HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告
细胞培养毕业实习报告总结
毕业实习报告总结:细胞培养首先,我要感谢我的导师和实验室的同事们,他们在我的实习期间给予了我无私的帮助和指导。
通过这次实习,我对细胞培养这一领域有了更深入的了解,也积累了宝贵的实践经验。
细胞培养是生物医学和生物技术领域中重要的实验技术,它通过模拟细胞在体内的生长环境,使细胞在体外继续生长和繁殖。
在实习期间,我学习了细胞培养的基本原理和操作技术,包括细胞的复苏、传代、胰蛋白酶消化、细胞计数、铺板等步骤。
我也了解了细胞培养中常用的仪器设备,如二氧化碳培养箱、显微镜、细胞计数仪等。
在实习过程中,我不仅掌握了细胞培养的基本技能,还参与了一些具体的实验项目。
我参与了一项关于细胞凋亡的研究,通过细胞培养技术,我成功地培养了所需细胞,并进行了凋亡实验。
通过观察细胞形态的变化和流式细胞术的分析,我得出了实验结果,并协助导师进行了数据分析和论文撰写。
这个过程中,我不仅学习了实验设计和数据分析的方法,还提高了自己的实验操作能力。
在实习期间,我也遇到了一些挑战和困难。
例如,细胞培养过程中细胞的生长速度较慢,有时需要耐心等待。
另外,细胞的复苏和传代过程中,也有一些技巧需要掌握。
通过请教导师和同事,我逐渐克服了这些困难,并取得了较好的实验结果。
通过这次实习,我不仅学到了专业知识和技能,还锻炼了自己的团队合作和沟通能力。
在实验室中,我与同事们共同合作,互相学习和帮助。
我们也定期进行实验室会议,分享实验进展和心得体会,这让我感受到了团队合作的重要性。
总之,这次细胞培养实习是一次非常宝贵的学习经历。
我不仅掌握了细胞培养的基本技能,还参与了一些具体的实验项目,并取得了较好的研究成果。
同时,我也学会了团队合作和沟通的能力。
我相信这次实习对我未来的学术研究和职业发展将产生积极的影响。
化痰法结合补气、活血法促进肝星状细胞系HSC-T6凋亡的实验研究
化痰法结合补气、活血法促进肝星状细胞系HSC-T6凋亡的实验研究宋春花;张志花;陈涛;黄志华;常欣峰;尹宝;陈荟瀛;周海倩;韩立民【摘要】目的:观察化痰法结合补气、活血法对肝星状细胞系HSC-T6生长的抑制作用及对相关凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响.方法:制备相关化痰法药物血清,采用MTT法检测各组含药血清对HSC-T6细胞增殖的影响;Annexin V/PI双染法,流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡率;Western blot方法检测细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达情况.结果:MTT结果表明化痰法结合补气、活血法可有效抑制肝星状细胞HSC-T6的增殖;Annexin V/PI双染色流式细胞术检测结果表明化痰法结合补气、活血法可以促进HSC-T6细胞凋亡:Western blot结果显示化痰法结合补气、活血法能降低细胞中Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,且Bcl-2/Bax明显下降.结论:化痰法结合补气、活血法可通过抑制Bcl-2蛋白表达、促进Bax蛋白表达来诱导HSC-T6细胞凋亡,进而发挥抗肝纤维化作用.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2016(036)004【总页数】5页(P543-546,593)【关键词】肝纤维化;化痰法;HSC-T6;Bcl-2;Bax【作者】宋春花;张志花;陈涛;黄志华;常欣峰;尹宝;陈荟瀛;周海倩;韩立民【作者单位】赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;湖南中医药大学,湖南长沙410007;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000【正文语种】中文【中图分类】R965肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。
细胞培养实验报告
细胞培养实验报告细胞培养是现代生物学研究中不可或缺的手段,其涉及到细胞的生长、分化、代谢以及各种分子和信号的相互作用等。
今天我将分享一份由我亲自进行的细胞培养实验报告,以介绍这一重要技术的原理、步骤和结果。
实验原理细胞培养指的是将体外的细胞,按照一定比例和条件,放置在培养基中进行生长和繁殖的一种方法,通常包含以下步骤:使用无菌操作要求的器材和条件进行细胞总和的计数、试管的制备、制备试验培养液、细胞处理、细胞复苏、细胞的种植等。
实验步骤在实验之前,需要先准备培养所需的器材和试剂,如细胞培养基、跳汞灯、无菌器皿、超净台、离心管、显微镜和培养皿等。
接下来,我们按照以下步骤进行细胞培养。
1. 细胞的收获和处理我们用脱离液将细胞从体内取出,再加入一个特定的培养基中。
我们需要用细胞水平计算细胞总量,并将其分为每个培养皿中的所需数量。
如我们所选的細胞因子等指标。
2. 细胞扩增和培养在试管中添加适当的培养基、生长因子、荷尔蒙和混合,将所有细胞加入并处理好,很快开始分裂形成足够的细胞密度。
3. 培养的观察和种植使用无菌操作的器材和技术检查细胞的状况和数量,然后将其通过无菌技术铺在特定的基质上,进行后续的观察和研究。
实验结果在本次细胞培养实验中,我们成功提取了人造血液中的白细胞,通过分裂和培养,检测到细胞数量的增加和改变,以及不同化学和物理刺激的作用。
我们也观察了细胞的状态、形态和细胞核的状态,以评估其是否处于正常状态。
此外,我们还测试了不同培养条件下的生长速度和丰度,比较了细胞的发育和生长。
结论和思考在本次实验中,我们成功进行了细胞培养,该技术不仅可用于证实细胞的正常生长和增殖,还可用于疾病的研究和治疗中。
在实验中,我们需要注意无菌操作、培养条件和细胞的状态,以保证实验的成功和准确性。
总之,本次细胞培养实验为我们提供了一个更深入地了解细胞生物学的机会。
不仅可以促进人类健康的治疗方法,还可以为制药、医疗和工业领域提供更好的方法和技术。
白灵芝提取物对大鼠肝星状细胞增殖、活化及Wntβ-catenin信号通路的影响
白灵芝提取物对大鼠肝星状细胞增殖、活化及Wnt/β-catenin信号通路的影响肖毅力1,张宝月1,张亚红2,宋正己21昆明理工大学医学院,昆明650500;2云南省第一人民医院摘要:目的观察白灵芝提取物(GLE)对大鼠肝星状细胞增殖、活化的影响,并探讨其是否与Wnt/β-catenin信号通路有关。
方法将大鼠肝星状细胞HSC-T6分为GLE组和对照组,GLE组用稀释不同倍数的GLE干预,对照组加等量培养液,分别于干预24、48、72h用CCK8法测定细胞增殖OD值,计算细胞增殖抑制率,筛选GLE作用时间及作用浓度;将HSC-T6细胞分为干预组和对照组,干预组加入筛选浓度的GLE,对照组加入等量培养液,于筛选的作用时间时,采用RT-PCR法检测HSC活化标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA,Western blotting法检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Frizzled-4、β-catenin。
结果随着GLE组浓度增加及干预时间延长,HSC-T6细胞增殖的OD值逐渐降低,并以48h、稀释200倍作为GLE后续实验作用时间及浓度。
与对照组比较,干扰组HSC-T6细胞α-SMA、TGF-β1mRNA及Frizzled-4、β-catenin蛋白表达量降低(P均<0.05)。
结论GLE可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活抑制HSC-T6的增殖与活化,具有发展为防治肝纤维化临床用药的潜力。
