的：1．掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。
2．熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。
二、实验原理：.1.层析技术①概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。
②特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。
不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。
③层析法的分类气相层析（以气体为流动相的层析法）液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）I.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析II.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析III.离子交换层析IV.凝胶层析：柱层析、薄膜层析V.亲和层析④纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。
纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。
将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。
由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf 值是常数，故可根据Rf值作定性判断。
样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越 大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交
联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网
颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。
G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄 糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l,3-糖苷键 （约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状 结构的高分子化合物。
叶绿素通过碳酸钙管柱所形成的色谱图
层析的两种相
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换 剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分 离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体
外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：
Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：
Vt＝Vo＋Vi
外水体积（V0）
内水体积（Vi）
基质体积（Vg）
柱床体积（Vt）
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
样 品 的 量
洗脱体积
当分子的Kd＝0时，Ve＝Vo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动 相里，固定相里分布为零（A)； 当分子的Kd＝1时，Ve＝Vo+Vi即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固 定相里，两相比值为1(C)；
DNS法分析蛋白质末端氨基酸
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②DNS-胰岛素的水解和DNSFra bibliotek氨基酸的抽提：在上述离心 管内，加入0．2mL6mol／LHCl溶液，使其溶解，转 移到小安瓿管中，用火焰封口，置110℃烘箱水解18h 左右。水解后开管，真空抽干或用吹风机吹干，加2滴 0．2mol／LNa2C03溶液，并用1mol／LHCl调pH至 2．0—2．5，加入5—6滴乙酸乙酯，稍微晃动(huàngdòng)， 安瓿管上层乙酸乙酯层内含DNS-末端氨基酸，再用乙 酸乙酯抽提2—3次，加入0．1mL丙酮溶解，待用。
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本实验的反应首先在碱性(pH9.5-10.5)条件下，使蛋白质或多肽 的N-末端氨基酸与DNS-Cl结合，得到二甲基氨萘-5-磺酰蛋白(DNS-蛋 白)。此DNS-蛋白在6mol／l,HCl中水解时，蛋白质中的肽键均发生断 裂，得到游离的氨基酸，而N-末端的氨基酸形成DNS-氨基酸。对此 DNS-氨基酸进行鉴定，即可确定蛋白质的N-末端氨基酸。
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④DNS-氨基酸的层析：将聚酰氨薄膜剪成7cmX7cm的方块，距边 lcm处画上一直线作为基线，基线上画几个X点，作为点样起 始点。
点样：将DNS-胰岛素水解液与DNS-甘氨酸，DNS-苯丙氨酸一起点在基 线X处，点样直径不超过(chāoguò)2mm，每点完一次，用吹风机吹干。
DNS-C1能与所有的氨基酸作用生成具有荧光的衍生物，这些衍生 物都相当稳定，在5.7mol／L盐酸溶液中经105℃条件下水解22h，除 DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸、DNS-丝氨酸(35％)、DNS-甘氨 酸(18％)及DNS-丙氨酸(70％)也被破坏，但其他DNS-氨基酸没有任何 (rènhé)损失。
生物化学技术 习题册答案
上海交通大学网络教育学院医学院分院生物化学技术课程习题册答案专业：检验技术层次：专升本绪论一、名词解释1.生物化学技术：是研究生物体的化学组成、结构、功能以及在生命活动中化学物质的代谢、调节控制等的实验方法。
2.盐溶：蛋白质、酶及其它们与其它物质的复合体在离子强度低的盐溶液中，其溶解度随着盐溶液浓度的升高而增加，此现象称为“盐溶”。
3.盐析：当溶液中盐浓度不断上升，达到一定程度，蛋白质等的溶解度反而逐渐减小，并先后从溶液中析出，称为“盐析”。
4.透析：利用溶液组分能否通过半透膜并由引起膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除溶液中的小分子物质。
5.超滤（反向渗透）：利用压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质不能透过半透膜仍留在膜上。
6.凝胶层析法（Gel Chromatography)：利用各种物质分子大小不同，在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的一种层析方法。
