大肠菌群平板计数法
食品安全国家标准 大肠菌群计数
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数1范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2术语和定义2.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
3检验原理3.1 MPN法MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
3.2 平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。
4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
4.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
4.4 天平：感量0.1 g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
4.9 无菌培养皿：直径90 mm。
4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
4.11 菌落计数器。
5 培养基和试剂5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检测的项目。
在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群平板计数法的注意事项。
方法选择相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。
但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。
但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。
假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。
若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标此处不再赘述。
因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。
培养基的要求平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。
无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。
特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。
大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。
当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。
另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。
但值得注意的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。
稀释度的确定国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。
大肠菌群平板计数法方法学验证报告
GB 4789.3-2016大肠菌群平板计数法方法学验证报告一、验证目的验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验大肠菌群计数（大肠菌群平板计数法）》在本实验室的适用性。
二、验证方法本实验样品取不同不同类型产品进行实验，严格按照GB4789.3-2016进行，除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂1.冰箱：BCD-212DG/A 海信（北京）电器2.生化培养箱：LRH-70 上海一恒科学仪器3.电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司4.无菌均质器：SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司5.恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂6.菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司7.天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司8.超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业9.显微镜：B203LED 重庆奥特光学仪器有限公司培养基和试剂：1.结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）北京陆桥技术股份有限公司2.煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤北京陆桥技术股份有限公司3.无菌生理盐水：同GB 4789.3项下制法。
四、验证环境1.依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；2.依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；3.依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录；4.无菌室检验：详见《xxxx》；五、验证步骤1.样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品放入盛有225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
