肾活检病理染色技巧探讨
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包埋动作缓慢
Βιβλιοθήκη BaiduEM常见问题
常见问题
解决办法
切片铀或铅颗粒沉积
电镜
戊二醛前固定
OCT 包埋
光镜
锇酸后固定
冰冻切片
固定
环氧树脂包埋
丙酮固定 染色 IgG 、IgA、IgM、C3、C4、C1q、Fib
荧光显微镜观察、报告
脱水 透明 浸蜡 包埋 石蜡切片 烤片
超薄切片 醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色
电子显微镜观察、报告
染 色（HE、PAS、PAM、Masson 染色等）
封片
4%），固定时间≥ 12h。
固定液一般为组织总体积的4-5倍，或15-20 倍。
固定的常见问题
常见问题
解决办法
HE
组织固定不及时、自溶 固定不当
HE
新鲜立即固定 重新严格配液
脱水
乙醇是最常用的生物组织脱水剂，可以与水随意 混合，脱水能力较强，并且可硬化组织，从低浓 度开始，然后再梯度酒精脱水：
脱片的常见问题
常见问题
解决办法
① 载玻片洗涤不洁、有油脂 ① 新鲜配制泡酸液，保证泡酸
② 捞片时，切片未摊平
时间
③ 烤片时间不足
② 将组织切片周围水份吸干
④ 温度不够，急于染色
③ 适当延长时间，升温
⑤ 染色过程中，水洗速度过快。④ 缓缓漂洗
⑤ 涂PLL（防脱片剂）
HE染色的常见问题
常见问题
解决办法
光镜观察、报告
常用染色
HE
PAS
IgG
Masson PAM-Masson
IgA
荧光
刚果红
油红“O”
光镜
电镜
TEM
光镜检查相关问题及对策
取材
荧光 电镜 光 镜
光
镜
荧光≥1球；电镜≥1球；光镜≥10球 取材迅速，避免组织自溶
固定
电镜：2.5%戊二醛，4 ℃固定时间≥ 2h
荧光：冷丙酮， 4 ℃固定时间≥ 20min 光镜：10%甲醛（37%的甲醛配制，实际浓 度为
已发表论文： 娄岩,刘树军,高丹等.改良冷配Schiff染液在肾穿刺活检病理检查
中的应用[J].中国实验诊断.2014，18（9）：1507-1508.
PASM染色的常见问题
常见问题
解决办法
六胺银染液配制不当、失效 染液现用现配
切片入六胺银染液时间不足 适当延长孵育时间（镜检）
氯化金分化过度
选用低浓度氯化金分化
免疫荧光相关问题及对策
免疫荧光相关问题
常见问题
解决办法
IgA
组织自溶或冻融 附贴时手晃动，载玻 片完全附贴于刀上
IgA
及时冷冻， -22℃左右操作 附贴要稳、准，避免载玻片 附贴于刀上
切片厚度比较
IgG
厚度=3um
IgG
厚度≥5um
IgG
厚度≤2um
TEM相关问题及对策
超薄切片制作流程图
TEM常见问题
浸腊的常见问题
常见问题
解决办法
PAS
PAS
组织浸蜡温度过高 展片水温过高
根据石蜡熔点选择浸蜡温 度
展片温度（40 ℃左右）
石蜡切片
根据染色不同，在连续切片的同时调整切片的厚度
➢ PAS和PASM染色切片为0.5um ➢ Masson染色切片为2um ➢ 免疫组化切片4um ➢ 刚果红为5um。
二甲苯是最常用透明剂，RI=1.50，具有收缩性 强、使组织变脆、不溶于水的特点。因此用二甲苯 透明时应严格掌握透明时间。
透明程序：二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ 15min。
浸蜡
浸蜡温度应根据所使用的石蜡熔点而定，一般浸 蜡温度高于石蜡熔点2-3 ℃ 。
硬组织用硬蜡，软组织用软蜡包埋。 严格控制浸蜡温度，避免“烫伤”组织。
已发表论文： 曲乐，刘树军，高丹等.肾穿刺活检病理PASM染色方法改良探讨
[J].中国实验诊断.2015,19(4):617-619.