二、单选题1.凝胶层析不可应用于：（ B ）A. 脱盐B. 一步分离纯化生物大分子物质C. 高分子溶液的浓缩D. 测定高分子物质的分子量 E．分离分子大小不同的物质2.核酸在紫外区有强吸收，其最大吸收值是在波长：（ C ）A．206nm B．240nm C．260nm D．280nm E．304nm3.对260nm波长的紫外有强吸收主要是因为（ E ）A．核糖的环式结构 B.脱氧核糖的环式结构C．嘌呤的双环结构 D.嘧啶的单环结构 E. 嘌呤和嘧啶环中的共轭双键4.蛋白质在紫外区有强吸收，其最大吸收值是在波长：（ D ）A．206nm B．240nm C．260nm D．280nm E．304nm5.用紫外分光光度法测定蛋白质，因为蛋白质在紫外区有个最大吸收峰，其峰值波长是：D A．220nm B．245nm C．260nm D．280nm E．340nm6.用吸收光谱法测量双链DNA的含量为：（ A ）A.C（ug/ml）=A260×50×稀释倍数B.C（ug/ml）=A260×40×稀释倍数C.C（ug/ml）=A260×30×稀释倍数D.C（ug/ml）=A260×20×稀释倍数E.C（ug/ml）=A260×10×稀释倍数7.用吸收光谱法测量单链DNA的含量为：（ B ）A.C（ug/ml）=A260×50×稀释倍数B.C（ug/ml）=A260×40×稀释倍数C.C（ug/ml）=A260×30×稀释倍数D.C（ug/ml）=A260×20×稀释倍数E.C（ug/ml）=A260×10×稀释倍数8.用吸收光谱法测量RNA的含量为：（ B ）A.C（ug/ml）=A260×50×稀释倍数B.C（ug/ml）=A260×40×稀释倍数C.C（ug/ml）=A260×30×稀释倍数D.C（ug/ml）=A260×20×稀释倍数E.C（ug/ml）=A260×10×稀释倍数9.以下哪一个比值说明DNA纯度较高：（ C ）A.A260/A280=1.4B.A260/A280=1.6C.A260/A280=1.8D.A260/A280=2.0E.A260/A280=2.210.以下哪一个比值说明RNA纯度较高：（ D ）A.A260/A280=1.4B.A260/A280=1.6C.A260/A280=1.8D.A260/A280=2.0E.A260/A280=2.211.某人提取DNA后，将DNA溶液稀释20倍，然后经紫外分光光度计检测结果为A260nm=0.44，A280nm=0.25，比色皿光径1cm，该DNA样品的浓度为：（D ）A. 250μg/mlB.264μg/mlC.352μg/mlD.440μg/mlE.220μg/ml12.以下哪一种方法不属于物理破碎细胞法：（ C ）A．组织匀浆法 B．组织捣碎法 C．有机溶剂法 D．超声波法 E．反复冻融法13.以下哪一种方法适用于破碎细菌：（ D ）A．组织匀浆法 B．组织捣碎法 C．有机溶剂法 D．超声波法 E．反复冻融法14.盐析时最常用的盐是：（ C ）A．硫酸钾 B．硫酸钠 C．硫酸铵 D．硫酸镁 E．氯化钠15.测定蛋白质分子量的方法有：（ C ）A.不连续PAGE、琼脂糖凝胶电泳、醋纤薄膜电泳B.IEF、聚酰胺薄膜双向层析、凝胶过滤C.超滤、SDS-PAGE、凝胶过滤D.超速离心、透析、超滤E.SDS-PAGE、PAGE、IEF16.以下哪一种方法根据蛋白质的分子大小不同来分离：（ D ）A.离子交换层析B.聚酰胺薄膜双向层析C.亲和层析D.凝胶层析E.薄层层析17.以下哪一种方法根据蛋白质的带电性质差异来分离：（ A ）A.离子交换层析B.聚酰胺薄膜双向层析C.亲和层析D.凝胶层析E.薄层层析18.要分离血浆蛋白取得某一单独组分，下列方法不能使用：（C ）A.色谱法B.电泳法C.染料结合法D.盐析法E.层析法三、问答题1.什么是生物化学技术？答：生物化学技术是研究生物体的化学组成、结构、功能以及在生命活动中化学物质的代谢、调节控制等的实验方法。
DNS法分析蛋白质
DNS法分析蛋白质N-末端氨基酸
DNS：丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）
强荧光剂
灵敏度高
反应原理
聚酰胺薄膜层析法
•原理：各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力不同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。
•优点：灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等
点样层析
PH9.9 的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸
实验原理
•荧光试剂DNS—Cl能与所有氨基酸的氨基结合，生成荧光物质DNS—氨基酸。
DNS—Cl 也能与蛋白质或多肽的游离氨基结合，生成DNS—蛋白质或DNS—肽，经酸水解后释放出DNS—氨基酸。
•各种DNS—氨基酸与聚酰胺薄膜形成氢键的能力个同，即在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不一样，故可用聚酰胺薄膜层析分离各种DNS—氨基酸。
DNS—氨基酸在360nm 或280nm 波长的紫外光照射下，发出黄绿色荧光，很方便进行检测。
•蛋白质和多肽经酸水解后，肽键断裂，生成游离氨基酸，所有氨基酸都能与DNS—Cl 反应。
所以DNS—Cl 法可用于蛋白质或多肽氨基酸组成的微量分析。
•在pH 值过高的情况下，DNS—Cl 会发生水解生成副产物DNS—NH2，DNS—OH 和DNS—Cl在紫外灯下产生蓝色荧光，可以与DNS—Cl 的黄绿色荧光区分开来。
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非极性：
纤维素
聚酰胺：
→合成：己二酸、己二胺 →特点：氢键吸附剂
……
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8
聚酰胺
是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。 由己二酸与己二胺聚合而成。
➢因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团， 故统称聚酰胺。
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9
聚酰胺对极性物质的吸附作用
——是由于聚酰胺的-C＝O(羰基)及>NH(氨基)能与被分离物
质之间形成氢键。
➢如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类（如核苷酸、氨 基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键
➢如硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键
✓被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。
✓在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相 形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶 剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附 与解吸的展层过程，可以一一分离.
