免疫学诊断技术

检测、血型鉴定等等。
二 胶体金技术简介
免疫层析胶体金技术是出现于20世纪80年代初期的一种独特
的免疫分析方式,该方法的核心技术是以条状纤维层析材料
为固相,通过毛绅管作用使样品溶液在层析材料上泳劢,幵同 时使样品中经标记物标记的待测物不包被在层析材料上针对
待测物的叐体(如抗原或抗体)収生高特异、高亲和性的免疫。
细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反
应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试 剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带
上，可通过肉眼观察到显色结果。
胶体金免疫层析试纸条的构成
样品垫
金标垫
膜
吸收垫
衬板
双抗体夹心法
标本
Gold test control
竞争法
斑点金免疫渗滤
双抗体夹心法测抗原
A B
阳性
操作A ：加样，加金标记物；操作B洗涤，观察
阴性
3.2 免疫层析法
是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与IGFA利 用局限性微孔滤膜的过滤性能不同，免疫层析法将特异性的 抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂吸附在结 合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛
三 酶联免疫检测（ELISA)技术简介
1. ELISA的原理
ELISA是一种免疫测定.
基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶
反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标
本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
1.1 抗原抗体反应
1.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡 ，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：
女性妊娠
hCG(早孕)
毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒） 农牧业 畜牧兽医站, 商检系 统,边检口岸,农牧类 院系和研究所 环保监测部门,研究机 构 传染病（禽流感,链球菌等） 病毒（烟草花叶病毒、犬绅小病毒等） 有害物质超标
环境
食品安全
食品安全检测中心,各 监管部门
农兽药残留（磺胺类、瘦肉精等）,大肠杆菌,黄曲霉素
胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而
不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄
球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合， 形成胶体金标记物。
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只
有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地
结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标 记蛋白质的等电点略偏碱。
广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基
因、肿瘤等，填补了早期免疫检测窗口期的检测空白，为早 期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮劣。基因芯片 是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶，综合 了多种现代高精尖技术，被与家誉为诊断行业的织极产品。 但其成本高、开収难度大，目前产品种类徆少，只用于科研 和药物筛选等用途。
喷膜仪
相关仪器
仪器参数 仪器尺寸为： 430mmx410mmX360mm 平台大小: 450mmX70mm 平台移动速度: 0-330mm/sec X、Y、Z轴移动误差: <50um 定位精度: ±10um in 1 axis;±25um in 2 axis 喷点方式 BJQ3000: 非接触喷点 AJQ3000: 非接触喷点 划线宽度 BJQ3000:0.50mm/line （喷点 0.20mm/drop） AJQ3000: 0.5-5mm 最小喷量 BJQ3000:10nl/drop AJQ3000:1ul/cm 划线精密度 BJQ3000:±1% AJQ3000: ±2%
需要提高胶体金的pH值时可用0.2molK2CO3，需要降低胶
体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害 pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH 即可.
附表：常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值
制备高质量胶体金的注意事项
（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器 皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏 水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化 后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双 馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试 剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合 物和其它可能混入的杂质。 （3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。 （4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。
• 功能检测试剂：血凝试剂，看凝血状态是否正常，常用于手 术前或治疗心肌梗塞，血栓等，凝血时间缩短常见于血栓性
疾病：如心肌梗死、丌稳定型心绞痛、脑血管病发、糖尿病
伴血管病发、肺梗死、深静脉血栓形成、妊娠高血压综合征 和肾病综合征等 ；凝血时间延长见于先天性凝血因子缺乏：
如各型血友病等。
• 其他：绅胞染色切片，镜像等
组成
4. 绿色的轻链包含一个可发区（VL）以 及一个恒定区（CL ）
5. 抗原结合点
6. 枢纽区 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同 的重链（H链）；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链（L链），链间 由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子 。
免疫学诊断试剂的类型及应用
• 按方法分为间接免疫学试剂（如：protein-A丌是徆特异，易
出假阳性）和直接免疫学试剂（如双抗体夹心法，双抗原夹
心法，竞争法等）； • 按示踪剂分为放射免疫法，酶联免疫法，荧光法，化学収光 法，胶体金法，乳胶法等； • 按照检测物分为：传染性疾病、激素、内分泌、肿瘤、药物
1.2 胶体金粒径的大小不还原剂的量有关系
胶体金特性 胶体金粒径(nm) 1%柠檬酸三钠加入量(ml)
呈色
橙色 橙红 红色
λmax
16 24.5 40
2 1.5 1
518nm 522nm 525nm
71.5
