Cell：ESCRT-III作用于MLKL下游调控细胞程序性坏死

Cell：ESCRT-III作用于MLKL下游调控细胞程

序性坏死

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程序性坏死（necroptosis）是一种可调控的坏死，然而经历程序性坏死的细胞并不总是面向死亡。来自美国圣犹达儿童研究医院的研究团队发现，在细胞程序性坏死的过程中由MLKL活性引起的膜损伤可被ESCRT-III修复，保留细胞质膜的完整性，使具有MLKL活性的细胞可以在ESCRT的参与下维持生存。相关结果发表于《Cell》。

RIPK3（相互作用激酶-3）激活MLKL（混合谱系激酶样）导致质膜（PM）的破坏，引起细胞程序性坏死。RIPK3本身通过寡聚化激活，可以通过单独添加二聚体快速激活RIPK3。ESCRT蛋白包括亚群（ESCRT-I，-II和-III），其在多泡体形成、质膜断裂、细胞因子中的核膜组装等中起作用。

1. 程序性坏死细胞在质膜完整性丧失之前暴露磷脂酰丝氨酸（PS）

PS通过脂质转位酶的作用定位于健康细胞质膜的内叶。向培养的NIH 3T3细胞添加二聚体（B / B），发现细胞在摄取Sytox Green或碘化丙啶（PI）之前迅速变为膜联蛋白V （AnnV）阳性（在质膜上形成的小（〜0.5mm）的AnnV+气泡）。在添加肿瘤坏死因子（TNF）和caspase抑制剂zVAD-fmk（TZ）后也观察到这种现象。MLKL的消融阻止了PS的暴露。因此MLKL的激活导致脂质扰乱以暴露PS。

2. ESCRT-III负责组建MLKL诱导的AnnV+气泡

用GFP-CHMP4B瞬时转导表达RIPK3-2Fv或hMLKL1-181-2Fv的NIH 3T3细胞，并加入B / B后成像。发现活性MLKL诱导CHMP4B转运到PM。为了确定ESCRT-III是否在MLKL激活后AnnV+气泡的形成中起作用，沉默ESCRT-III组分的CHMP2A和CHMP4B，发现激活RIPK3或MLKL后质膜气泡的形成取决于这些ESCRT-III组分的存在。

还发现，在激活MLKL之后PS暴露之前发生Ca2+的内流，并且依赖于MLKL的存在。尽管PS暴露不需要Ca2+，但是发现CHMP4B易位和质膜气泡形成需要细胞外Ca2+。

3. ESCRT-III拮抗程序性坏死

沉默NIH 3T3细胞中的CHMP2A会诱导20%左右细胞死亡，并且不受caspase抑制剂qVD-oph 和zVAD-fmk的影响。在ESCRT-III沉默的鼠L929细胞中，添加TNF 或zVAD-fmk后，诱导更多的快速程序性坏死。ESCRT-III控制质膜完整性。

4. ESCRT-III促使程序性坏死细胞释放信号分子

缺乏ESCRT-III功能的细胞比对照细胞产生的趋化因子（CXCL10和CXCL1）少。永生化巨噬细胞（iMac）中RIPK3-2Fv的激活诱导细胞死亡，CHMP2A的沉默加速这一过程，在通过B / B的RIPK3活化后，这些细胞产生多种细胞因子和趋化因子（Interleukin (IL)-1a, IL-1b, IL-6, CXCL10，TNF-a）。因此，ESCRT-III可延迟或预防MLKL引起的细胞死亡，足以使信号（如细胞因子和趋化因子）在细胞消亡之前显现。

5. 具有活性MLKL的细胞可以复苏

通过添加B / B激活RIPK3-2Fv细胞，分选出AnnV+，Sytox Green-细胞，将细胞返回到培养物中，添加Fvbinding试剂的单体形式，称为“洗脱”，洗脱剂与B / B二聚体竞争并破坏由其诱导的的低聚物。在没有洗脱剂的情况下，AnnV+，Sytox Green-细胞变为AnnV+，Sytox Green+细胞，添加洗脱剂后，细胞变为AnnV-，Sytox Green-细胞并快速生长。表明AnnV+细胞已被“复苏”以维持存活。

6. ESCRT组分是具有活性MLKL的细胞复苏所必需的

复苏效果在ESCRT-III组分CHMP2A或CHMP4B沉默的细胞中显着降低。

总之，ESCRT-III作用于MLKL下游保留细胞质膜的完整性，促进细胞生存。

参考文献：

ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 2017 Apr 6;169(2):286-300.e16.

doi: 10.1016/j.cell.2017.03.020.

该论文中使用的caspase抑制剂qVD-oph和zVAD-fmk是APExBIO公司的哦！货号分别为A8165 、A1902。

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