Masson染色的常见问题
常见问题
解决办法
Masson液染 Masson液染 色时间过长 色时间过短
镜下严格控制染色时 间
变色酸2R-亮绿染液配制
磷钨酸 3.2g 冰醋酸4ml 变色液2R 2.0g 亮绿1.7g 蒸馏水400ml
肾活检病理染色技巧探讨
概述
肾活检病理技术是肾脏疾病诊断中必不可少的重 要手段,对明确诊断、制定合理治疗方案及判断预 后有重要意义。
随着新病理技术和仪器不断涌现，极大地丰富和 提高了肾活检病理诊断水平，对阐明肾脏疾病病 因、发病机制及病理演变规律提供了必要的科学 依据。
肾活检标本的制作过程
免疫荧光
75%（10min × 2）~ 80% （10min × 2）~ 90%（10min ×2） ~ 95% (30min × 2)~ 100%（60min× 3）
脱水的常见问题
常见问题
解决办法
PASM
PASM
脱水时间过长 脱水梯度过大
根据室内温，适当缩短脱水时间 降低脱水梯度，避免梯度过大
组织透明
伊红染色时间不足
适当延长伊红染色时间
PAS染色的常见问题
常见问题
解决办法
Schiff染液失效或染色 时间不足
配制新鲜染液，适当延长染 色时间，肉眼观察至切片 变 淡粉红色、立即入水。
冷配Schiff染液改良
称取碱性品红６ｇ入蒸馏水４２０ｍｌ，用磁力搅 拌器搅拌２．５－３ｈ至完全溶解，继续加入Ｎ盐 酸８０ｍｌ和偏重亚硫酸钠１０ｇ混合，搅拌２． ５－３ｈ至草黄色，避光室温静置１２ｈ后再加入 ５ｇ活性炭，搅拌后过滤至无色透明，置于４℃避 光保存。
展片温度根据石蜡熔点进行调整，一般低于蜡熔点 20 ℃左右。
分片顺序为PASM-PAS-Masson-HE-免疫组化-刚果红
石蜡切片的常见问题
常见问题
解决办法
HE Masson
HE
Masson
切片有刀痕、薄厚不匀 室温过高 切片有皱纹
选用优质石蜡、刀刃锋利， 收紧刀架螺旋， 安装空调 切片时：快、准、稳、匀
PASM染色的常见问题
常见问题
解决办法
银染过度 先目测，后在镜下严格控制染色时间
六氨银染液改良
3%六次甲基四胺水溶液25ml，加入2%四硼酸钠5ml ，加入5%硝酸银水溶液2.5ml，震荡至乳白色悬浊 液变为清亮透明，加入30ml蒸馏水，最后加入4% 硼酸5-7滴，混匀后过滤立即使用，如果不立即使 用放入4度冰箱避光储存（一般不能超过3天）。
常见问题
解决办法
切片出现颤痕（波浪纹） 减少周围噪音及震动
调节MNA，增加包埋剂硬度 固定样品头和刀
TEM常见问题
常见问题
解决办法
更换玻璃刀或者钻石刀 切片出现刀痕（栅栏状 ） 调节DDSA，降低包埋
剂硬度
TEM常见问题
常见问题
解决办法
切片出现空洞
完全沉降包埋剂，排出 包埋剂内细微气泡
Βιβλιοθήκη BaiduEM常见问题
常见问题
解决办法
切片铀或铅颗粒沉积
电镜
戊二醛前固定
OCT 包埋
光镜
锇酸后固定
冰冻切片
固定
环氧树脂包埋
丙酮固定 染色 IgG 、IgA、IgM、C3、C4、C1q、Fib
荧光显微镜观察、报告
脱水 透明 浸蜡 包埋 石蜡切片 烤片
超薄切片 醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色
电子显微镜观察、报告
染 色（HE、PAS、PAM、Masson 染色等）
封片
4%），固定时间≥ 12h。
固定液一般为组织总体积的4-5倍，或15-20 倍。
固定的常见问题
常见问题
解决办法
HE
组织固定不及时、自溶 固定不当
HE
新鲜立即固定 重新严格配液
脱水
乙醇是最常用的生物组织脱水剂，可以与水随意 混合，脱水能力较强，并且可硬化组织，从低浓 度开始，然后再梯度酒精脱水：
脱片的常见问题
常见问题
解决办法
① 载玻片洗涤不洁、有油脂 ① 新鲜配制泡酸液，保证泡酸
② 捞片时，切片未摊平
时间
③ 烤片时间不足
② 将组织切片周围水份吸干
④ 温度不够，急于染色
③ 适当延长时间，升温
⑤ 染色过程中，水洗速度过快。④ 缓缓漂洗
⑤ 涂PLL（防脱片剂）
HE染色的常见问题
常见问题
解决办法
光镜观察、报告
常用染色
HE
PAS
IgG
Masson PAM-Masson
IgA
荧光
刚果红
油红“O”
光镜
电镜
TEM
光镜检查相关问题及对策
取材
荧光 电镜 光 镜
光
镜
荧光≥1球；电镜≥1球；光镜≥10球 取材迅速，避免组织自溶
固定
电镜：2.5%戊二醛，4 ℃固定时间≥ 2h
荧光：冷丙酮， 4 ℃固定时间≥ 20min 光镜：10%甲醛（37%的甲醛配制，实际浓 度为
已发表论文： 娄岩,刘树军,高丹等.改良冷配Schiff染液在肾穿刺活检病理检查
中的应用[J].中国实验诊断.2014，18（9）：1507-1508.