大肠菌群检测中平板计数法主要操作要领
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
计量大肠菌群数量的计数方法
计量大肠菌群数量的计数方法大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
直接或间接来自人与温血动物的肠道：包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，其中大肠埃希氏菌属为最典型大肠埃希氏菌。
一、卫生学意义人与温血动物粪便污染的指示菌：•大肠埃希氏菌——粪便近期污染；•其他菌属——粪便陈旧污染。
肠道致病菌污染食品的指示菌：•与肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）来源相同；在外界生存的时间与主要肠道致病菌一致。
二、修订的主要内容本标准与GB4789.2-2010相比，主要修改如下：1、删除了标准的英文名称2、修改了发布单位名称2010版本“中华人民共和国卫生部”2016版本“中华人民共和国国家卫生盒计划生育委员会”和“国家食品药品监督管理总局”3、前言：本标准代替GB4789.3—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。
本标准与GB4789.3—2010相比,主要变化如下:———增加了检验原理;———修改了适用范围;———修改了典型菌落的形态描述;———修改了第二法平板菌落数的选择;———修改了第二法证实试验;———修改了第二法平板计数的报告。
三、大肠菌群计数的两种方法第一法MPN法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。
检验原理：MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
第二法平板计数法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
检验原理：大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。
饮料—大肠菌群的测定—平板计数法
3.3 乳糖发酵管 3.3.1 成分
蛋白胨
20g
乳糖
10g
0.04％溴甲酚紫水溶液
25mL
蒸馏水 3.3.2 制法
1000mL
将蛋白胨及乳糖溶于水中,校正 pH7.4,加入指示剂,分装 3mL,并放入一个小倒管,115℃高
压灭菌 15min。
3.4 EC 肉汤
3.4.1 成分
1
胰蛋白胨
20g
3 号胆盐(或混合胆盐)
匀稀释液。
5.2.2 用 1 mL 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1 mL，注入含有 9 mL 灭菌生理盐水或其他稀释
液的试管内，振摇试管混匀，做成 1：100 的稀释液。
5.1.3 另取 1 mL 灭菌吸管，按上条操作依次做 10 倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1
支 1 mL 灭菌吸管。
5.1.4 根据饮料卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。
FSPYL026 饮料 大肠菌群的测定 平板计数法
F_SP＿ YL＿026
饮料—大肠菌群的测定—平板计数法
1 范围 本方法采用平板计数法测定饮料中的大肠菌群。
本方法适用于饮料中大肠菌群的测定，饮料中大肠菌群数系以 １００ ｍＬ（ｇ）检样内大肠
菌群最可能数（ＭＰＮ）表示。
2 原理
饮料检样经处理，在需氧及兼性厌氧、37℃条件下培养，通过计数报告检样中大肠菌群 最可能数。大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
3.2.1 成分
蛋白胨
10g
乳糖
10g
磷酸氢二钾
2g
琼脂
17g
2%伊红 Y 溶液
20mL
大肠菌群计数
4. 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样 品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸 管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试 管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其 混合均匀，制成1:100的样品匀液。
5. 根据对样品污染情况的估计,按上述操作， 依次制成系列十倍递增系列稀释样品匀液。 每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或 吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全 过程不得超过15min。
1.本表采用三个稀释度【0.1g(ml),0.01g(ml),0.001g(ml),】每个稀释度接种三管。
2.表内所列检样量如改用 1g (ml),0. 10 1 3 0 16 4.5 1g(ml),0.01g(ml), 42 3 2 表内数字相应降低 1 150 37 倍；420
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0.01g(ml),0.001g(ml),0.0001g(ml) 0 0 9.2 1.4 38 时，则表内数字应相应增高 3 2 2 210 10倍，其余类推。 40 430 如改用