关键词:白灵芝提取物;肝星状细胞;细胞增殖;细胞活化;Wnt/β-catenin信号通路;抗肝纤维化doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2021.05.010中图分类号:R965文献标志码:A文章编号:1002-266X(2021)05-0040-04Effects of white Lingzhi extracts on proliferation,activation and Wnt/β-catenin signal pathway of rat hepatic stellate cellsXIAO Yili1,ZHANG Baoyue,ZHANG Yahong,SONG Zhengyi1Kunming University of Science and Technology,Kunming650500,ChinaAbstract:Objective To observe the effects of white Lingzhi(ganoderma lucidum)extracts(GLE)on the prolifera⁃tion and activation of rat hepatic stellate cells,and to explore whether it is related to the Wnt/β-catenin signaling pathway.Methods The rat hepatic stellate cells HSC-T6were divided into the GLE group and control group.The cells in the GLE group were treated with GLE diluted in different multiples,and the control group with the same amount of culture medium.The OD values were measured by CCK-8at24,48,and72h after the intervention,and we calculated cell proliferation in⁃hibition rate,and screened GLE action time and action concentration.We divided HSC-T6cells into the intervention group and control group.The cells in the intervention group were added with the selected concentrations of GLE,and the control group with the same amount of culture medium.During the action time,RT-PCR was used to detect the HSC activa⁃tion marker proteinα-SMA and transforming growth factorβ1(TGF-β1)mRNA,and Western blotting was used to detect the key proteins Frizzled-4andβ-catenin in the Wnt/β-catenin signaling pathway.Results With the increased concen⁃trations and the extension of the intervention time,the OD values of HSC-T6cells gradually decreased in the GLE group;48h and200times dilution were used as the time and concentration of the follow-up GLE pared with the control group,the expression levels ofα-SMA,TGF-β1mRNA,Frizzled-4andβ-catenin proteins in HSC-T6cells of the interference group decreased(all P<0.05).Conclusion GLE may inhibit the proliferation and activation of HSC-T6 cells by inhibiting the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway,and has the potential to develop into a clinical drug for the prevention and treatment of liver fibrosis.Key words:white Lingzhi(ganoderma lucidum)extracts;hepatic stellate cells;cell proliferation;cell activation;Wnt/β-catenin signaling pathway;anti-liver fibrosis基金项目:云南省科技厅—昆明医科大学应用基础研究联合专项(2019FE001-121)。
补骨脂素对肝星状细胞(HSC-T6)增殖、氧化应激及Ⅰ型胶原分泌的影响
补骨脂素对肝星状细胞(HSC-T6)增殖、氧化应激及Ⅰ型胶原分泌的影响郭敏;李佃贵;王建华;高绍芳;张纨;张红莲【摘要】To investigate the effect of psoralen on the proliferation and correlated factors of hepatic stellate cells ( HSCT6) in vitro. Psoralen was dissolved in dimethyl sulphoxide (DMSO) at different concentrations of 10 μmmoL/L, 1 μmmol/L,0. 1 μmmol/L, and 0. 01 μmmol/L. The cell proliferation was assessed with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) after incubation with psoralen for 24 h,48 h,and 72 h,respectively. HSC-T6 were divided into 5 groups and incubated in the presence of 0.1 mol/L hydrogen dioxide followed by washing with PBS for 3 times. Psoralen at different concentrations (10 μmol/L, 1 . μnol/L,0. 