PASM染色的常见问题
常见问题
解决办法
六胺银染液配制不当、失效 染液现用现配
切片入六胺银染液时间不足 适当延长孵育时间（镜检）
氯化金分化过度
选用低浓度氯化金分化
免疫荧光相关问题及对策
免疫荧光相关问题
常见问题
解决办法
IgA
组织自溶或冻融 附贴时手晃动，载玻 片完全附贴于刀上
IgA
及时冷冻， -22℃左右操作 附贴要稳、准，避免载玻片 附贴于刀上
切片厚度比较
IgG
厚度=3um
IgG
厚度≥5um
IgG
厚度≤2um
TEM相关问题及对策
超薄切片制作流程图
TEM常见问题
浸腊的常见问题
常见问题
解决办法
PAS
PAS
组织浸蜡温度过高 展片水温过高
根据石蜡熔点选择浸蜡温 度
展片温度（40 ℃左右）
石蜡切片
根据染色不同，在连续切片的同时调整切片的厚度
➢ PAS和PASM染色切片为0.5um ➢ Masson染色切片为2um ➢ 免疫组化切片4um ➢ 刚果红为5um。
二甲苯是最常用透明剂，RI=1.50，具有收缩性 强、使组织变脆、不溶于水的特点。因此用二甲苯 透明时应严格掌握透明时间。
透明程序：二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ 15min。
浸蜡
浸蜡温度应根据所使用的石蜡熔点而定，一般浸 蜡温度高于石蜡熔点2-3 ℃ 。
硬组织用硬蜡，软组织用软蜡包埋。 严格控制浸蜡温度，避免“烫伤”组织。
已发表论文： 曲乐，刘树军，高丹等.肾穿刺活检病理PASM染色方法改良探讨
[J].中国实验诊断.2015,19(4):617-619.
Masson染色的常见问题
常见问题
解决办法
Masson液染 Masson液染 色时间过长 色时间过短
镜下严格控制染色时 间
变色酸2R-亮绿染液配制
磷钨酸 3.2g 冰醋酸4ml 变色液2R 2.0g 亮绿1.7g 蒸馏水400ml
肾活检病理染色技巧探讨
概述
肾活检病理技术是肾脏疾病诊断中必不可少的重 要手段,对明确诊断、制定合理治疗方案及判断预 后有重要意义。
随着新病理技术和仪器不断涌现，极大地丰富和 提高了肾活检病理诊断水平，对阐明肾脏疾病病 因、发病机制及病理演变规律提供了必要的科学 依据。
肾活检标本的制作过程
免疫荧光
75%（10min × 2）~ 80% （10min × 2）~ 90%（10min ×2） ~ 95% (30min × 2)~ 100%（60min× 3）
脱水的常见问题
常见问题
解决办法
PASM
PASM
脱水时间过长 脱水梯度过大
根据室内温，适当缩短脱水时间 降低脱水梯度，避免梯度过大
组织透明
伊红染色时间不足
适当延长伊红染色时间
PAS染色的常见问题
常见问题
解决办法
Schiff染液失效或染色 时间不足
配制新鲜染液，适当延长染 色时间，肉眼观察至切片 变 淡粉红色、立即入水。
冷配Schiff染液改良
称取碱性品红６ｇ入蒸馏水４２０ｍｌ，用磁力搅 拌器搅拌２．５－３ｈ至完全溶解，继续加入Ｎ盐 酸８０ｍｌ和偏重亚硫酸钠１０ｇ混合，搅拌２． ５－３ｈ至草黄色，避光室温静置１２ｈ后再加入 ５ｇ活性炭，搅拌后过滤至无色透明，置于４℃避 光保存。
展片温度根据石蜡熔点进行调整，一般低于蜡熔点 20 ℃左右。
分片顺序为PASM-PAS-Masson-HE-免疫组化-刚果红
石蜡切片的常见问题
常见问题
解决办法
HE Masson
HE
Masson
切片有刀痕、薄厚不匀 室温过高 切片有皱纹
选用优质石蜡、刀刃锋利， 收紧刀架螺旋， 安装空调 切片时：快、准、稳、匀
PASM染色的常见问题
常见问题
解决办法
银染过度 先目测，后在镜下严格控制染色时间
六氨银染液改良
3%六次甲基四胺水溶液25ml，加入2%四硼酸钠5ml ，加入5%硝酸银水溶液2.5ml，震荡至乳白色悬浊 液变为清亮透明，加入30ml蒸馏水，最后加入4% 硼酸5-7滴，混匀后过滤立即使用，如果不立即使 用放入4度冰箱避光储存（一般不能超过3天）。
常见问题
解决办法
切片出现颤痕（波浪纹） 减少周围噪音及震动
调节MNA，增加包埋剂硬度 固定样品头和刀
TEM常见问题
常见问题
解决办法
更换玻璃刀或者钻石刀 切片出现刀痕（栅栏状 ） 调节DDSA，降低包埋
剂硬度
TEM常见问题
常见问题
解决办法
切片出现空洞
完全沉降包埋剂，排出 包埋剂内细微气泡