人感染H7N9禽流感采样以及实验室检测技术
人感染H7N9采样方法及实验室检测策略
采集鼻咽拭子注意事项
• 1、采样时用干拭子采，不能蘸采样液，因为采样 液中有抗菌素，防止过敏。
• 2、采样液平时保存在-20℃或-70℃，采样前融化 到4℃。
• 3、采样液颜色呈紫色时失效不能用了。
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本 采集方法（2）
• 三、标本运送：
• • 新鲜的临床采集标本应在4℃条件下随样品送检单24小时
（二）标本转送和检测
• 1.H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染 的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。病 例的临床标本采集后，县级疾病预防控制机构和病例收治 的医疗机构要密切配合，按照生物安全的相关规定进行包 装，在24 小时内送到当地流感监测网络实验室进行检测。
• 2.当地流感监测网络实验室收到标本后24 小时内，立即对 呼吸道标本开展甲、乙型流感病毒通用引物、H5、H7亚型 的检测。
内运送至市CDC流感检测实验室。未能24小时内送至实验 室的，应置-70℃或以下保存；冻存的标本应在冻存条件 下，低温送至实验室。
• 四、采样时的生物安全防护：
• 采样时应带口罩，穿隔离衣，带一次性手套及帽子。若在 现场进行快速检测，应将现场用过的所有废物带回销毁。
谢谢，祝大家工作顺利！
• 若当地流感监测网络实验室检测结果为H5、H7核酸检测 阳性时，应当于24小时内将其中2管呼吸道相关原始标本 分别送省级疾控中心流感网络实验室和国家具备相应生物安全条件的网络实验室可开展病毒 分离，并将分离的毒株按要求及时送国家流感中 心。
• 3.若当地流感监测网络实验室检测结果为甲型流 感和乙型流感通用引物均阴性时，应当立即将1管 原始呼吸道标本送省级疾控中心。省级疾控中心 收到标本后，应当立即对其中1管进行SARS 、新 型冠状病毒等相关病原体的检测，另1管送国家流 感中心。
人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案
附件2人感染高致病性禽流感标本采集及实验室检测技术方案为及时、科学地采集和运送人禽流感病例或疑似污染环境等各种类型的标本，规范实验室检测程序和检测方法，提高检测质量，明确诊断或开展相关科学研究，特制定本方案。
1 采集对象1.1 人禽流感医学观察病例、疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例。
1.2 其它需要进行人禽流感诊断或排除者。
1.3 需要采集的环境标本。
2 采集要求2.1 从事人禽流感检测标本采集的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能。
在标本采集过程中，采样人员参照（附件5）规定的防护措施进行安全防护。
2.2 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾病预防控制机构专业人员指导下采集。
2.3 标本采集具体种类和数量由现场工作组确定。
2.4 密切接触者标本由当地疾病预防控制机构负责采集。
2.5 根据实验室检测工作的需要，结合病程再次采样。
3 标本种类每个病例应尽可能同时采集上、下呼吸道标本；需要排除人禽流感的死亡病例则依据《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》（中华人民共和国卫生部令第43号）的规定采集尸体标本，没有条件进行尸体解剖的，可采集呼吸道灌洗液或经皮穿刺采集肺组织标本。
3.1 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。
最佳采集时间为发病后3天内。
3.2 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺组织活检标本。
3.3 尸检标本：病人死亡后应依法尽早进行解剖，在严格按照生物安全防护的条件下，进行尸检，主要采集肺、气管组织标本，条件允许下也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等组织标本。
3.4 血清标本：每一病例必须采集血清标本，须采集急性期、恢复期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）采集，第二份血清应在发病后1第3～4周采集。
采集量要求5ml，以空腹血为佳，建议使用真空采血管。
3.5 其它标本：如果病例有腹泻症状，可在发病后采集粪便标本；有胸水者可采集胸水标本。
人感染H7N9禽流感采样以及实验室检测技术
用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟， 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管 中。
样本采集方法 (5)
鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：
用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取 呼吸道分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负 压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用 采样液3ml涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射 器上来代替收集）。
注：应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼 吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的恢复 期血清。
要求 呼吸道标本：发病早期采样，每份不少于3ml 血清标本每份分为2管，每管不少于0.5ml
样本采集方法 (1)
咽拭子：左手用压舌板压住患者舌头，右手用2根聚丙烯纤
维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免 接触舌头，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋 紧管盖。
