USP 微生物试验

藥品的微生物檢驗主要包括無菌性試驗，總
生菌數測定，黴菌及酵母菌數測定，以及病
原菌的檢驗等。不同製劑的微生物檢驗要求
不完全相同
微生物限量檢驗法之目的，在於提供測定各
種藥品自原料至最終成品中，嗜氧性總生菌 數及特定生菌種類之檢驗方法 在試驗之準備及操作中，對於檢品之處理需 嚴格注意無菌操作技術勿受細菌污染
95% 信賴區間
200-4000 90-1980 40-990 90-990 30-400 30-380 18-360 30-380 30-360 17-199 9-181 16-181 9-104 5-94 9-94 9-94 9-94 9-94 5-40
2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0
將稀釋檢液加菌培養在 30~35℃，18 ~ 24小時 取1 mL稀釋液，接種於100 mL MacConkey Broth，於42~ 44℃培養24 ~ 48小時 劃線接種到MacConkey Agar 上 ，30~35℃培養18 ~ 72小時。 若有疑似E. coli 之可疑菌落，則 可進行檢測試驗 若無疑似E. coli之 可疑菌落，表示藥 品可能對E. coli具 抑菌作用
消除藥品中抑菌作用之方法
Escherichia coli
MacConkey agar
陰性桿菌
EMB agar
GNB-14
TSIA CIT URE SIM VP ORN ARG LYS OXI
無色
培 養 基 生化試驗 分 數
AS (4)
TSIA AB (2) GAS (1) H2 S (4)
CIT CIT (2)
沙門氏菌
革蘭氏陰性桿菌，沙門氏菌對外界抵抗力較強， 但對熱耐受力差；對人類可引起傷寒和副傷寒腸 炎、腹瀉（食物中毒）及敗血症等 沙門氏菌引起的疾病稱為沙門氏 (salmonellosis)。 引起沙門氏菌性腹瀉最常見者有鼠傷寒沙門氏菌 (S. typhimurium)及腸炎沙門氏菌 (S. enteritidis)， 而引起敗血症常見者如和霍亂沙門氏菌 (S. choleraesuis)
新USP/EP/JP 藥典微生 物檢驗方法
USP Microbial Limits

Microbial Limit Tests” into two chapters: <61> Microbial Enumeration Tests: Total aerobic microbial count (TAMC)-嗜氧性總生菌數 Total combined yeasts and molds count (TYMC)- 總黴菌及總酵母菌數 <62>Tests for specified microorganisms New Harmonised Media: Changes Absence of Specified Microorganisms
檢體每 g (mL)之 MPN ＞1100 1100 460 240 290 210 150 93 160 120 75 43 64 38 23 36 29 35 28 21
95% 信賴區間
每組試管於培養終了顯示 微生物生長之試管數 〝 0.1 〞 〝 0.01 〞 〝 0.001 〞
檢體每 g (mL)之 MPN
連續稀釋檢液
濾膜法 傾注平板法 塗抹法
另作 稀釋液空白 培養基空白對照組
20 ~ 25℃培養5 ~ 7天
結果判讀
Test for specified microorganisms
1. 大腸桿菌 (Escherichia coli ) 2. 沙門氏菌 (Salmonella typhimurium ) 3. 金黃色葡萄球菌 (Staphy. aureus ) 4. 綠膿桿菌 (Pseudo. aeruginosa ) 5. 膽鹽忍受性革蘭氏陰性菌 (Enterobacteriaceae) 6. 梭狀產芽孢菌 (Clostridium spp.) 7. 白色念珠菌 (Candida albicans)
Most-probable-number method
9 mL TSB
0.1
10 倍稀釋檢液
A
取1 mL加入至加入3支「100」 之試管及試管「A」 0.01 9 mL TSB
B 9 mL TSB 9 mL TSB 取試管「A」1 mL加入至「10」 之3支試管及試管「B」
0.001
對照組
取試管「B」1 mL加 入至「1」之3支試管
Growth promotion and Inhibitory properties of the media
測 試 培 養 基
大腸桿菌 MacConkey Broth MacConkey Agar 沙門氏菌 Rappaport-Vassiliadis Broth Salmonella enterica ssp. enterica serotype typhimurium：生長 S. aureus：抑制 E. coli：生長、S. aureus：抑制 E. coli：生長及區分
濾膜法 傾注平板法 塗抹法 MPN法
另作 稀釋液空白 培養基空白對照組
30 ~ 35℃培養3 ~ 5天
結果判讀
黴菌及酵母菌數
藥 品
預試驗
黴菌與酵母菌-挑取 Candida albicans Aspergillus niger 分別調配≦100 CFU之菌液， 取1 mL加入 2 瓶10倍稀釋檢液中
引起沙門氏菌性腹瀉的藥品，常由動物性原料所 製成，引起腹瀉菌量約為105 cfu/g 以上
Salmonella
10倍稀釋檢液( TSB ) 預備試驗 檢測試驗 稀釋檢液培養在30~35℃ ，18 ~ 24小時 取0.1 mL稀釋液，接種於10 mL RV Broth，於30 ~ 35℃培養18 ~ 24小時 劃線接種到XLD 上，30~35℃培 養18 ~ 48小時。 若XLD上有可疑菌落，則挑取可 疑菌落進行： 1. BG、BS agar 2. Gram stain 3. TSIA 4. Salmonella 血清型試驗
大腸桿菌
（Escherichia coli）之檢驗
大腸桿菌
革蘭氏陰性桿菌，腸桿菌科埃希氏菌屬 (Escherichia) 部分血清型的大腸桿菌可引起腸道感染，稱為致 瀉性大腸桿菌根據其致病特點分為五種：
腸病原性大腸桿菌(EPEC)
腸侵襲性大腸桿菌(EIEC) 腸產毒性大腸桿菌(ETEC) 腸出血性大腸桿菌(EHEC) 腸黏附性大腸桿菌(EAEC)
Plate-count method – Pour plate
每 1 個稀釋倍數至少進行二重覆 TAMC : TSA 30~35℃培養 3~5天 TYMC : SDA 20~25℃培養 5~7天
Plate-count method - Surface spread
取不少於0.1 mL進行塗抹 每 1 個稀釋倍數至少進行二重覆 TAMC : TSA 30~35℃培養 3~5天 TYMC : SDA 20~25℃培養 5~7天
E. coli
10倍稀釋檢液( TSB ) 預備試驗 檢測試驗 稀釋檢液培養在30~35℃ ，18 ~ 24小時 取1 mL稀釋液，接種於100 mL MacConkey Broth，於42 ~ 44℃培養24 ~ 48小時 劃線接種到MacConkey Agar 上 ，30~35℃培養18 ~ 72小時。 若MacConkey Agar上有可疑菌 落，則挑取可疑菌落進行： 1. EMB agar 2. Gram stain 3. IMViC Test 4. GNB-14
＜0.45μm 濾膜，每 1 個稀釋倍數至少進行二重覆 TAMC : TSA 30~35℃培養 3~5天 TYMC : SDA 20~25℃培養 5~7天
結果判讀
由兩個培養皿中菌落數之平均值乘以其最終稀 釋倍數，即為每 g 或 mL檢體之微生物總數 若於10 倍稀釋檢液之培養皿中無菌落產生，表 至此檢體每 g或每 mL之微生物總數為1 個以下。 以＜1 CFU/g（mL）表示
URE URE (1) IND (4)
SIM MOT (2) IPA (1)
VP VP (4)
ORN ORN (2)
ARG ARG (1)
LYS LYS (2)
OXI OXI (1)
試驗結果
+
+
7
+
-
0
-
+
4
-
-
+
2
-
+
2
-
鑑定密碼
菌種鑑定 名 稱
Escherichia coli
沙門氏菌 (Salmonella spp. ) 之檢驗
1 1 1 0 0 0 3 2 2 1 1 0 0 0 3 2 1 ຫໍສະໝຸດ Baidu 0 0
2 1 0 2 1 0 0 1 0 1 0 2 1 0 0 0 1 0 1 0
27 20 15 20 14 9.2 16 15 11 11 7.4 11 7.2 3.6 9.4 6.2 6.1 3 3 ＜3
9-94 5-38 4-38 5-38 4-35 1.5-35 5-38 5-38 4-35 4-35 1.3-20 4-35 1.2-17 0.2-17 3.5-35 1.2-1.7 1.2-1.7 0.1-10 0.1-9.5 0-9.4
Method of the examination