1 μmol/L) was added into the cell culture media,and after incubatio for 48 h,the activities or levels of superoxide dismutase (SOD),malonaldehyde (MDA) ,glutathione (GSH),glutathione peroxidase (GSH-Px),and collagen I (COL I) in the supematant of the cell culture were measured. The results showed that psoralen inhibited the cell proliferation at the concentration of 10, 1, and O.1 μnol/L. Psoralen significantly decreased the production of extracellular MDA, GSH, and COL I and increased SOD and GSH-Px activity. Therefore, psoralen can inhibit the proliferation of HSC-T6,decrease lipid peroxiclation in HSC-T6, and degrade the secretion from COL I in HSC-T6.%通过研究植物雌激素香豆素补骨脂素对体外培养的大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及相关因子表达的影响,为补骨脂素治疗肝纤维化提供实验依据.常规培养肝星状细胞HSC-T6,采用0.1 mmol/L的H202制造HSC-T6氧化应激的模型.分别用MTT 法检测肝星状细胞增殖、放射免疫法检测细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),还原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性和含量,ELISA法测定Ⅰ型胶原的分泌.结果表明:与正常对照组组比较,补骨脂素在浓度为10 μmol/L,1 μmol/L,0.1 μmol/L,均呈现出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05),且最佳作用时间为48 h(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组能够提高SOD 和GSH-Px的活性(P<0.05),并降低细胞上清液中MDA和GSH的含量(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组在作用48 h后,细胞上清液中的Ⅰ型胶原的表达量均降低(P<0.05).因此,作为植物雌激素的一种,补骨脂素能有效的抑制HSC-T6的增殖及抗HSC-T6氧化应激,很可能成为雌激素的替代品在治疗肝纤维化中.【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2011(023)001【总页数】4页(P35-38)【关键词】肝纤维化;肝星状细胞;补骨脂素;植物雌激素;氧化应激【作者】郭敏;李佃贵;王建华;高绍芳;张纨;张红莲【作者单位】河北医科大学研究生院,石家庄,050017;河北医科大学中医院消化内科,石家庄,050011;河北医科大学天然药物教研室,石家庄,050017;石家庄卫生学校,石家庄,050017;河北医科大学研究生院,石家庄,050017;河北医科大学研究生院,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R285.5Abstract:To investigate the effect of psoralen on the proliferation and correlated factors of hepatic stellate cells(HSCT6)in vitro.Psoralen was dissolved in d imethyl sulphoxide(DMSO)at different concentrations of10μmmol/L,1 μmmol/L,0.1μmmol/L,and 0.01μmmol/L.The cell proliferation was assessed with methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)after incubation with psoralen for 24 h,48 h,and 72 h,respectively.HSC-T6 were divided into 5 groups and incubated in the presence of 0.1 mol/L hydrogen dioxide followed by washing with PBS for 3 times.Psoralen at different concentrations(10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L)was added into the cell culture media,and after incubation for 48 h,the activities or levels of superoxide dismutase(SOD),malonaldehyde(MDA),glutathione(GSH),glutathione peroxidase(GSH-Px),and collagen I(COL I)in the supernatant of the cell culture were measured.The results showed that psoralen inhibited the cell proliferation at the concent ration of 10,1,and 0.1μmol/L.Psoralen significantly decreased the production of extracellularMDA,GSH,and COL I and increased SOD and GSH-Px activity.Therefore,psoralen can inhibit the proliferation of HSC-T6,decrease lipid peroxidation in HSC-T6,and degrade the secretion from COL I in HSC-T6.Key words:liver fibrosis;hepatic stellatecells;psoralen;phytoestrogen;oxidative stress流行病学调查显示,患有乙型肝炎的女性患者发展成肝纤维化甚至肝硬化的几率比男性患者低得多,且多发生在绝经后,育龄期妇女很少有发生肝纤维化或是肝硬化[1]。
HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告
HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告前言肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)的名称有多种多样,如肝贮脂细胞(fat-storingcell,FSC)、脂细胞(1ipocyte)、维生素A贮存细胞(vitaminA-storingcell)、窦周细胞(perisinusoidalcell)、Ito细胞等。
HSC位于Disse间隙内,紧贴着肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelialcells,SEC)和肝细胞。
其形态不规则,胞体呈圆形或不规则形,常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。
此外,HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。
HSC胞质内有1~14个直径约1.0~2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴,胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。