稀释度的选择
将待检样品选取适宜的2~3个连续稀释度, 每个稀释度接种两 对照。及时将15mL~ 20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂
0.001 0 1 0
1 0 0 0 1 2 0 1 0 1
高 9.5 9.6 11
18 18 38 18 18 38 20 38 42 42
0.01 2 2 2
3 3 0 0 0 1 1 1 1 2
0.001 0 1 2
0 1 0 1 2 0 1 2 3 0
MPN
95%置信区间 低 4.5 8.7 8.7
卫生指示菌——大肠菌群
(1)检验程序依据《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》(GB 4789．3—2010)，第一法的大肠菌群MP’N计数法检验程序见图3-7，第二法的大肠菌群平板计数法检验程序见图3-8。
(2)原理1)大肠菌群MPN计数法检验月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lauryl tryptose broth，LST)中的胰蛋白胨或胰酪胨提供碳源、氮源、硫和小量的生长因子，磷酸氢二钾(K2HPO4)和磷酸二氢钾(KH2PO4)提供缓冲能力，氯化钠维持渗透压。
乳糖是最主要的碳源，几乎所有的大肠菌群计数方法都是基于乳糖发酵实验，乳糖发酵产气是一个主要的筛选条件。
所以在大肠菌群的检测培养基中，乳糖就是一个鉴别性成分。
月桂基硫酸钠具有选择性，能抑制除了大肠菌群以外的其他微生物。
煌绿乳糖胆盐肉汤(brllliant green lactose bile broth，BGLB)含有两种抑制剂，牛胆盐和煌绿染料，它们能抑制革兰氏阳性细菌和产芽孢细菌。
同时选择出革兰氏阴性细菌。
大肠菌群细菌不受这两种抑制剂的影响，能发酵乳糖并生长繁殖。
从产气可以确定发酵反应的进行。
使用MPN法的假设前提是细菌随机分布、细菌细胞单个分布(不成串)、有生长繁殖能力和细菌生长有合适环境。
相对于平板计数的优势，MPN法接种量大；能检测较少数量的污染；预制的液体培养基是凉的，比直接倒的热的液体培养基危险性小，对检测目标菌的伤害小；可以提前准备培养基。
MPN表中阳性管的设定不是连续的，因为有些组合在统计学上的概率非常小，几乎是不可能发生的。
如果结果出现了表中没有的组合．应该重新检测，因为很可能结果是错误的。
2)大肠菌群平板计数法检验结晶紫中性红胆盐琼脂(violet red bile agar，VRBA)含有蛋白胨提供碳源、氮源．酵母提取物提供B族维生素刺激细菌的生长。
胆盐和结晶紫抑制大多数革兰氏阳性细菌。
乳糖是碳源，中性红是pH指示剂。
(3)应注意的问题1)发酵管灭菌后，最好能在高压灭菌锅内，等待温度降至摩温，若发酵管还是热的就从高压灭菌锅内取出．在室温下降温．倒管顶部会出现小气泡．给检验时观察气体的产生造成困难。
食品安全国家标准——食品微生物学检验大肠菌群计数.pdf
食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数1 范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义2.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
℃℃。
3.3 恒温水浴箱：46 ±13.4 天平：感量0.1 g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
3.9 无菌培养皿：直径90 mm。
3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
3.11 菌落计数器。
4 培养基和试剂4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。
4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A中A.3。
4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。
4.5 无菌生理盐水：见附录A中A.5。
4.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A中A.6。
4.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A中A.7。
第一法 大肠菌群MPN计数法5 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群MPN计数法检验程序6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品,放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
大肠菌群平板计数法标准号
大肠菌群平板计数法标准号大肠菌群平板计数法是指在实验室条件下，通过将待检样品分散在含有特定培养基的平板上，利用培养基对大肠菌群产生的特异性反应，以及对大肠菌群可生长的特定条件进行培养和计数，从而评估样品中大肠菌群的数量。
该方法已被广泛应用于食品、环境和医疗卫生等领域的微生物检测。
大肠菌群平板计数法标准号是《食品微生物学通则》GB 4789.3-2016。
该标准是由中国国家标准化管理委员会于2016年发布的，是用于食品微生物检测的基本规范。
根据该标准，大肠菌群平板计数法的操作流程主要包括样品制备、平板培养、菌落计数和结果表达。
下面将对每个步骤进行详细介绍。
首先，样品制备是指将待检样品进行预处理，以提高大肠菌群的检测效果。
根据不同样品的特点，可以采取不同的处理方法，如加入适量的缓冲液进行搅拌均匀、加热杀菌和稀释等。
此外，还需要注意样品制备过程中的卫生要求，以防止交叉污染。