Membrane filtration

Plate-count method - pour-plate method - surface-spread method
Most-probable-number method

Membrane filtration
結果判讀
並選取＜250 CFU (總生菌數) 、＜50 CFU (黴菌及酵母菌數)的菌落之兩個培養皿來計 算菌落的數量
由兩個培養皿中菌落數之平均值乘以其最終稀 釋倍數，即為每 g或 mL檢體之微生物總數 若於10倍稀釋檢液之培養皿中無菌落產生，表 至此檢體每 g或每 mL之微生物總數為10 個以 下。以＜10 CFU/g（mL）表示
測 試 菌 種 及 特 性
Salmonella enterica ssp. enterica Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar serotype typhimurium、E. coli： 生長及區分 綠膿桿菌 Cetrimide Agar Pseudomonas agar P 金黃色葡萄球菌 Mannitol Salt Agar S. aureus：生長及區分 E. coli：抑制 P. aeruginosa：生長及區分 E. coli：抑制 P. aeruginosa：生長及區分 E. coli：抑制




Salmonella-沙門氏桿菌 Pseudomonas aeruginosa -綠膿桿菌 Staphylococcus aureus-金黃色葡萄球菌 Escherichia coli -大腸桿菌 Clostridium spp. -梭狀產芽孢菌 (formerly Cl. perfringens) Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria-膽鹽忍受性革蘭氏陰性菌 (formerly Enterobacteriaceae) Candida albicans-白色念珠菌(NEW)
嗜氧總生菌數
預試驗
藥 品
連續稀釋檢液
總生菌數-挑取 Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Candida albicans Aspergillus niger 分別調配≦100 CFU之菌液，取1 mL加入5瓶10倍 稀釋檢液中
結 果 判 讀
對照組：應保持澄清（即應無菌生長），否則 試驗無效 試驗組：可由下表查出檢體每g或每mL最可能 含有好氧性微生物之總數 若在判讀上出現困難，則重新活化在相同的 broth 或 TSA上，以30 ~ 35℃培養 1 ~ 2天
每組試管於培養終了顯示 微生物生長之試管數 〝 0.1 〞 〝 0.01 〞 〝 0.001 〞 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 2 1 1 1 1 0 0 0 3 3 2 2 2 3 2 1 0 3 2 1 0 3 2 1 0 2 1 0 1 0 2 1 0