胞核形态不规则,由于脂滴的挤压,常致细胞核有一个或多个凹陷,核内可见1~2个核仁。
正常肝脏中HSC的数目很少,只占肝细胞总体数目的5%~8%及总体体积的1.4%,但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。
正常情况下HSC表现为富含VitaminA脂滴的静止型,其功能主要有:(1)代谢和贮存VitaminA:肝脏储存有体内80%左右的维生素A,对体内维生素A的代谢起着重要作用。
视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合,然后转运到邻近的HSC储存。
(2)储存脂肪:正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯,为肝细胞提供能源。
(3)合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。
目前的研究认为,HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的主要合成细胞。
正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主,其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。
HSC还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分,以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。
细胞培养技术实验报告
细胞培养技术实验报告细胞培养技术实验报告细胞培养技术是现代生物学研究中不可或缺的重要手段之一。
通过细胞培养技术,研究人员可以在实验室中培养和研究各种类型的细胞,以便更好地了解细胞的结构、功能和生理特性。
本文将从细胞培养的原理、培养基的配制和培养条件的控制等方面,详细介绍细胞培养技术的相关内容。
一、细胞培养的原理细胞培养的原理是将细胞从生物体中分离出来,置于含有适当营养物质的培养基中,提供适宜的温度、湿度和气体环境,使细胞能够在体外生长和繁殖。
细胞培养的关键是培养基的配制,培养基中必须包含细胞所需的营养物质,如氨基酸、糖类、维生素等,同时还需要添加生长因子、激素和抗生素等物质,以促进细胞的生长和增殖。
二、培养基的配制培养基的配制是细胞培养中的重要环节。
不同类型的细胞需要不同的培养基,因此在进行细胞培养实验时,需要根据具体的细胞类型选择适当的培养基。
一般来说,培养基主要包括基础培养基和补充物两部分。
基础培养基是指提供细胞生长所需的基本营养物质的培养基,如DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)、RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)等。
补充物则是指在基础培养基中添加的各种生长因子、激素和抗生素等物质。
常见的补充物有胎牛血清、胰岛素、转铁蛋白、乳酸等。
在配制培养基时,需要注意各种成分的浓度和比例。
浓度过高或过低都会对细胞的生长和增殖产生影响。
此外,培养基的pH值也是一个重要的参数,一般细胞培养的pH值在7.2-7.4之间。
三、培养条件的控制细胞培养的成功与否,除了培养基的配制外,还与培养条件的控制密切相关。
培养条件主要包括温度、湿度和气体环境等方面。
温度是细胞培养中最重要的因素之一。
不同类型的细胞对温度的要求有所不同,一般来说,人类体细胞的培养温度为37摄氏度,而某些动物细胞则需要较低的温度,如鸟类细胞的培养温度为25摄氏度。
细胞培养实验报告
一、实验目的1. 熟悉细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 掌握哺乳动物细胞原代培养和传代培养的方法。
3. 了解细胞培养在生物学研究中的应用。
二、实验原理细胞培养是将生物体内的细胞取出,在体外模拟体内生理条件下,使其生长、繁殖或传代的过程。
细胞培养技术的最大优点是能够直接观察活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可以与体内实验互为补充。
细胞培养技术在生物学研究、医学、生物工程等领域中具有广泛的应用。
三、实验用品1. 仪器:显微镜、细胞培养箱、超净工作台、离心机、移液器、培养皿、载玻片、盖玻片等。
2. 试剂:胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、D-Hank's液、75%酒精等。
四、实验步骤1. 原代细胞培养(1)取动物组织,用D-Hank's液清洗,去除血污。
(2)将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块,加入胰蛋白酶,37℃消化30分钟。
(3)消化完成后,用吸管轻轻吹打组织块,使其分散成单个细胞。
(4)加入胎牛血清终止消化,用离心机离心收集细胞。
(5)用DMEM培养基重悬细胞,调整细胞浓度至1×10^6个/ml。
(6)将细胞接种于培养皿中,放入细胞培养箱培养。
2. 传代培养(1)待细胞长满培养皿后,用吸管轻轻吹打细胞,使其从培养皿壁上脱落。
(2)收集细胞,用离心机离心收集细胞。
(3)用DMEM培养基重悬细胞,调整细胞浓度至1×10^6个/ml。
(4)将细胞接种于新的培养皿中,放入细胞培养箱培养。
五、实验结果1. 原代细胞培养过程中,细胞从组织块中脱落,分散成单个细胞,细胞形态呈梭形或圆形。
2. 传代培养过程中,细胞生长旺盛,细胞形态稳定。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中,温度、pH值、气体环境等因素对细胞生长影响较大。
实验中应严格控制培养条件,以保证细胞正常生长。
2. 细胞培养过程中,细胞传代次数过多会导致细胞老化,影响实验结果。
细胞实习实验结果自我鉴定
细胞实习实验结果自我鉴定
《细胞实习实验结果自我鉴定》
在这次细胞实习实验中,我参与了细胞培养、PCR、Western blot等实验操作,经过一段时间的努力,实验结果如下。
首先,细胞培养实验中,我成功地培养了细胞,并且观察到了它们的形态和生长情况。
在不断的调整和优化培养条件的过程中,我对细胞的培养和观察技术有了更深入的理解,并且学会了如何正确处理细胞,以避免细胞的污染和损伤。
其次,PCR实验中,我按照实验步骤进行了DNA的提取、扩增和分析,最终成功地获得了预期的PCR产物。
在PCR实验过程中,我严格控制了实验条件,避免了污染和失误,并且学会了如何分析PCR结果。
最后,在Western blot实验中,我学会了制备凝胶、电泳分离蛋白质以及转膜和膜上抗体染色等操作。
通过这些实验操作,我成功地观察到了目标蛋白的表达情况,并且熟练掌握了Western blot实验的技术要点。
通过这次细胞实习实验,我不仅学到了理论知识,更重要的是锻炼了自己的实验操作技能和实验设计能力。
在今后的学习和科研工作中,我会继续努力提高自己的实验能力,为科学研究做出更多的贡献。
细胞培养的实验报告
细胞培养的实验报告细胞培养的实验报告引言:细胞培养是生物学研究中常用的技术手段之一,它可以为我们提供大量的细胞供应,从而进行各种实验研究。
本实验旨在通过细胞培养技术,观察细胞的生长和分裂情况,并探究不同培养条件对细胞生长的影响。
实验材料与方法:1. 细胞培养基:含有营养物质、生长因子和抗生素的培养基。
2. 细胞培养器:培养细胞的容器,如培养皿、细胞培养瓶等。
3. 细胞培养物:实验中使用的细胞株。
4. 培养箱:提供适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
5. 显微镜:观察细胞生长和形态的工具。
实验步骤:1. 准备培养基:按照说明书的要求,将培养基与适量的培养液混合均匀。