然后，将样品均匀地分散在含有选择性培养基的平板上。
选择性培养基可以抑制非大肠菌群的生长，从而增加大肠菌群在平板上的菌落形成，方便后续的计数。
常用的选择性培养基有MacConkey琼脂、立兰肠杆菌培养基等。
接下来，将含有样品的平板置于适宜的温度和湿度条件下进行培养。
大肠菌群在一定的温度范围内可迅速繁殖，通常将培养温度控制在37摄氏度。
此外，还需要为培养提供适当的湿度，可以通过在培养箱内放置含水的培养皿或湿度控制器来实现。
菌落计数是大肠菌群平板计数法的核心步骤。
通常，在培养一定时间后，将平板上的菌落进行计数。
菌落计数可以手工进行，也可以使用计数仪来实现。
在进行计数时，需要注意区分出不同的菌落，并排除其他非大肠菌群的菌落。
最后，根据菌落计数的结果，可根据标准对样品中大肠菌群的数量进行评估。
通常，大肠菌群的计数结果以CFU/g（或CFU/mL）表示，即每克（或每毫升）样品中大肠菌群的菌落数。
需要注意的是，大肠菌群平板计数法在应用中存在一定的局限性。
大肠菌群平板计数限量标准
大肠菌群平板计数限量标准1. 引言大肠菌群是一类存在于人体肠道中的细菌，其计数可以作为评估肠道菌群健康状态的重要指标。
为确保食品安全和公共卫生，制定一份大肠菌群平板计数限量标准具有重要意义。
2. 目的本标准的目的是通过设定大肠菌群平板计数的限量，以减少食品和饮用水中的大肠菌群污染，保障公众健康。
3. 定义3.1 大肠菌群：指在大肠中常见的一类细菌菌群。
3.2 平板计数：采用平板培养方法，通过计数可成满足一定生长条件的菌落形成单位，来确定大肠菌群数量。
4. 大肠菌群平板计数限量标准4.1 食品中的大肠菌群平板计数限量标准：4.1.1 食品类别 | 大肠菌群平板计数限量（单位：CFU/g）鲜肉类食品| ≤100熟肉或熟制品| ≤10生鲜水果蔬菜| ≤100加工水果蔬菜| ≤10食品类加工品| ≤104.1.2 大肠菌群的检验方法：采用标准的培养基和平板计数法，培养温度为37°C，培养时间为24-48小时。
4.2 饮用水中的大肠菌群平板计数限量标准：4.2.1 饮用水类别 | 大肠菌群平板计数限量（单位：CFU/mL）自来水| ≤10包装饮用水| ≤104.2.2 大肠菌群的检验方法：采用标准的培养基和平板计数法，培养温度为37°C，培养时间为24-48小时。
5. 检测与监管5.1 大肠菌群平板计数的检测应由具备相应技术与资质的实验室进行。
5.2 相关部门应定期进行食品和饮用水的大肠菌群平板计数检测，确保其符合本标准要求。
5.3 如超出限量标准，则需要采取相应措施，例如立即终止生产、销售或使用，并进行卫生处理等。
6. 结论本标准制定了食品和饮用水中大肠菌群平板计数的限量标准，旨在确保食品安全和公共卫生。
相关部门和实验室应积极采取措施，加强对大肠菌群平板计数的监管和检测，保障公众的健康与安全。
注：CFU - 菌落形成单位 (Colony Forming Unit)。
大肠菌群检验原始记录-平板计数法5样
10-1
24 26 10
10-2
3
2
0
10-3
0
0
0
BGLB 阳性管数
6
稀释度
第一稀释度 第二稀释度 第三稀释度
样
品 VRBA 疑似大肠菌群菌落数
5
接种 BGLB 管数
10-1
20 22 10
10-2
1
2
0
10-3
0
0
0
BGLB 阳性管数
7
VRBA 空白（仅 VRBA）
-
-
空 白
稀释液空白（稀释液+VRBA）
样品名称
xxxx
样品批次
2022xxxx
仪器设备及耗材： 天平：( xxxx) 培养箱: ( xxxx)
洁净工作台: (xxxx)
培养基及试剂： 结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（VRBA）： xxxx 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）： xxxx 磷酸盐缓冲液：xxxx 0.1mol/L 氢氧化钠：
配制日期 2022/xx/xx 配制日期 2022/xx/xx 配制日期 2022/xx/xx 配制日期：2022/xx/xx
实验过程： 1.样品处理和稀释： 1.1 如需要，使用 0.1mol/L 氢氧化钠或 0.1mol/L 盐酸将样品调整 pH 在 6.5~7.5 之间。 1.2 制备样品稀释液
根据样品状态，无菌操作，称取/吸管吸取 25g（mL）样品，加入到 225mL 无菌磷酸盐缓冲液中均质（混 匀），制成 1:10 样品匀液。根据对样品污染情况的估计，按上述操作将样品稀释至所需浓度。 2.接种 VRBA
-
-
BGLB 空白（仅 BGLB）
-
-
大肠菌群平板计数法计算公式
大肠菌群平板计数法计算公式
构建类肠杆菌群计数技术是衡量卫生水中大肠杆菌群的一个重要手段。
大肠杆菌群平板计数法是大肠杆菌群计数法中一种比较常见的技术，主要是利用培养基的抗血清特异性效能吸附技术，将水样中大肠杆菌群从环境介质中捕获、纯净、总数计算。
其计数法主要有以下几步：
（1）采样：从相应环境或样品中采集所需细菌样本；
（2）分离：用特定培养基培养，在合适的条件下，将沾染大肠杆菌群的样本分离出来；
（3）分析：采用抗血清特异性吸附技术，将纯化的大肠杆菌群模拟出来；
（4）计数：合理设置计数条件，将模拟出来的大肠杆菌群数目计算出来，得出大肠杆菌群数量。
大肠杆菌群平板计数法可以用于解决卫生水建筑中节水管道、游泳池和地下水渠等设备的安装的卫生检查问题，因为这类设备的渗漏可能会引起重要的公共卫生及环境污染问题。
由此可见，大肠杆菌群平板计数法也给建筑的正常使用 and 经营提供了较为准确的分析依据。
大肠杆菌群平板计数法是测定建筑环境中大肠杆菌群的一种有效手段，它为建筑安装和使用提供了较高精度的细菌数量测定结果，可以有效预防建筑环境传染疾病的发生。
这种技术可以广泛用于水处理厂、公共卫生毒理实验室、游泳池、室内健身中心、精湛的安装建筑市场以及大型建筑工程布置。
食品中大肠菌群计数检测标准(GB 4789.3-2016)及解读.
