DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
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质之间形成氢键。
➢如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类（如核苷酸、氨 基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键
➢如硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键
✓被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。
✓在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相 形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶 剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附 与解吸的展层过程，可以一一分离.
第二向——甲酸－水
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24
显色
二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游 离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基 酸在紫外光下呈黄绿色荧光。
DNS-Cl + AA DNS-AA + HCl
反应的副产物：DNS-NH2黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光
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25
DNS-氨基酸的双向层析图谱
可编辑ppt
20
临床生化上的应用
1.氨基酸的分离 2.核苷、核苷酸和核酸的分析
可编辑ppt
21
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
二甲氨基萘磺酰氯 (1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride， DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨 基酸。 形成的DNS-氨基酸在紫外线（260nm或365nm） 照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检 测DNS-氨基酸的存在。
2）紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和 某些生物碱
3）显色剂显色
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15
荧光试剂 ——DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯
蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基 结合
DNS-aa发出黄绿色荧光
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16
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物 DNS-OH，即：
可编辑pห้องสมุดไป่ตู้t
17
在DNS-Cl过量时，会 产生DNS-NH2，即：
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4
吸附剂
主要是利用吸附剂对不同物质吸附力 的不同而达到分离的目的。
➢薄层层析中吸附剂选择是关键。
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5
吸附剂的选择
（1）应不溶于所使用的溶剂;与所使用的溶 剂和样品中各组分不起化学反应；
（2）应具有较大的吸附表面（吸附容量） 和一定的吸附力;对被分离个组分有不同 的吸附力,有足够的分辨力；
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10
溶剂
不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大 小各种溶剂的洗脱能力各不相同。 ➢一般所选溶剂要求：
a.纯度合格 b.黏度要小→易与样品中各组分相分离 c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应
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11
溶剂选择考虑因素
1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力 2、溶剂与样品之间的作用因素
➢ 溶剂的选择可通过实验来确定。
……
非极性：
纤维素
聚酰胺：
→合成：己二酸、己二胺 →特点：氢键吸附剂
……
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8
聚酰胺
是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。 由己二酸与己二胺聚合而成。
➢因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团， 故统称聚酰胺。
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9
聚酰胺对极性物质的吸附作用
——是由于聚酰胺的-C＝O(羰基)及>NH(氨基)能与被分离物
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12
薄层层析的操作
1、点样
➢样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、 丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶 剂挥发后反复进行至点完为止。 ➢样品原点直径＜3mm
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13
2.平衡 3.展开
方法：
上行层析法 下行层析法 双向展开法
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14
显色
1）有色物质（如黄体酮）展开后即可显 出斑点
（3）甲酸－水层析：调转90度与第一相垂直，热风吹 干，紫外灯下观察，用铅笔轻轻标记。
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27
注意
（1）严格控制点样位置以及点样直径。 （2）展层时勿将点样浸入溶剂系统。 （3）展层后必须经电吹风将膜吹干。 （4）使用紫外照射时要注意使用时间短.
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28
Procedure for TLC
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18
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光 DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光
→可彼此区分。
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19
三、薄层层析的应用
（一）定性分析：将已知化合物作为标准品与 样品一起进行层析后对照，可初步确定未知 化合物的组成。
（二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须 破坏薄层； 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱， 再用其他方法测定。
吸附
---一种物质被聚集在另一种物质表面的 现象。
➢ 吸附剂：
---凡是能够将其他物质聚集到本身分子表 面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。
➢ 被吸附物
---聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附 物。
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3
吸附层析（Absorption Chromatography)
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面 活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸 附能力差异而实现分离.
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
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1
薄层层析（Thin-layer chromatography,TLC)
薄层层析 ---是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄膜 上铺成薄层作为固定相，以溶剂作为流 动相，将样品中各组分分离的方法。
➢ 分离原理：
——吸附层析
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2
吸附层析的概念及原理
Ⅱ 丝
甘 天
谷
丙
苯
亮
脯 颉
赖
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Ⅰ
26
操作以及注意事项
1、DNS－氨基酸的制备
2、混合DNS－氨基酸的双向层析
（1）点样。距右下角距两边各0.5cm，直径控制在2－ 3mm之间，点在无光泽面,可重复几次点样。
（2）苯－冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端3mm处 即可停止,冷风吹干，紫外观察。
（3）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的 重复性。
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6
吸附剂的吸附能力
常称为活度，用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、 Ⅴ表示。
活度 强
弱
含水量 多
少
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7
常用吸附剂
极性：
硅胶:
为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸 性及中性物质。
氧化铝:
氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点 碱性/中性/酸性氧化铝
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22
pH9.8 40℃,30min
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23
本实验中，聚酰胺上胺基与氨基酸 的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基 与AA中羟基或酚基形成氢键。由于 有些AA结构相似，如只采用一种溶 剂系统进行单向层析，难达到完全 分离的目的。因此可选择另一溶剂 系统进行第二向层析。
第一向——苯－冰醋酸
➢如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类（如核苷酸、氨 基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键
➢如硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键
✓被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。
✓在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相 形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶 剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附 与解吸的展层过程，可以一一分离.