2. 细胞接种:将细胞株取出,加入培养基中,并使用移液器进行充分混合。
3. 培养条件调节:将培养器放入培养箱中,设置适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
4. 观察细胞生长:每隔一段时间,用显微镜观察细胞的生长情况,并记录细胞数量和形态变化。
5. 细胞分裂观察:在细胞生长到一定程度后,进行细胞分裂观察,记录细胞分裂的时间和方式。
6. 培养条件对比:将不同培养条件下的细胞生长情况进行对比分析,探究不同条件对细胞生长的影响。
结果与讨论:通过实验观察,我们发现细胞在培养基中能够良好地生长和分裂。
在适宜的培养条件下,细胞数量逐渐增多,并呈现出正常的形态。
细胞分裂的时间和方式也符合细胞生长的规律。
而在不适宜的培养条件下,细胞生长受到抑制,数量较少且形态异常。
进一步的对比分析发现,温度、湿度和二氧化碳浓度是影响细胞生长的重要因素。
过高或过低的温度会导致细胞代谢异常,影响细胞的生长和分裂。
湿度过高则容易导致细菌和霉菌的滋生,对细胞生长产生不利影响。
而二氧化碳浓度的调节则与细胞的酸碱平衡和呼吸有关,过高或过低的浓度都会对细胞的生长产生负面影响。
结论:细胞培养技术是一种重要的生物学研究手段,通过合理调节培养条件可以实现细胞的良好生长和分裂。
本实验通过观察细胞在不同培养条件下的生长情况,发现温度、湿度和二氧化碳浓度对细胞生长具有重要影响。
细胞培养小实验实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握细胞培养的基本操作流程,包括原代培养和传代培养。
2. 了解细胞培养过程中的无菌操作规范。
3. 观察细胞在体外培养过程中的生长、增殖和形态变化。
二、实验原理细胞培养是从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可以与体内实验互为补充。
三、实验用品1. 仪器及器材:显微镜、载玻片、盖玻片、移液枪、培养皿、无菌操作台、无菌操作箱、细胞培养箱、CO2培养箱、细胞计数器等。
2. 试剂:细胞培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、抗生素、无菌水等。
四、实验步骤1. 原代细胞培养(1)取动物组织,剪碎后用胰蛋白酶消化,制成细胞悬液。
(2)将细胞悬液加入培养皿,置于CO2培养箱中培养。
(3)观察细胞生长情况,每隔24小时更换一次培养液。
2. 传代培养(1)当细胞达到一定密度时,用胰蛋白酶消化细胞,制成细胞悬液。
(2)将细胞悬液按1:2的比例传代到新的培养皿中。
(3)观察细胞生长情况,每隔24小时更换一次培养液。
3. 细胞计数(1)取适量细胞悬液,加入细胞计数器。
(2)计数细胞数量,计算细胞密度。
4. 细胞形态观察(1)取细胞培养皿,用盖玻片覆盖。
(2)置于显微镜下观察细胞形态、生长情况。
五、实验结果1. 细胞生长情况:原代细胞在培养皿中生长良好,细胞密度逐渐增加。
传代培养后,细胞生长速度略有下降,但总体状况良好。
2. 细胞形态:细胞呈多边形,细胞核清晰可见,细胞间连接紧密。
3. 细胞计数:细胞密度为1×10^6个/mL。
六、实验结论1. 成功进行了原代细胞培养和传代培养。
2. 细胞在体外培养过程中生长良好,细胞形态正常。
3. 细胞培养技术为生物学研究提供了有力工具。
七、实验总结本次实验成功掌握了细胞培养的基本操作流程,了解了无菌操作规范,并观察了细胞在体外培养过程中的生长、增殖和形态变化。
HSCT细胞培养及鉴定实验报告
HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告前言肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)的名称有多种多样,如肝贮脂细胞(fat-storingcell,FSC)、脂细胞(1ipocyte)、维生素A贮存细胞(vitaminA-storingcell)、窦周细胞(perisinusoidalcell)、Ito细胞等。
HSC位于Disse 间隙内,紧贴着肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelialcells,SEC)和肝细胞。
其形态不规则,胞体呈圆形或不规则形,常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。
此外,HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。
HSC胞质内有1~14个直径约1.0~2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴,胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。
胞核形态不规则,由于脂滴的挤压,常致细胞核有一个或多个凹陷,核内可见1~2个核仁。
正常肝脏中HSC的数目很少,只占肝细胞总体数目的5%~8%及总体体积的1.4%,但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。
正常情况下HSC表现为富含VitaminA脂滴的静止型,其功能主要有:(1)代谢和贮存VitaminA:肝脏储存有体内80%左右的维生素A,对体内维生素A的代谢起着重要作用。
视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合,然后转运到邻近的HSC储存。
(2)储存脂肪:正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯,为肝细胞提供能源。
(3)合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。
目前的研究认为,HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的主要合成细胞。
正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主,其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。
HSC还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分,以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。
细胞培养 实验报告
细胞培养实验报告细胞培养实验报告细胞培养是一项重要的实验技术,广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域。
通过细胞培养,科研人员可以研究细胞的生长、分化、增殖以及对外界刺激的响应等生物学特性。
本实验旨在探究细胞培养的基本原理和技术操作,并观察细胞在不同条件下的生长情况。
实验材料与方法1. 材料:- 细胞培养基:含有适当营养物质的培养基,提供细胞生长所需的营养成分。
- 细胞:选择适合实验的细胞系,如HeLa细胞,用于观察细胞的生长情况。
- 试剂:如胰蛋白酶、细胞培养添加剂等,用于处理和培养细胞。
- 培养器具:培养皿、离心管、显微镜等。
2. 方法:- 细胞分离:将细胞培养物中的细胞分离出来,通过胰蛋白酶等酶的作用,使细胞从培养皿上脱落。
- 细胞计数:用显微镜观察并计数细胞数量,以确定细胞的密度。
- 细胞培养:将细胞转移到含有培养基的新培养皿中,提供适宜的条件促进细胞的生长和分裂。
- 细胞观察:使用显微镜观察细胞的形态、生长状态和细胞群落的分布情况。
- 细胞传代:当细胞达到一定密度时,将细胞从原培养皿转移到新的培养皿中,以保持细胞的健康生长。
实验结果与分析在本次实验中,我们选择了HeLa细胞系进行细胞培养实验。