胞分类计数减少； 4. 不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所
致的肺炎。
• 包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱 液和鼻洗液）；
◆下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）；
◆ 血清标本；
◆ 如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行尸 体解剖，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本；
样本采集方法 (4)
鼻洗液 患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患 者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧 杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔
漱口液 用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理
盐水在咽部转动。然后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。
人感染H7N9禽流感病毒PCR检测操作程序
附件医院人感染禽流感病毒核酸检测标准操作程序一、目的确保人感染禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。
二、适用范围医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔〕号）和《关于做好医疗机构人感染禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔〕号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染禽流感病毒核酸检测工作。
三、样本采集、运送和保存尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。
可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。
患者有下呼吸道样本时，应优先采集。
根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（），并组织样本采集人员进行培训及考核。
样本的采集应当严格按照进行。
样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。
若气温高时，需放入冰块降温。
样本抵达实验室后，应尽快进行检测，小时内能检测的样本可置于～℃暂时保存，小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。
如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。
样本避免反复冻融。
样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。
四、检测（一）样本处理样本的核酸提取应当在样本处理区进行。
按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。
样本应尽可能新鲜，提取过程应严防酶污染及操作不当导致的降解。
提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。
提取好的应及时用于检测，否则应当-70℃保存。
人感染H7N9禽流感病毒标本采集-北仑区人民医院
北仑区人民医院检验科人感染H7N9禽流感病毒标本采集、保存、运送实验活动要求根据浙江省卫生厅《关于做好人感染H7N9禽流感病毒实验活动生物安全管理工作的通知》未经培养的临床样本应当在已经市卫生局备案的生物安全二级实验室生物安全柜内分装、灭活和核酸提取。
在生物安全二级实验室开展实验活动时，个人防护应当佩戴眼罩、N95及以上水平的口罩等防护装备。
根据《人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一版）》规定，H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。
原始标本采集呼吸道病毒的诊断取决于高质量标本的采集，及其保存运输等环节。
多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
标本采集人员医疗机构的医生、护士或疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照相关要求做好个人防护。
采集前的准备防护用品：1.口罩(N-95 or N/P/R-100)2.手套3.帽子4.鞋套5.防护服6.防护目镜采集物品包参考下图：常用的采样液/病毒运输液(VTM）1.pH 7.4～7.6的Hanks液2.MEM/DMEM液在采样液中需加入抗菌素，可用青霉素（终浓度为100U/ml）、庆大霉素（终浓度为1mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为2µg/ml）。
在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。
采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻及口咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄。
采集对象1.监测病例，同时具备以下4项条件的病例：（1）发热(腋下体温≥38℃)；（2）具有肺炎的影像学特征；（3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数减少；（4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎。