八
大肠菌群平板计数法的操作步骤
九
结果与报告
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一
大肠菌群的概念
食品营养与检测专业教学资源库
定义：一群在36℃培养48h可发酵乳糖、产 酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴 性无芽孢杆菌。
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二
大肠菌群的检测意义
食品营养与检测专业教学资源库
该菌主要来自于人畜粪便，故以 此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生质量，推断食品中有无污 染肠道致病菌。
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大肠菌群MPN计数的检验程序
检样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释
选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管
36℃±1℃
48h±2h
不产气
产气
36℃±1℃
BGLB肉汤
48h±2h
不产气
产气
大肠菌群阴性管 大肠菌群阳性管
查MPN表 报告结果
食品营养与检测专业教学资源库
食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测操作流程1大肠菌群mpn计数的检验程序2大肠菌群平板计数法的检验程序食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群mpn计数的检验程序25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液接种lst肉汤管48h2h361bglb肉汤48h2h361大肠菌群阴性管大肠菌群阳性管查mpn表报告结果食品营养与检测专业教学资源库大肠菌群平板计数法的检验程序选择2个3个适宜连续稀释度的样品匀液接种vrba平板25gml样品225ml稀释液均质10倍系列稀释36118h24h计数典型和可疑菌落bglb肉汤36124h48h报告结果食品营养与检测专业教学资源库过渡页大肠菌群的检测设备及材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外其他设备和材料如下恒温培养箱冰箱恒温水浴箱天平均质器振荡器无菌吸管或微量移液器及吸头无菌锥形瓶ph计或ph比色管或精密ph试纸菌落计数器
大肠菌群计数检验
检样稀释：同上。 检样稀释：同上。 平板计数： 平板计数： 1、每个稀释度接种 个无菌平皿，每皿 个无菌平皿， 、每个稀释度接种2个无菌平皿 每皿1mL稀 稀 释样品，另外一个平皿加1mL生理盐水作空 释样品，另外一个平皿加 生理盐水作空 白对照。 白对照。 2、及时将 、及时将15—20mLVRBA（结晶紫中性红胆 （ 盐琼脂）倾注每个平皿中。 盐琼脂）倾注每个平皿中。 3、待琼脂凝固后，再加 、待琼脂凝固后，再加3—4mLVRBA覆盖表 覆盖表 翻转平板培养。 层。翻转平板培养。
旧国家标准
大肠菌群MPN 计数法 第一法 大肠菌群
第二法 大肠菌群平板计数法
第一天
小组： 使用第一法（附带做第二法中， 第1、3、5、7小组： 使用第一法（附带做第二法中， 、 、 、 小组 两个平板接种），以自来水为样品。 两个平板接种），以自来水为样品。 ），以自来水为样品
小组： 第2、4、6小组： 、 、 小组
大肠菌群计数检验
大肠菌群是指一群在37°C培养 小时能分解乳糖 大肠菌群是指一群在 ° 培养24小时能分解乳糖 培养 产酸产气、 产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆 菌。 作为粪便污染指标， 作为粪便污染指标，有广泛的卫生学意义 食品中大肠菌群数系以每100g（或mL）检样内大 （ 食品中大肠菌群数系以每 ） 肠菌群最可能数（ 肠菌群最可能数（the most probablenumber-简 简 称MPN）表示。 ）表示。
一般样品25ML（克）+225ML生理盐水 ：10，从 一般样品 （ 生理盐水=1： ， 生理盐水 10-1取样 取样1ML，接种到 管LST（月桂基硫酸盐胰蛋白 ，接种到3管 （ 胨肉汤） 胨肉汤）中。 取样1ML+9 ML生理盐水 ：100，从10-2取样 生理盐水=1： 从10-1取样 生理盐水 ， 1ML，接种到3管LST中。 ，接种到 管 中 取样1ML+9 ML生理盐水 ：1000，从10-3取 生理盐水=1： 从10-2取样 生理盐水 ， 样1ML，接种到 管LST中。 ，接种到3管 中
大肠菌群平板计数法检测结果不确定度的评定
152 食品安全导刊 2017年8月Tlogy科技科技文苑大肠菌群是一组存在于肠道中的与粪便污染有关的细菌，通常用来作为评价食品卫生状况的指示菌。
食品中大肠菌群数量的高低与受粪便污染的程度相关，大肠菌群也可以预示食品中存在肠道致病菌的可能性。
由测量所得的测得值只是被测量的估计值，测量过程中的随机效应及系统效应会导致测量不确定度[1]。
对大肠菌群检测结果的测量不确定度进行评定，能以充分完整的信息表示检测结果，提高大肠菌群检测结果的可信度。
1 不确定度评定方法采用《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[2]中第二法平板法进行检测，主要检测步骤如下：样品制备—10倍梯度稀释—选取2～3个合适稀释度的样品匀液接种—倾注VRBA 平板—计数典型和可疑菌落数—接种BGLB 肉汤—报告结果。