首先,我们将HeLa细胞从冻存管中取出,加入适量的培养基中,并在37摄氏度的恒温培养箱中进行培养。
经过一段时间的培养,我们观察到细胞开始生长并形成细胞群落。
在观察细胞生长的过程中,我们注意到细胞的形态发生了变化。
初始时,细胞呈悬浮状态,形态较小而圆润。
随着培养时间的延长,细胞开始附着在培养皿上,并逐渐变得扁平而呈现典型的上皮细胞形态。
这是因为细胞在培养基中获得了足够的营养和生长因子,从而促进了细胞的增殖和分化。
我们还进行了细胞计数实验,以确定细胞的密度。
通过显微镜观察,在特定的视野范围内,我们计数了细胞的数量,并以此推算出整个培养皿中的细胞密度。
结果显示,随着培养时间的增加,细胞密度逐渐增加,细胞数量呈指数增长的趋势。
细胞培养的实验报告
细胞培养的实验报告细胞培养的实验报告引言:细胞培养是现代生物学研究中非常重要的一项技术,它能够使科研人员对细胞的生长、分化、增殖等过程进行深入研究。
本实验旨在通过细胞培养技术,观察和分析细胞在不同条件下的生长变化,以期对细胞生物学有更深入的了解。
实验材料与方法:1. 细胞培养基:含有营养物质、生长因子和抗生素的培养基。
2. 细胞培养器具:培养皿、培养瓶、离心管等。
3. 细胞:选择合适的细胞系进行培养,本实验选取了人类肺癌细胞系A549。
4. 细胞培养条件:细胞培养箱、恒温恒湿箱等。
实验步骤:1. 细胞的分离和传代:将细胞移植到含有培养基的培养皿中,使细胞附着并生长。
当细胞达到一定密度时,用胰酶等酶类将细胞从培养皿上剥离,然后将细胞转移到新的培养皿中,完成细胞的传代。
2. 细胞的培养和观察:将细胞培养在恒温恒湿箱中,定期观察细胞的生长情况,记录细胞数量、形态和颜色等变化。
3. 细胞的处理和实验操作:根据实验设计的需要,对细胞进行不同处理,如添加药物、改变培养条件等,然后进行相关实验操作,如细胞增殖实验、细胞凋亡检测等。
实验结果与分析:在本实验中,我们观察了A549细胞在不同培养条件下的生长变化。
首先,我们将细胞培养在常规培养基中,观察到细胞呈现出典型的贴壁生长方式,细胞数量逐渐增加,形态呈现出多角形。
随着培养时间的延长,细胞形态逐渐变得规则,细胞数量也逐渐增加。
接下来,我们改变了培养条件,将细胞培养在含有不同浓度药物的培养基中。
结果显示,随着药物浓度的增加,细胞数量逐渐减少,细胞形态也发生了明显的变化。
这表明该药物对细胞的生长和增殖产生了抑制作用。
此外,我们还进行了细胞凋亡检测实验。
通过染色和显微镜观察,我们发现在药物处理组中,细胞出现了明显的凋亡现象,如细胞核的碎裂和细胞体的收缩等。
而在对照组中,细胞呈现出正常的形态和结构。
讨论与结论:通过本实验,我们成功地进行了细胞培养并观察了细胞在不同条件下的生长变化。
细胞培养实验报告
细胞培养实验报告
细胞培养是一种常见的实验技术,用于细胞生物学和生物医学研究中。
通过细胞培养,可以对细胞进行观察、实验和研究,从而更好地理解细胞的生物学特性和生理功能。
在本次实验中,我们进行了细胞培养实验,并得到了一些有意义的结果和结论。
首先,我们准备了所需的培养基、细胞培养器具和细胞样本。
在实验过程中,我们严格按照操作规程进行操作,保证了实验的准确性和可靠性。
在培养细胞的过程中,我们注意了细胞的密度、培养基的配比、培养条件的控制等因素,保证了细胞的正常生长和稳定性。
接着,我们对培养的细胞进行了观察和实验。
我们观察到细胞在培养基中呈现出良好的形态和生长状态,细胞的数量也在逐渐增加。
通过显微镜观察,我们发现细胞的形态和结构都符合正常的细胞特征,没有出现异常情况。
在实验中,我们还对细胞进行了染色、免疫分析等实验,得到了一些有意义的结果。
最后,我们对实验结果进行了分析和总结。
我们得出了一些关于细胞生长、分化、代谢等方面的结论,这些结论对于我们进一步研究细胞生物学和生物医学具有一定的指导意义。
同时,我们也发现了一些实验中存在的问题和不足之处,为今后的实验工作提出了改进和完善的建议。
综上所述,本次细胞培养实验取得了一些有意义的结果和结论,对于我们的研究工作具有一定的参考价值。
在今后的工作中,我们将进一步完善实验方案,提高实验技术水平,不断深入研究细胞的生物学特性和生理功能,为生物医学研究做出更大的贡献。
人类细胞鉴定实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握人类细胞培养的无菌操作技术。
2. 掌握细胞培养过程中细胞生长、传代和冻存的方法。
3. 了解和掌握细胞形态、染色、细胞核分离与鉴定等实验技术。
4. 通过实验,对人类细胞进行鉴定和分析。
二、实验原理细胞培养是一种在体外模拟体内生理环境,使细胞在无菌条件下生长和繁殖的技术。
通过观察细胞的生长、形态、染色等特征,可以鉴定和分析细胞的种类、状态和功能。
三、实验材料与仪器1. 材料:人胚肺二倍体细胞系(HEP-2)、人皮肤成纤维细胞(HSF)、人肝细胞(HLC)等。
2. 仪器:超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养皿、移液器、细胞计数板、染色剂等。
四、实验步骤1. 细胞培养(1)将HEP-2、HSF、HLC细胞分别接种于培养皿中,置于CO2培养箱中培养。
(2)观察细胞生长情况,待细胞长至约80%融合时,进行传代培养。
(3)将传代后的细胞进行冻存,备用。
2. 细胞染色(1)取培养的细胞,用PBS洗涤后,加入固定液固定细胞。
(2)加入染色剂,如瑞氏染液,染色10分钟。
(3)用蒸馏水冲洗,晾干后观察细胞染色情况。
3. 细胞核分离与鉴定(1)取培养的细胞,用蛋白酶K处理,使细胞核释放。
(2)加入染色剂,如碘化丙啶,染色细胞核。
(3)用荧光显微镜观察细胞核,进行细胞核鉴定。
4. 细胞计数(1)取一定量的细胞悬液,加入计数板。
(2)在显微镜下观察,计数细胞数量。
(3)计算细胞存活率。
五、实验结果与分析1. 细胞培养通过观察,HEP-2、HSF、HLC细胞在培养过程中均能生长繁殖,细胞形态良好。
2. 细胞染色通过瑞氏染色,HEP-2细胞呈蓝色,HSF细胞呈粉红色,HLC细胞呈绿色。
3. 细胞核分离与鉴定通过荧光显微镜观察,HEP-2、HSF、HLC细胞核均呈绿色,表明细胞核已成功分离和鉴定。
4. 细胞计数通过细胞计数,HEP-2、HSF、HLC细胞存活率分别为90%、85%、80%。
六、实验结论1. 成功进行了人类细胞培养、传代和冻存。
HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告
HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告第一篇:HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告前言肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的名称有多种多样,如肝贮脂细胞(fat-storing cell,FSC)、脂细胞(1ipocyte)、维生素A 贮存细胞(vitamin A-storing cell)、窦周细胞(perisinusoidal cell)、Ito细胞等。
HSC位于Disse间隙内,紧贴着肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cells, SEC)和肝细胞。
其形态不规则,胞体呈圆形或不规则形,常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。
此外,HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。
HSC胞质内有1~14个直径约1.0~2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴,胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。