第二向——甲酸－水
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显色
二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游 离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基 酸在紫外光下呈黄绿色荧光。
DNS-Cl + AA DNS-AA + HCl
反应的副产物：DNS-NH2黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光
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DNS-氨基酸的双向层析图谱
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20
临床生化上的应用
1.氨基酸的分离 2.核苷、核苷酸和核酸的分析
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DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
二甲氨基萘磺酰氯 (1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride， DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨 基酸。 形成的DNS-氨基酸在紫外线（260nm或365nm） 照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检 测DNS-氨基酸的存在。
2）紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和 某些生物碱
3）显色剂显色
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荧光试剂 ——DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯
蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基 结合
DNS-aa发出黄绿色荧光
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DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物 DNS-OH，即：
可编辑pห้องสมุดไป่ตู้t
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在DNS-Cl过量时，会 产生DNS-NH2，即：
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吸附剂
主要是利用吸附剂对不同物质吸附力 的不同而达到分离的目的。
➢薄层层析中吸附剂选择是关键。
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吸附剂的选择
（1）应不溶于所使用的溶剂;与所使用的溶 剂和样品中各组分不起化学反应；
（2）应具有较大的吸附表面（吸附容量） 和一定的吸附力;对被分离个组分有不同 的吸附力,有足够的分辨力；
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溶剂
不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大 小各种溶剂的洗脱能力各不相同。 ➢一般所选溶剂要求：
a.纯度合格 b.黏度要小→易与样品中各组分相分离 c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应
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溶剂选择考虑因素
1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力 2、溶剂与样品之间的作用因素
➢ 溶剂的选择可通过实验来确定。
……
非极性：
纤维素
聚酰胺：
→合成：己二酸、己二胺 →特点：氢键吸附剂
……
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聚酰胺
是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。 由己二酸与己二胺聚合而成。
➢因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团， 故统称聚酰胺。
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9
聚酰胺对极性物质的吸附作用
——是由于聚酰胺的-C＝O(羰基)及>NH(氨基)能与被分离物
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薄层层析的操作
1、点样
➢样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、 丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶 剂挥发后反复进行至点完为止。 ➢样品原点直径＜3mm
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2.平衡 3.展开
方法：
上行层析法 下行层析法 双向展开法
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显色
1）有色物质（如黄体酮）展开后即可显 出斑点
（3）甲酸－水层析：调转90度与第一相垂直，热风吹 干，紫外灯下观察，用铅笔轻轻标记。
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注意
（1）严格控制点样位置以及点样直径。 （2）展层时勿将点样浸入溶剂系统。 （3）展层后必须经电吹风将膜吹干。 （4）使用紫外照射时要注意使用时间短.
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Procedure for TLC
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18
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光 DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光
→可彼此区分。
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三、薄层层析的应用
（一）定性分析：将已知化合物作为标准品与 样品一起进行层析后对照，可初步确定未知 化合物的组成。
（二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须 破坏薄层； 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱， 再用其他方法测定。
吸附
---一种物质被聚集在另一种物质表面的 现象。
➢ 吸附剂：
---凡是能够将其他物质聚集到本身分子表 面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。
➢ 被吸附物
---聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附 物。
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吸附层析（Absorption Chromatography)
各组分与流动相分子争夺吸附剂表面 活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸 附能力差异而实现分离.
DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析
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1
薄层层析（Thin-layer chromatography,TLC)
薄层层析 ---是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄膜 上铺成薄层作为固定相，以溶剂作为流 动相，将样品中各组分分离的方法。
➢ 分离原理：
——吸附层析
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吸附层析的概念及原理
Ⅱ 丝
甘 天
谷
丙
苯
亮
脯 颉
赖
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操作以及注意事项
1、DNS－氨基酸的制备
2、混合DNS－氨基酸的双向层析
（1）点样。距右下角距两边各0.5cm，直径控制在2－ 3mm之间，点在无光泽面,可重复几次点样。
（2）苯－冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端3mm处 即可停止,冷风吹干，紫外观察。
（3）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的 重复性。
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吸附剂的吸附能力
常称为活度，用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、 Ⅴ表示。
活度 强
弱
含水量 多
少
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常用吸附剂
极性：
硅胶:
为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸 性及中性物质。
氧化铝:
氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点 碱性/中性/酸性氧化铝
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pH9.8 40℃,30min
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本实验中，聚酰胺上胺基与氨基酸 的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基 与AA中羟基或酚基形成氢键。由于 有些AA结构相似，如只采用一种溶 剂系统进行单向层析，难达到完全 分离的目的。因此可选择另一溶剂 系统进行第二向层析。
第一向——苯－冰醋酸