2.人感染H7N9禽流感疑似病例与确诊病例，定义参照《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第1版）》标本种类上呼吸道标本：咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液下呼吸道标本：气管吸取物、肺洗液、肺组织标本血清标本：发病7天内急性期血清和间隔2-4周的恢复期血清如病人死亡，可采集组织标本：肺组织、气管、支气管组织等注意事项：1.应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼吸道标本）。
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本
人感染H7N9禽流感病毒鼻咽拭子标本采集方法
采样物品：
•采样液、专用病毒采样拭子由市疾控中心提供，其他物品（如冷藏箱，采样时的生物安全防护用品等）自备。
•二、鼻咽拭子采样方法
•1、鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内，轻轻转动鼻咽拭子，并向鼻腔内部推进至鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出，将拭子头浸入采样液中，尾部折断弃去。
•2、咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的鼻咽拭子用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入采样液中，尾部折断弃去。
人感染H7N9禽流感病毒培训ppt课件
标本运输
经过行政审批 包装
临床样品：B类， UN3373包装 病毒分离物： A类， UN2814包装
专人专车运输并注意防护
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感染性物质包装分类
航空运输B类包装（ UN号3373
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A类、 B类包装的区别
定义 运输专用名称
UN编号
运输对象
UN专用标记 主容器 次级容器 外包装
发病早期白细胞总数降低或正常、淋巴细胞分类计数 减少；
经规范抗菌药物治疗3－5天
监测病例（同时具备以下4项）：
发热(腋下体温≥38℃)
具有肺炎的影像学特征
发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类计数 减少
不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺炎
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病例定义
疑似病例：
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Eagel`s基础培养基
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咽拭子
用灭菌棉签（最好用塑料柄、尼龙拭子，因为 木头柄棉拭子会抑制PCR实验）擦拭双侧咽扁桃 体及咽后壁，将棉签头部浸入3-4ml采集 液中，尾部弃去
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采咽拭子的器材和容器
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标本采集要求
为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加 入抗菌素，加入庆大霉素（终浓度0.1mg/ml可高 至0.5mg/ml ）、抗真菌药物（终浓度2ug/ml）。 加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4， 配制好的 采样液，分装每个采样管3-4ml，-20℃冻存。
庆大霉素:80mg（８万单位）／2ml
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h7n9禽流感诊断标准
H7N9禽流感是一种由H7N9亚型甲型流感病毒引起的呼吸道感染疾病。
该病毒首次在2013年在中国被发现，并能够从禽类传播给人类。
H7N9禽流感的诊断标准主要包括流行病学史、临床表现和实验室检测：
1.流行病学史：
-患者在发病前14天内有活禽市场的暴露史，或接触过病死禽或其它H7N9禽流感病例。
-患者有与已知H7N9禽流感病例的密切接触史。
2.临床表现：
-发热（体温≥38°C）。
-呼吸道症状，如咳嗽、咳痰或呼吸困难。
-部分病例可出现头痛、肌肉痛、全身乏力等全身症状。
-重症病例可迅速进展为严重肺炎、急性呼吸窘迫综合症（ARDS）、休克或多脏器功能衰竭。
3.实验室检测：
-通过实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、病毒分离或血清学检测确认H7N9病毒感染。
综合以上因素，当患者符合流行病学史和临床表现，并且实验室检测结果阳性时，可以确诊为H7N9禽流感。
对于疑似病例，应尽快进行实验室检测，并根据检测结果和临床表现进行综合评估。
由于H7N9禽流感具有一定的致死率和人传人的潜在风险，对疑似病例应及时进行报告、隔离和治疗，以防止疾病的进一步传播和爆发。
感染HN9禽流感病毒毒病毒原特点及实验检测
CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
人感染H7N9禽流感病毒 实验室检测
CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
A/H7N3
禽
2004/加拿大
2/结膜炎、ILI; 1名LPAI；1名HPAI
A/H5N2
禽
2005/日本(Ibaraki) 13/无临床症状，血清学诊断
A/H7N2
禽
2007/英国(Wales) 1/结膜炎、ILI
A/H9N2
来源不清
2007/香港
1/ ILI
A/H10N7
鸭
2004/埃及( Ismaillia) 2/ ILI
共25株
均为LPAI 无感染人病例
亚洲：7株 均来自野禽 5株—韩国 2株—蒙古
CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
H7N9的致病力和传播力