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22
pH9.8 40℃上胺基与氨基酸 的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基 与AA中羟基或酚基形成氢键。由于 有些AA结构相似，如只采用一种溶 剂系统进行单向层析，难达到完全 分离的目的。因此可选择另一溶剂 系统进行第二向层析。
第一向——苯－冰醋酸
（3）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的 重复性。
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6
吸附剂的吸附能力
常称为活度，用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、 Ⅴ表示。
活度 强
弱
含水量 多
少
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7
常用吸附剂
极性：
硅胶:
为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸 性及中性物质。
氧化铝:
氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点 碱性/中性/酸性氧化铝
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
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1
薄层层析（Thin-layer chromatography,TLC)
薄层层析 ---是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄膜 上铺成薄层作为固定相，以溶剂作为流 动相，将样品中各组分分离的方法。
➢ 分离原理：
——吸附层析
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2
吸附层析的概念及原理
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18
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光 DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光
→可彼此区分。
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19
三、薄层层析的应用
（一）定性分析：将已知化合物作为标准品与 样品一起进行层析后对照，可初步确定未知 化合物的组成。
（二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须 破坏薄层； 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱， 再用其他方法测定。
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4
吸附剂
主要是利用吸附剂对不同物质吸附力 的不同而达到分离的目的。
➢薄层层析中吸附剂选择是关键。
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5
吸附剂的选择
（1）应不溶于所使用的溶剂;与所使用的溶 剂和样品中各组分不起化学反应；
（2）应具有较大的吸附表面（吸附容量） 和一定的吸附力;对被分离个组分有不同 的吸附力,有足够的分辨力；
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12
薄层层析的操作
1、点样
➢样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、 丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶 剂挥发后反复进行至点完为止。 ➢样品原点直径＜3mm
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13
2.平衡 3.展开
方法：
上行层析法 下行层析法 双向展开法
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14
显色
1）有色物质（如黄体酮）展开后即可显 出斑点
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20
临床生化上的应用
1.氨基酸的分离 2.核苷、核苷酸和核酸的分析
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21
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
二甲氨基萘磺酰氯 (1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride， DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨 基酸。 形成的DNS-氨基酸在紫外线（260nm或365nm） 照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检 测DNS-氨基酸的存在。
吸附
---一种物质被聚集在另一种物质表面的 现象。
➢ 吸附剂：
---凡是能够将其他物质聚集到本身分子表 面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。
➢ 被吸附物
---聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附 物。
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3
吸附层析（Absorption Chromatography)
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面 活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸 附能力差异而实现分离.
第二向——甲酸－水
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显色
二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游 离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基 酸在紫外光下呈黄绿色荧光。
DNS-Cl + AA DNS-AA + HCl
反应的副产物：DNS-NH2黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光
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25
DNS-氨基酸的双向层析图谱
（3）甲酸－水层析：调转90度与第一相垂直，热风吹 干，紫外灯下观察，用铅笔轻轻标记。
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注意
（1）严格控制点样位置以及点样直径。 （2）展层时勿将点样浸入溶剂系统。 （3）展层后必须经电吹风将膜吹干。 （4）使用紫外照射时要注意使用时间短.
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28
Procedure for TLC
Ⅱ 丝
甘 天
谷
丙
苯
亮
脯 颉
赖
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Ⅰ
26
操作以及注意事项
1、DNS－氨基酸的制备
2、混合DNS－氨基酸的双向层析
（1）点样。距右下角距两边各0.5cm，直径控制在2－ 3mm之间，点在无光泽面,可重复几次点样。
（2）苯－冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端3mm处 即可停止,冷风吹干，紫外观察。
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溶剂
不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大 小各种溶剂的洗脱能力各不相同。 ➢一般所选溶剂要求：
a.纯度合格 b.黏度要小→易与样品中各组分相分离 c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应
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溶剂选择考虑因素
1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力 2、溶剂与样品之间的作用因素
➢ 溶剂的选择可通过实验来确定。
2）紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和 某些生物碱
3）显色剂显色
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荧光试剂 ——DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯
蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基 结合
DNS-aa发出黄绿色荧光
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DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物 DNS-OH，即：
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在DNS-Cl过量时，会 产生DNS-NH2，即：