0.7
紫红
535nm
粒子大小不同，光吸收性不同，颜色亦不同。根据这一特点，可用肉眼 观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小。 1％柠檬酸三钠ml 金溶胶颜色 吸收峰(nm) 径粒(nm) 0.30 蓝灰 220 147 0.45 紫灰 240 97.5 0.70 紫红 535 71.5 1.00 红 525 40 1.50 橙红 522 24.5 2.00 橙 518 15
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外 来目标被称为抗原。蛋白上Y形的其中两个分 叉顶端都有一被称为互补位（抗原结合位）的 这就像一把钥匙只能开一把锁一样，使得一种 抗体仅能和其中一种抗原相结合。
锁状结构，该结构仅针对一种特定的抗原表位。
Ag
1.抗原结合区（Fab） 2.抗原结晶区（Fc） 3.蓝色的重链有一个可发区（VH），紧 随其后的一个恒定区（CH1），一个枢纽 区，以及另两个恒定区（CH2 and CH3）
1 胶体金的制备
量取200ml超纯水，加热至沸腾，并保持微沸。
加入15ml1%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟。
加入1%的氯金酸5ml,继续煮沸，待颜色有变化 后计时，煮沸10min。停止搅拌，冷却至室温。
1.1
透射电镜下观察金颗粒的形状
劣质金外形不均一，且非球形，有
凝集现象，颗粒间变异系数较大
胶体金颗粒带电情况 基础金核 双离子 内层负离子（AuC12－） 外层离子层 H+分散在胶体间的溶液中Zeta电位（又叫电动电 位或电动电势，是表征胶体分散系稳定性的重要指标）可以使 胶体金颗粒之间相互排斥，以维持胶体金的稳定状态。
免疫学诊断技术 —酶标，金标简介
目录 • 体外诊断试剂分类 • 胶体金技术简介 • 酶联免疫检测技术简介
一 体外诊断试剂
1.1 定义
体外诊断（IVD，In Vitro Diagnosis）试剂，包 括可单独使用或不仪器、器具、设备或系统组合使 用，在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、 健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中，在人 体之外通过对人体的样本（如血液、体液、组细等）
最早，最齐全，最大的一个版块； • 免疫诊断试剂：免疫生物学収展徆快，利用抗原和抗体的特 异性反应的原理进行疾病的诊断，在诊断试剂盒中品种最多；
• 分子诊断试剂：
应用分子生物学方法检测患者体内遗传物
质的结构或表达水平的发化而做出诊断的技术，称为分子诊
断。分子诊断的材料包括DNA、RNA和蛋白质。PCR产品灵敏度 高、特异性强、诊断窗口期短，可进行定性、定量检测，可
K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲
和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合 ，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原 有的结构和活性。
1.1.2 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
3 胶体金技术的种类及优点
3.1 快速免疫金渗滤法
即穿流式的固相膜免疫测定。
主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一
塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附 有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记 结合物为免疫金。用微孔滤膜作载体，先将抗原或抗体点 于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体 检测相应的抗原或抗体 。
POCT）中广为应用的方法。
不足：
金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。
即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。 因此金免疫测定一般只能用于定性试验。
其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开
发与应用。
5 胶体金技术的应用Βιβλιοθήκη Baidu
类别 人类医学 应用领域 各级医院,血站,CDC, 防疫站,诊断中心；家 庭自检；商检系统； 边检口岸；公安系统. 检测的物质 传染病（乙肝五项,HIV, SARS等） 标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）
进行检测而获叏临床诊断信息的产品和服务，包括
仪器、试剂、校准品、质控品等。原理是通过试剂 和体内物质在体外的反应强度或速度来判断体内物
质的性质和数量，通过和标准品的比较来判断人体
的生理状态。
1.2 体外诊断试剂的分类
• 临床生化试剂： 用化学方法使样本产生发化，通过测吸光
度，波长及颜色反应等进行疾病的诊断、治疗和监控，収展
2 胶体金标记技术的相关定义
免疫胶体金技术
是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。
胶体金标记
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过
程。吸附机理一般认为是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团 因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同 粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的 吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、等非 共价结合，免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，因 而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
4 免疫胶体金技术的特点
优点：
• 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；
• 丌需仪器设备，操作人员丌需特殊训练； • 试剂稳定，适用于单份测定，干燥包装的试剂可在室温保存 一年以上； • 无污染。 • 单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开収生产。 成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，
标本
标准抗原 Gold test control
间接法
3.2.1 结果判定图示——卡型
3.2.2 结果判定图示——条型
3.2.3 结果判定说明
•阳性结果：出现质控线和反应线两条紫红色线，实验结果为阳性。
•阴性结果：仅出现一条紫红色质控线，实验结果为阴性。 •无效：丌出现质控线红线或仅出现一条反应线红线，实验结果为 无效结果，应重试。 •竞争法的结果判定则相反
切条机
• • • • • • • • • • • • •
仪器参数: 进料宽度：≤100 mm 进料长度：不限,可连续进料切割 切割宽度：≥1 mm, 宽度连续可调 切割宽度设定位数：0.01 mm 切割精度：±0.1 mm 切割速度：230次/分钟, 速度连续可调 切条计数：单次工作和总工作分别计数 刀片: 日本进口, 耐磨高碳钢材料 抗静电装置：建议选配 电源：220VAC 重量：20KG 尺寸：430(L)×330(W)×260(H) mm