HPAI H7N3
HPAI H7N3
LPAI H7N9
LPAI H7N9
LPAI H7N9
A/H7N7
鸥
1980/美国
3/结膜炎
A/H7N7
鸭
1996/英国
1/结膜炎
A/H5N1
禽
1997/香港
18/ILI，肺炎
A/H9N2
鸡
1998/中国广东
5/ ILI，肺炎
A/H9N2
禽
1999/香港
2/ILI
A/H7N2 A/H9N2
禽流感实验室采样
禽流感实验室采样一、原始标本采集1、标本采集由医生、护士或疾病预防控制中心专业人员负责标本采集并填写标本登记表，标本采集人员按照《禽流感职业暴露人员防护原则》做好个人防护。
2、标本采集种类和时限（1）采集标本的种类：疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清以及死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。
（2）采集标本时间：①咽、鼻拭子或含漱液在发病的头3天采集；②急性期血清在发病后7天内采集，恢复期血清在发病后2-4周采集；③尸检标本尸检时采集。
3、标本的运送所有采集的标本应在医院采集时立即分装，一式两份，其中一份单独保存，以备复核，采集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在一70℃以下保存。
无一70℃条件的需在一20℃冰箱短时间暂存，井尽快联系递送标本。
4、标本采集的方法（1）鼻拭子将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻愕处，停留片刻后缓慢转动退出。
以另一拭子拭另侧鼻孔。
将拭子头浸入4-5m1采样液中，尾部弃去。
然后，塞紧或盖好管盖。
（2）咽拭子用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭两侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入4-5m1采样液中，尾部弃去，塞紧或盖好管盖。
注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
（3）鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取枯液或从气管抽取气管和支气管分泌物。
先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。
收集抽取的粘液，并用采样液5m1测洗收集器3次。
近来国内有用小孩导尿管接在50m1注射器上来替代收集器。
（4）漱口液用10m1采样液（生理盐水）漱喉。
漱时让患者头部微后仰，发吱声，让洗液在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯收集漱液。
（5）鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5m1生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。
然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。
重复此过程洗两侧鼻孔。
（6）肺活检材料肺活检组织在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入抗菌素＜X、链霉素，或庆大霉素和抗真菌素）。
人感染H7N9禽流感诊断报告流程
人感染H7N9禽流感诊断报告流程一、流行病学调查流行病学调查是诊断人感染H7N9禽流感的第一步，主要目的是了解病例的相关信息，如接触禽类及禽类排泄物的情况、旅游史、近期接触史等。
流行病学调查有助于确定病例是否存在暴露的风险因素，进一步指导诊断过程。
二、临床表现评估对于疑似病例，医生需对其进行详细的临床评估。
人感染H7N9禽流感的症状与其他呼吸道感染病症相似，包括高热、咳嗽、咳痰、头痛、肌肉酸痛、流鼻涕、咽痛、乏力等。
但H7N9禽流感的特点是病情进展迅速，容易导致重症甚至死亡。
三、实验室检测在临床表现评估的基础上，通过实验室检测来确认人感染H7N9禽流感。
主要的实验室检测方法包括呼吸道标本分离病毒和测定病毒感染相关的生物标志物。
常见的呼吸道标本有咽拭子、鼻拭子、痰液、呼吸道分泌物等。
分离病毒可通过病毒培养、免疫荧光试验、RT-PCR等方法进行。
此外，还可以通过血清学检测尼群诺酮结合试验等，测定抗原和抗体水平。
四、病例报告一旦诊断出病例为H7N9禽流感感染，医生应立即向当地卫生部门进行报告。
涉及到人感染H7N9禽流感等副职医学事故的报告、处理和追踪管理等，都需要严格按照当地卫生部门的要求操作。
五、鉴别诊断确认人感染H7N9禽流感的临床症状与其他冠状病毒感染病症相似，如人感染SARS、MERS等。
因此，在诊断H7N9禽流感之前，需要排除其他疾病的可能性。
此外，应与常见的流感、金黄色葡萄球菌感染等进行鉴别诊断。
总之，诊断人感染H7N9禽流感的流程包括流行病学调查、临床表现评估、实验室检测、病例报告和鉴别诊断确认等。
及时、准确地诊断人感染H7N9禽流感对于疫情的防控以及患者的治疗具有重要意义。
人感染高致病性禽流感标本采集及实验室技术--zhh
标本采集对象
➢人禽流感预警病例；
➢人禽流感医学观察病例、疑似病例、临床 诊断病例及需要进一步研究的确诊病例；
➢其他需要进行人禽流感诊断和排除者；
➢根据需要可采集病、死禽密切接触者和禽流 感病人密切接触者及环境标本。
标本采集要求
▪ 从事人感染高致病性禽流感检测标本采集 的技术人员必须经过生物安全培训和具备 相应的实验技能。在样本采集过程中，采 样人员必须采取三级生物安全防护
➢临床标本的分装和核酸提取要求在生物安全Ⅱ级 （BSL-2）实验室的生物安全柜内进行；病毒培养 物的核酸提取要求在生物安全Ⅲ级实验室（BSL-3） 的生物安全柜内进行，实验人员均采取三级生物安 全防护
实验室生物安全
➢核酸检测和抗原快速检测要求在生物安全Ⅱ级实 验室（BSL-2）的生物安全柜内进行，实验人员 采取三级生物安全防护
各检测项目阳性报告
3.病毒分离及鉴定：分离出病毒，并经鉴定为H5亚型 或H5N1亚型。
4.血清学检测：报告血清抗体滴度。病人双份血清抗 体滴度有4倍或以上增高有诊断意义。
各检测项目阴性报告
1.H5基因核酸检测：具备以下任一条
➢两对H5亚型特异性引物均不能够扩增出预期大小 的产物；