胞核形态不规则,由于脂滴的挤压,常致细胞核有一个或多个凹陷,核内可见1~2个核仁。
正常肝脏中HSC的数目很少,只占肝细胞总体数目的5%~8%及总体体积的1.4%,但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。
正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型,其功能主要有:(1)代谢和贮存Vitamin A:肝脏储存有体内80%左右的维生素A,对体内维生素A的代谢起着重要作用。
视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合,然后转运到邻近的HSC储存。
(2)储存脂肪:正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯,为肝细胞提供能源。
(3)合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。
目前的研究认为,HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的主要合成细胞。
正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主,其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。
细胞培养实验报告
细胞培养实验报告一、实验目的本次细胞培养实验旨在掌握细胞培养的基本技术和方法,了解细胞在体外生长和增殖的规律,为进一步的细胞生物学研究和应用奠定基础。
二、实验原理细胞培养是指在体外模拟体内环境,将细胞从机体中取出,在无菌、适当温度和一定营养条件下,使其生长、繁殖并维持其结构和功能的一种技术。
细胞培养的关键在于提供适宜的生长环境,包括培养基、血清、气体环境、无菌条件等。
三、实验材料与设备1、细胞株:选用了_____细胞株。
2、培养基:使用了_____培养基,添加了_____血清和_____抗生素。
3、实验设备:超净工作台、CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
4、试剂:胰蛋白酶、EDTA 等。
四、实验步骤1、细胞复苏从液氮罐中取出冻存的细胞管,迅速放入 37℃水浴中,轻轻摇动使其快速融化。
将融化的细胞悬液转移至离心管中,加入适量的培养基,离心 5 分钟(_____转/分钟)。
弃去上清液,加入新鲜的培养基重悬细胞,将细胞接种到培养瓶中,置于 CO₂培养箱中培养。
2、细胞传代当细胞生长至汇合度达到 80% 90%时,进行传代培养。
吸出原培养基,用 PBS 缓冲液冲洗细胞 2 次。
加入适量的胰蛋白酶EDTA 消化液,置于培养箱中消化2 3 分钟。
在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞变圆、脱壁时,加入适量的含血清培养基终止消化。
轻轻吹打细胞,使其形成单细胞悬液,按照 1:2 或 1:3 的比例进行传代接种,置于 CO₂培养箱中继续培养。
3、细胞计数采用血球计数板对细胞进行计数。
吸取适量的细胞悬液,加入等体积的台盼蓝染液,混匀。
取少量混合液加入血球计数板的计数室,在显微镜下计数。
4、细胞形态观察在倒置显微镜下,每天观察细胞的形态、生长状态和密度。
五、实验结果1、细胞复苏结果细胞复苏后,经过 24 小时的培养,大部分细胞贴壁生长,形态良好,表明复苏成功。
2、细胞传代结果细胞经过传代培养后,能够正常生长和增殖,形态和生长速度与原代细胞相似。
褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响
褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响戴启心;宋伟;张润锦;王恺;邹书兵【摘要】目的:探讨褐藻素对HSC-T6细胞生长和凋亡的影响.方法:将HSC-T6细胞分为空白对照组、阴性对照组及药物组,用不同浓度的褐藻素培养HSC-T6细胞.采用CCK-8检测在24 h、48 h和72 h褐藻素对HSC-T6细胞活力变化的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blot法分别检测Bcl-2和Bax的蛋白表达.结果:与空白对照组相比,CCK-8检测的结果表明,褐藻素在一定浓度范围内(15 ~ 75 μmol/L)内能显著抑制HSC-T6细胞的活力(P<0.01),呈剂量和时间依赖性.流式细胞术结果显示,24 h后高浓度(60 μmol/L)组对HSC-T6细胞周期影响的效果显著(P<0.01),G1期比例显著下降(P<0.01),G2期和S期的比例显著升高(P <0.01),48 h后低浓度(15 μmol/L)和中浓度(30 μmol/L)组对HSC-T6细胞周期的阻滞作用增强,呈剂量依赖性(P<0.05);低、中、高浓度组早期凋亡率和总凋亡率都显著升高,呈剂量依赖性(P<0.05).蛋白印迹法实验结果表明,低、中、高浓度组Bax的蛋白表达显著上调,中、高浓度组Bcl-2的蛋白表达显著下调(P<0.05).结论:褐藻素可以通过使细胞周期阻滞于S期和G2期而抑制HSC-T6细胞生长;同时能通过下调Bcl-2和上调Bax的表达而诱导HSC-T6细胞凋亡.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2016(032)006【总页数】6页(P1132-1137)【关键词】褐藻素;HSC-T6细胞;细胞活力;细胞周期;细胞凋亡;Bcl-2;Bax【作者】戴启心;宋伟;张润锦;王恺;邹书兵【作者单位】南昌大学第二附属医院肝胆外科,南昌330006;南昌大学第二附属医院肝胆外科,南昌330006;南昌大学第二附属医院肝胆外科,南昌330006;南昌大学第二附属医院肝胆外科,南昌330006;南昌大学第二附属医院肝胆外科,南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R391.11肝纤维化常继发于肝脏慢性炎症性损伤,而在慢性炎症阶段,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)持续激活后分泌大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM),以至于其合成与分解代谢失衡而过度沉积于肝脏,是肝纤维化发展中的关键因素[1]。
细胞实验——精选推荐
细胞实验结论:OB对HepG2.2.15细胞分泌⼄型肝炎病毒抗原和HSC—T6细胞表达a—SMA 和I型胶原有抑制作⽤,且显著优于氧化苦参碱。
⼀、细胞 HepG 2.2.15细胞株购⾃天津医科⼤学微⽣物教研室,⼤⿏肝星状细胞株HSC—T6是由SV40转染SD⼤⿏肝星状细胞建⽴⽽成,表型为活化的肝星状细胞⼝,本所常规保存。
三、细胞培养与⼲预⼤⿏HSC—T6细胞以含10%胎⽜⾎清的DMEM完全培养基均培养箱培养,当细胞处于对数⽣长期时,胰酶消匀接种于培养⽫,37℃、5%CO2化,培养液悬浮细胞,调整密度为4×10 7/L,60mm培养⽫每⽫2000u1培养箱培养,细胞融合达80%时进⾏实验。
氧化苦参碱浓度为1mg/ml,()B组合物为1mg /mL氧化苦参碱中添加特定浓度的黄四、评价指标及检测半定量RT—PCR和Western blot检测a—SMA oB组合物、氧化苦参碱下调a—SMA基因和蛋⽩表达,前者作⽤更强。
OB组合物显著抑制HSC—T6细胞合成I型胶原 OB组合物和氧化苦参碱能够在基因和蛋⽩⽔平显著降低HSC—T6细胞合成I型胶原;半定量RT—PCR和western blot检测I型胶原0B组合物、氧化苦参碱下调I型胶原基因和蛋⽩表达,前者作⽤更强。
肝星状细胞(hepatic satellite cells,HSCs)是肝脏内的⼀种⾮实质细胞.占整个肝脏的8%~13%。
