大肠杆菌及其染色体

我们现在看看整个E .coli在 细胞内的复制全过程。 从oriC开始双向复制
随着复制的进行，两个子oriC分开
随着复制的继续进行，形成一种特殊的“图像”
复制接近尾声，两个复制叉“碰面”，复制终止
复制完成后，得到两个完全相同的大肠杆菌
我们用本文参考文献的荧光 图片来对照
(Wang, X. et al.,2006,Genes Dev )
大肠杆菌的染色体复制概述
L:把环状DNA“人为平铺打开”后从 Ori的左边进行复制的复制轨迹； R:把环状DNA“人为平铺打开”后从 Ori的右边进行复制的复制轨迹； ter：L和R复制叉最后“碰面”的在一 定区域，复制终止区域。 L/R的颜色的强弱表示时间梯度
=
——颜色越强，越靠后，越下游。 大肠杆菌的复制“对称”，ori， ter位于菌体“中间”，其他的菌 种是不是也是这样的？？ 具体结构 稍后再讲
大肠杆菌及其染色体
刘 超
10808073 2009-05-20
综述与要点
• 大肠杆菌染色体是一种环状的DNA双链分子，在 活细胞中，DNA体积进行1000倍压缩，只在其细 胞体积中占15 ％。 • 基因组（染色体）的管理是有规律性的，这有利 于染色体维护和操作。 • 新技术的发展，如基因位点的标记与分子水平的 遗传位点同步跟踪，（也就是说，随时间的推移 ，这种分子机制能在活细胞内检测出）。 • 这些研究通过基因定位，对染色体的复制进行可 视化，揭示出一个高通量的动态的基因复制和大 分子行为。
利用阻遏子-启 动子的荧光系 统 ( FROS)来 观察大肠杆菌 的染色体复制 的情况。
(Wang, X. et al.,2006,Genes Dev )
ParB–parS 系统
• ParB–parS 系统也是利用荧光融合蛋白（ParB） 和特异性识别位点（parS）特异性结合的方法， 在细胞中，使染色体轨迹可视化。
2.DNA子链的延伸
• 主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞后 链的合成。由DNA helicase解开双螺旋，由拓朴异构酶消 除DNA链上的扭曲力，SSB结合使DNA单链稳定。 • 前导链的合成：由DnaG（primase，引物酶）在复制起始 位点附近合成一个RNA引物，然后由polII把dNTP加到该 引物上。
• 这些方法需要固定的细胞因 而样品破坏。 • 此外，抗体相互作用可导致 降低效率。
荧光蛋白
• 在活细胞中，利用含有绿色荧光蛋白（ GFP ）融 合蛋白，彻底让我们直观地观察和理解细胞组织 的功能。 • 利用不同的荧光蛋白质，就可以在同一时间追踪 多种成分的活体细胞。
荧光原位杂交（ FISH ）
• 滞后链的合成：产生Okazaki fragments(冈崎片段)，消除 RNA引物并由DNA pol I补上这一小段DNA序列，由DNA Ligase把两个片段相连。
L/R 双向复制叉
3. DNA链的终止
当子链延伸达到 terminus region（ter， 带有多个20bp序列）时， DNA复制就终止了。 Ter有点像一个陷井 （trap），使复制叉只 能进入，不能出来。 Ter的功能主要是由 Ter-Tus复合物（ter utilization substance） 来完成的。
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1.DNA复制的起始
• 大肠杆菌中的复制起始位点是oriC,全长245 bp。 • 该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。
• 大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重复 区相结合； • 识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构； • DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个 DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不同方 向同时起始DNA的复制。当细胞中存在足够的SSB和 DNA解旋酶时，DnaB的解链效率非常高。
E.coli 复制体
• 大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶 和蛋白质因子参与。 • 整个DNA复制机制被称之为DNA replicase system或replisome（复制体）。
E.Coli 复制相关的酶
• Helicase（解旋酶），任何DNA在被复制前都必须解 开双链，这个过程是由helicase来完成的，它可在ATP 的作用下将DNA母链不断解开形成单链。 Topoisomerase（拓扑异构酶），主要功能是消除 DNA解链过程中所产生的扭曲力。 DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。 Primases（引物酶），为DNA复制提供RNA引物。 DNA polymerases，合成新生DNA链百度文库切除RNA引物。 DNA Ligases，使新生DNA链上的缺口（3'-OH, 5'-p） 生成磷酸二酯键。
人类染色体的原位杂交
阻遏子-启动子的荧光系统 ( FROS)
• FROS是第一个在活细胞中直观具体地观察染色体行为的方 法。利用了不同的荧光蛋白基因变异型（GFP、YFP、RFP） 具有不同的发射光谱，把他们融合到LacI和TetR等不同的 抑制子中，在细胞中，这些融合蛋白表达，并与lacO和 tetO等特异性位点结合从而插入并结合到染色体中。 • 可以用荧光显微镜观察，使得染色体可视化。 • 但是，这种方法要求利用转座子在染色体中建造一系列随 机结合位点（ lacO和tetO ） • 需要防止这种抑制作用过度。 • FROS允许快速摄像和微速摄影，同时可以跟踪两个或三种 颜色（激光共聚焦）。
其他菌种的复制简介
柄杆菌属 枯草芽孢杆菌 具有 ori-proximal pole ter-proximal pole 而大肠杆菌的ori 和ter在菌体“中 间”位置 弧菌属 有两个独立环形 染色体，独立控 制两个Ori 复制过程和大肠杆菌 基本相同。但是，染 色体复制后，被整编 和拉长，两个染色体 的Ori被一些列的蛋白 固定在细胞两极， 如：DivIVA, RacA, soj 和 Spo0J。 SpoIII 把一个细胞极 的挤进到前芽孢中。 为不对称分裂。
免疫组织化学方法
荧光分子机制
用于 染色体相关的 显微镜成像方法
荧光原位杂交（ FISH ）
荧光阻遏子-启动子系统( FROS ） ParB–parS 系统
免疫化学
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标 记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来 确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性 及定量。
总结与展望
• E.coli 是典型的真细菌代表，原核生物中， 迄今为止利用面最广，利用价值最大，如 工程菌。
• 通过E.coli染色体的研究对其他细菌的复制 研究具有参考和启示的作用。 • 在遗传和生物学进化上有价值。
ParB
EGFP YFP RFP
环状DNA的拓扑学知识
• 共价闭合的DNA，不足以形成稳定的负超螺旋结构， 但是在不同条件下，它可以存在于两个可以互换的 形式——绞状螺旋线的环形结构和超螺旋的环形结 构。 • 在体外，在生理缓冲液中，绞状螺旋线的螺旋结构 通过右手旋线的环形结构构象。 • 环状的DNA能通过某些蛋白，形成稳定的左手螺旋 环超环面负超螺旋结构的，这种结构具有更高水平 的折叠和压实。
荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH） 是一 种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核 酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位， 或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA。
DNA探针，通常为2-10 kb 的长度，探 针带有标记作用的荧光基团。 同时检测多个位点，不要求建造特殊 菌株。 固定过程和通透性可以干扰染色体原 来的序列。