抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）
1、试剂的配制
（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托
（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；
（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍
（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；
酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定
2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

表39-1 各溶液加入量
试 剂（酶）
用量(ml) 终浓度（比色时） 0.05mol/L 磷酸缓冲液
130mmol/L Met 溶液
750μmol/L NBT 溶液
100μmol/L EDTA-Na 2液
20μmol/L 核黄素
酶 液
蒸馏水
总体积
1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 13mmol 75μmol 10μmol
2.0μmol 空白和对照管加缓冲液代替酶液
加核黄素时记得要快并且要避光，
SOD 活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm 波长下的消光度值，已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位表示。

按下式计算SOD 活性：
SOD 总活性=
1005.0)(V FW A V A A T S ⨯⨯⨯⨯-
式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg 蛋白表示；
A 0—照光对照管的消光度值；
A S —样品管的消光度值；
V T —样液总体积（ml ）；
V 1—测定时样品用量（ml ）；
FW —样重（g ）；
蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。

用荧光灯20w 照20min 可以吗 不可以,
二、POD 、CAT 酶活性的测定
粗酶液制备同SOD 。

1、 过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A 母液(Na 2HPO 4 ) 61.5ml 和B 母液(NaH 2PO 4 ) 438.5ml 混匀即为1000ml PBS(0.2M ，pH6.0)；
（2）反应混合液配制：
取50ml PBS(100mmM ，pH6.0)，加入28ul 愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷
却后加入19ul 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

（3）样品测定：
称取1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min，上清液转入100ml容量瓶,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。

取试管3支，一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液1ml作调零，两支取3ml反应液并加入1ml酶液，立即计时，在470nm测定，酶隔30s读书一次。

测一个样加一个，不要全部加上。

（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）
（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时取用酶液体积。

2、过氧化氢酶（CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 61.0 ml 和B母液(NaH2PO4) 39.0 ml 混合后至100ml。

(加1gPVP)
（2）反应液配制：吸取5.68ml 30%的H2O2（原液）稀释至1000ml，摇匀即可。

（3）样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

混合均匀将量瓶置4℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

4℃下保存备用.
2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（加入酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷却之后加入H2O2测定吸光值），按表40-2顺序加入试剂。

表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管号粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) 蒸馏水(ml)
S1 0.2 1.5 1.0
S2 0.2 1.5 1.0
S3 0.2 1.5 1.0
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

调零用磷酸缓冲液（pH=7.8）
3.结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/g/min)= A240×Vt/0.1×V1×t×FW
式中A240 = AS0－（AS1+AS2）/2
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）
五、丙二醛含量的测定
1、试剂配制：
10%TCA：100g 三氯乙酸→ 1L
0.6%TBA：0.6g硫代巴比妥酸 ,加少量氢氧化钠（1mol/l）溶解→用10%TCA定容100ml （避光）
1mol/l氢氧化钠；称4gNaOH用蒸馏水溶解定容100ml
3、测定步骤:
称取剪碎的试材1g，加入2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心（4000r）离心10min，上清液为样品提取液。

3.显色反应和测定吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA 溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。

取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度。

(2)双组分分光光度法按公式③可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。

用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：
MDA（μmol/g FW）＝
C2(umol/L)=6.45*(D532－D600)－0.56*D450
C2－为MDA的浓度；
D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值。

七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）
1、试剂的配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取0.001g考马斯亮蓝，溶于50 ml 90％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸（不懂），85%是磷酸的质量分数，买回来时直接就是85%的磷酸，加入100ml就行。

再用蒸馏水定容到1Ｌ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。

（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml 标准BSA溶液）。

2、样品可溶性蛋白含量的测定
（1）样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样0.5g, 用5ml蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取。

吸取样品提取液1.0Ml，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

调零管是用蒸馏水
样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝C×VT/(V1×FW×1000)（2-2）
式中C：查标准曲线值(μg)；VT：提取液总体积(Ml)；
ＦW：样品鲜重(g)；V1：测定时加样量(Ml)。

我就测这五个所以帮下我谢谢。