本文对奶粉样品进行大肠菌群人工污染后进行10次重复测定，以此结果为依据，分析不确定度各分量的来源和大小，并参照JJF1059.1-2012《测量结果不确定度的评定与表示》做不确定度评定。
2 各不确定度分量的评定2.1 样品制备过程中引入的不确定度样品制备过程中，可能引入不确定度的因素有样品称量、量筒量取稀释液、均质器均质等。
用均质器进行拍击均质，拍击时间和拍击速度是固定的，可以忽略由此产生的不确定度。
电子天平精度0.1 g，样品称样量25.0 g，检定证书规定的最大允许误差为±0.5 g。
则天平称量的标准不确定度μ（ｍ样）为：用250 mL 量出式量筒量取225 mL 稀释液，制成1︰10的样品匀液。
量筒按JJG196-2006常用玻璃量器的容量允差为±2.0 mL [3]，则量筒量取的标准不确定度μ（ｖ样）为：因此，电子天平和量筒的相对标准不确定度U rel （m 样）和U rel （v 样）分别为：则样品制备过程中产生的相对标准不确定度为：大肠菌群平板计数法检测结果不确定度的评定□ 徐武俊 吕腾飞 李仕祥 刘伟平 江西出入境检验检疫局综合技术中心摘 要：通过对《GB 4789.3-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》第二法平板法中不确定度来源进行分析和计算，得出检测结果的不确定度为U=0.057 54，k=2.26，主要影响因素是样品制备、样品稀释、加样和重复检测，其中重复检测对检测结果不确定度的贡献最大。
食品中大肠菌群计数检测标准(GB 4789.3-2016)及解读.
大肠菌群平板计数法的检验程序
检样 25g(mL)样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释
选择2个—3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种VRBA平板
36℃±1℃
18h ～24h
计数典型和可疑菌落
BGLB肉汤
36℃±1℃
24h ～48h
报告结果
食品营养与检测专业教学资源库
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大肠菌群的检测设备及材料
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三
大肠菌群的检测依据
食品营养与检测专业教学资源库
食品中大肠菌群的检测需依
照中华人民共和国国家标准 GB 4789.3-2016食品安全国 家标准，食品微生物学检验， 大肠菌群计数。严格执行。
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大肠菌群的检测操作流程
四
食品营养与检测专业教学资源库
1大肠菌群MPN计数的检验程序 2大肠菌群平板计数法的检验程序
八
大肠菌群平板计数法的操作步骤
九
结果与报告
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过渡页
一
大肠菌群的概念
食品营养与检测专业教学资源库
定义：一群在36℃培养48h可发酵乳糖、产 酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴 性无芽孢杆菌。
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过渡页
二
大肠菌群的检测意义
食品营养与检测专业教学资源库
该菌主要来自于人畜粪便，故以 此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生质量，推断食品中有无污 染肠道致病菌。
五
食品营养与检测专业教学资源库
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外， 其他设备和材料如下，恒温培养箱，冰箱， 恒温水浴箱，天平，均质器，振荡器，无 菌吸管，或微量移液器及吸头，无菌锥形 瓶，pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸，菌 落计数器。
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大肠菌群平板计数法 The latest revision on November 22, 2020
大肠菌群平板计数法
一、操作步骤
1.样品的稀释
2.选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。
同时取1mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
3.及时将15mL～20mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18h～24h。
4.平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
5.证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃
±1℃培养24h～48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
6.大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。