抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
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抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)
1、试剂的配制
(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):
A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358.14)71.7g;
B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01)31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS(pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,B母液(NaH2PO4) 21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP(聚乙烯吡咯烷酮)
参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000:267~268。
(2)130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1.399g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托
(3)100μmol/L EDTA-Na2溶液:取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml;
(4)100μM核黄素溶液:取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml,避光保存,随用随配,并稀释10倍
(5)750μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存;
酶液制备:取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,加缓冲液使终体积为10ml。取5ml于10000r/min下离心10min,上清液即为SOD粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
2、酶活性测定
2.显色反应取试管(要求透明度好)5支,3支为样品测定管,1支为对照管,另外1支作为空白,按表39-1加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处,其它各管于4000lx日光灯下反应20min(要求各管受光情况一致,反应室的温度高时时间可适当缩短,温度低时时间可适当延长)。
表39-1 各溶液加入量
试 剂(酶)
用量(ml) 终浓度(比色时) 0.05mol/L 磷酸缓冲液
130mmol/L Met 溶液
750μmol/L NBT 溶液
100μmol/L EDTA-Na 2液
20μmol/L 核黄素
酶 液
蒸馏水
总体积
1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 13mmol 75μmol 10μmol
2.0μmol 空白和对照管加缓冲液代替酶液
加核黄素时记得要快并且要避光,
SOD 活性测定与计算 至反应结束后,以不照光的作空白,分别测定其它各管560nm 波长下的消光度值,已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD 活性:
SOD 总活性=
1005.0)(V FW A V A A T S ⨯⨯⨯⨯-
式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位/mg 蛋白表示;
A 0—照光对照管的消光度值;
A S —样品管的消光度值;
V T —样液总体积(ml );
V 1—测定时样品用量(ml );
FW —样重(g );
蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。
用荧光灯20w 照20min 可以吗 不可以,
二、POD 、CAT 酶活性的测定
粗酶液制备同SOD 。
1、 过氧化物酶(POD )活性测定(愈创木酚法)
(1)试剂配制:
100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0):分别取A 母液(Na 2HPO 4 ) 61.5ml 和B 母液(NaH 2PO 4 ) 438.5ml 混匀即为1000ml PBS(0.2M ,pH6.0);
(2)反应混合液配制:
取50ml PBS(100mmM ,pH6.0),加入28ul 愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷
却后加入19ul 30%的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。
(3)样品测定:
称取1g,放入预冷研钵,加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min,上清液转入100ml容量瓶,用磷酸缓冲液定容至刻度,贮于冷处备用。
取试管3支,一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液1ml作调零,两支取3ml反应液并加入1ml酶液,立即计时,在470nm测定,酶隔30s读书一次。测一个样加一个,不要全部加上。(边加样边测定,测定前等待5秒,动作要快,如果慢的话,要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大)
(4)酶活性计算:以每min OD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u)。
POD=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)(u/g min)
ΔA470:为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积;Vs为测定时取用酶液体积。
2、过氧化氢酶(CAT)活性测定
(1)试剂配制:
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.0):取A母液(Na2HPO4) 61.0 ml 和B母液(NaH2PO4) 39.0 ml 混合后至100ml。(加1gPVP)
(2)反应液配制:吸取5.68ml 30%的H2O2(原液)稀释至1000ml,摇匀即可。
(3)样品测定:1.酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀将量瓶置4℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用.
2.测定:取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管(加入酶液后在沸水中煮沸5-10min,冷却之后加入H2O2测定吸光值),按表40-2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管号粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) 蒸馏水(ml)
S1 0.2 1.5 1.0
S2 0.2 1.5 1.0
S3 0.2 1.5 1.0
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性。
调零用磷酸缓冲液(pH=7.8)