➢仅一对H5亚型特异性引物能够扩增出预期大小的 产物，产物序列不支持为禽流感病毒
错误
错误 返回
标本运输包装
返回
➢ 咽漱液：用10ml不含抗菌素的采样液漱口（漱时让患者 头部微后仰，发“噢”声，让洗液在咽部转动），然后将
咽漱液收集于50ml无菌的螺口塑料管中。无条件的可用 平皿或烧杯收集咽漱液并转入10ml螺口采样管中。
标本采集方法
➢ 深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集 于含3ml采样液的50ml螺口采样管中。
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样本的运输
1、病毒培养物按照A类感染性物质进行包装运输， 其他感染性物质按照B类感染性物质进行包装运输。
2、病例的临床标本采集后，县级疾病预防控制机 构和病例收治的医疗机构要密切配合，按照生物安 全的相关规定进行包装，在24小时内送到当地流感 监测网络实验室进行检测。
• 患儿俯卧抬头，采集者左手托住患儿的下颌部，右手持无菌拭 子，将干拭子与上颚平行插入鼻孔（不要向上）直接与鼻咽后 壁接触，深度与到耳导管基本一致，轻轻旋转5秒吸附分泌物， 慢慢移出拭子，将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。
样本采集方法 (3)
拭子的要求：
• 标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯 纤维）
液和鼻洗液）；
◆下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）； ◆
血清标本；
◆
如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行尸 体解剖，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本；
注：应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标本（尤其是下呼 吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的恢复 期血清。 要求 呼吸道标本：发病早期采样，每份不少于3ml 血清标本每份分为2管，每管不少于0.5ml
医疗机构
呼吸道标 本
无条件开展检测 或甲型抗原检测阳性 24h内
疑似病例双份血清样本
核酸检测H7阳性，48h内
送当地CDC网络实验室，进一步送省CDC
当地CDC流感网络实验室
H7N9禽流感病毒检 测阳性的标本
24h内
医疗机构未进行过 检测的疑似病例标 本
24h内
•
•
结果判断
• 4 .所有的临床标本RNA 检测都必须为阳性，且CT 值在35.0 以内才足可以证明样品的质量是可接受的。如果临床标本 RNA 检测为阴性，则可能是以下原因： • 4.1 临床样本核酸提取不正确导致RNA 的丢失或临床标本 里存在大量的RT-PCR 反应抑制剂。 • 4.2 样品中人细胞成分太少，以至于不能检测到。 • 4.3 反应液配制错误或程序设置错误。
环境标本检测送检要求
对人感染H7N9禽流感确诊病例可能暴露的 禽类饲养或交易等场所，采集禽类粪便、 笼具涂拭标本和环境污水等标本2周内开展 甲型流感通用引物、H5、H7和H9亚型检测。 没有条件开展病毒分离的实验室在2周内将 阳性标本送国家流感中心。具体技术要求 可参考《职业暴露人群血清学和环境高致 病性禽流感监测方案（2011年版）》。
样本的分装与保存
• 样本的分装：
采集的呼吸道标本每份分为3 管，每管不少于1ml。血清标本每份分为 2 管，每管不少于0.5ml。并填写湖南省不明原因肺炎病例疑似 人禽流感病例标本送检单。
• 样本的保存：
所有呼吸道标本应保存在4℃ ，并尽快放置在‐70℃。如 果没有‐70℃度冰箱，标本应保存在4℃ ，但不超过24小 时。切勿置于-20 ℃长期保存 。 血清样本应置-20 ℃长期保存 。 注：标本运送期间应避免反复冻融。
Dliu et al., Lancet, 2013
Gao RB, et al, NEJM,2013
Morens DM et al, NEJM, 2013
Yi Guan et al, Nature , 2013
采样人员
• 负责人感染H7N9禽流感病毒检测样本采集 的操作人员必须经过生物安全培训合格， 并具备相应的操作技能。 • 样本采集过程中操作者要加强防护，应穿 戴防护服、眼罩、N95及以上水平的医用防 护口罩、帽子、双层医用乳胶手套、鞋套 等个体防护装备。
阳性标本送检要求
若当地流感监测网络实验室检测结果为H7亚型禽流感病毒核酸 阳性时，应当于48小时内将其中2管呼吸道相关原始标本送省级 疾控中心网络实验室。 省级疾控中心网络实验室在接到医疗机构和本省网络实验室送 检的H7和H5亚型阳性的呼吸道标本时，未能开展病毒分离的省 级疾控中心网络实验室将阳性病例的原始标本48小时内送国家 流感中心开展病毒分离。 各医疗机构采集的双份血清标本48小时内送当地流感监测网络 实验室，由当地网络实验室48小时内将血清标本分别送省级疾 控中心和国家流感中心开展相关抗体检测，进行病例诊断。 对于甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株和阳性标 本要求在48小时内送至国家流感中心。
鼻洗液 患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患 者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧 杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔 漱口液 用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理 盐水在咽部转动。然后，用50ml的无菌螺口塑料管收集洗液。
检测策略
• 不明原因肺炎病例标本检测： 建议各流感监测网络实验室收到不明原因肺炎标 本后，要在12小时内进行标本处理和核酸检测， 同时进行甲型/乙型通用引物，甲型H1N1流感， 季节性H3N2流感，A（H5）、A (H7和N9)亚型流 感病毒的检测。如果H5或H7/N9亚型检测阳性， 在生物安全三级实验室进行流感病毒的分离鉴定， 无病毒分离条件的实验室，将标本在24小时内送 国家流感中心进行复核鉴定和病毒分离。
人感染H7N9禽流感 采样以及实验室检测技术
湖南省疾病预防控制中心
微生物检验科 黄一伟 2014.8.21
流感病毒
流行性感冒病毒（简称流感病毒）：
是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类 学上，流感病毒属于正黏液病毒科
理化特性：
对热敏感,56℃30min可灭活；最适pH为7.0～8.0，＜3.0 和＞10.0感染力很快被破坏；对紫外线敏感；对乙醚、氯 仿、丙酮等有机溶剂均敏感。 禽流感病毒灭活应该是65°30min，或者煮沸100°2min。
病原学检测
• （1）甲型流感病毒抗原筛查。呼吸道标本甲 型流感病毒抗原快速检测阳性。但仅可作为初 筛实验。 • （2）核酸检测。对患者呼吸道标本采用real time PCR（或RT-PCR）检测H7N9禽流感病毒核 酸。 • （3）病毒分离。从患者呼吸道标本中分离 H7N9禽流感病毒。 • （4）动态检测双份血清H7N9禽流感病毒特异 性抗体水平呈4倍或以上升高。
标本采集对象
• 不明原因肺炎病例。同时具备以下4条的病例: 1. 发热(腋下体温≥38℃)； 2. 具有肺炎的影像学特征； 3. 发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细 胞分类计数减少； 4. 不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所 致的肺炎。 • 人感染H7N9禽流感疑似病例
样本类型
◆上呼吸道标本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱
强化监测采集的ILI 和SARI病例标本
48h内 阴性
血清 标本
H5，H7
阴性
甲、乙型通用及H5，H7
甲通阳性
H7/H5阴性
检测结束 停止 季节性流 感检测 病毒分离
及
医疗 机构 检测 H7 阳性 标本
季节性流感检测
H5/H7阳性
省级CDC实验室
血清
具备条件开展病毒分离
阳性 2周内完成
未能开展病毒分离
样本采集方法 (4)
血清标本
用真空负压采血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟， 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于2ml无菌螺口塑料管 中。
样本采集方法 (5)
鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：
用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取 呼吸道分泌物。先将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负 压，旋转收集器头部并缓慢退出；收集抽取的粘液，并用 采样液3ml涮洗收集器1次（可用小孩导尿管接在50ml注射 器上来代替收集）。
样品采集/接收
• 对于人禽流感，咽拭子比鼻拭子检出率高。病毒滴度：气 管吸取物>咽拭子>鼻拭子，粪便中可能可检出。 • 标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原 始标本分为三份，取一份进行检测，其余保存在－70 ℃或 －70 ℃以下，短时间保存在4℃ ，不要保存在－20 ℃ 。
• 在生物安全二级实验室从事相关实验室活动时，操作者应 穿戴眼罩、N95及以上水平的医学防护口罩、防护服、帽 子、双层乳胶手套、鞋套等个体防护装备；实验活动应当 有２名以上的工作人员共同进行。
实验操作注意事项－避免污染
• 应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的 方法：
– (a)实验准备与核酸提取使用独立区域； – (b)实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器， 微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）； – (c)实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无 粉手套； – (d)不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况 下均更换手套； – (e)试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
呼吸道灌洗液：
将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管（约30cm深 处），注入5ml生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓 慢退出；收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器1次（可 用小孩导尿管接在50ml注射器上来代替收集）。
禽流感环境标本采集
• 采集粪便时一定要采集新鲜的（一般较湿润）粪 便，太陈旧（干燥）的粪便对我们的检测意义不 大； • 在养殖户家中采集粪便标本时，由于多鸡鸭混养 难以分辨鸭粪和鸡粪，最好能找到鸭子刚排泄的 新鲜粪便；
样本采集方法 (1)
咽拭子：左手用压舌板压住患者舌头，右手用2根聚丙烯纤
维头的塑料杆拭子同时檫拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免 接触舌头，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋 紧管盖。
样本采集方法 (2)
• 鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻
腭处（通常5cm以上），停留片刻后缓慢转动退出；取另1根聚 丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔；将上 述2根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，弃去尾部，旋紧管盖。
• 铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