研究表明,此细胞活化后在形态上将转化为肌成纤维样细胞,在功能上将分泌⼤量的细胞外基质(extr- acellular matrix,ECM),导致肝纤维化。
⼀般认为。
原代的HSCs适合研究静⽌的HSCs的⽣物学⾏为,⽽传代培养适合研究活化的HSCs的⽣物学⾏为嘲。
在健康动物体内.HSCs绝⼤部分以未活化的形式存在,那么HSCs的活化过程将成为肝纤维化发病机制研究的中⼼环节。
早在1982年。
Knook等睬⽤两种不同密度梯度离⼼的⽅法分离得到H- SCs,上⾯⼀层为未活化的HSCs,下⾯⼀层从上到下分别为活化的H-SCs、Kupffer细胞和E 细胞罔,这样不仅使活化和未活化这两种状态的细胞位于不同的液⾯层,⽽且也去除了HSCs⾥⾯的Kuprier细胞.这样分离得到成年⼤⿏原代未活化的HSCs,⼤⼤提⾼了HSCs的纯度,为HSCs的特性研究以及阐明肝纤维化的发病机制提供了条件。
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HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告前言肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的名称有多种多样,如肝贮脂细胞(fat-storing cell,FSC)、脂细胞(1ipocyte)、维生素A贮存细胞(vitamin A-storing cell)、窦周细胞(perisinusoidal cell)、Ito细胞等。
HSC位于Disse间隙内,紧贴着肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cells, SEC)和肝细胞。
其形态不规则,胞体呈圆形或不规则形,常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。
此外,HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。
HSC胞质内有1~14个直径约1.0~2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴,胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。
胞核形态不规则,由于脂滴的挤压,常致细胞核有一个或多个凹陷,核内可见1~2个核仁。
正常肝脏中HSC的数目很少,只占肝细胞总体数目的5%~8%及总体体积的1.4%,但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。
正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型,其功能主要有:(1)代谢和贮存Vitamin A:肝脏储存有体内80%左右的维生素A,对体内维生素A的代谢起着重要作用。
视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合,然后转运到邻近的HSC储存。
(2)储存脂肪:正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯,为肝细胞提供能源。
(3)合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。
目前的研究认为,HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的主要合成细胞。
正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主,其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。
HSC 还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分,以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。
(4)合成基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase, MMP)及其组织抑制剂(tissue inhibitor of metallo proteinase,TIMP):正常情况下,HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2等以降解各种细胞外基质,同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解,使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。
(5)表达细胞因子及受体:正常情况下,HSC可以分泌肝细胞生长因子(HGF),参与肝细胞再生的调控。
此外,HSC还能表达少量的转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生的生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)等,同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。
(6)参与肝窦血流调节:HSC伸出胞突包绕着肝窦,通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环,从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力。
一、材料与方法1. 实验材料1.1实验材料大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自与中国科学院上海细胞所。
1.2主要仪器CO2细胞培养箱:上海力康仪器有限公司Smart Cell HF-90生物安全柜:上海力康仪器有限公司HF1200LC台式高速冷冻离心机:上海力康仪器有限公司Neofuge 15R台式低速离心机:上海飞鸽仪器有限公司TGL-16GB荧光倒置显微镜:日本尼康公司Eclipse TS100-F显微镜:日本尼康公司E200病理图文分析系统(工作站):上海千屏公司恒温水浴锅:上海精宏仪器厂DK-80液氮罐:成都金凤仪器厂YDS-50-125-20℃低温冰箱:合肥美菱公司DW-HL388单子分析天平(0.01mg):德国梅特勒AB304-S手动单道移液器:德国Eppendorf公司Research plus1.3主要试剂名称货号/批号厂家PBS磷酸盐缓冲液粉剂PBS0060, Lot#13061706 福州迈新生物技术开发有限公司胎牛血清16000044,Lot#1183723 美国Life technologies公司DMEM培养基C11995599BT,Lot#8113238 美国Life technologies公司0.25%胰酶25200056,Lot#1268598 美国Life technologies公司青霉素-链霉素双抗(10000U)SC30010,Lot#J130071 美国Hyclone公司小鼠抗a-SMA单克隆抗体美国Santa Cruz公司小鼠两步法免疫组化试剂盒KIT9902,Lot#1301319902 福州迈新生物技术开发有限公司浓缩型DAB试剂盒DAB0031,Lot#1307290031 福州迈新生物技术开发有限公司FITC标记山羊抗小鼠二抗北京中衫金桥有限公司油红O染色试剂盒D027 南京建成生物工程有限公司苏木素染液福州迈新生物技术开发有限公司油酸西安化学试剂厂2.实验方法2.1试剂配制及抗体稀释10%血清完全培养基:10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中,添加1ml的青-链霉素双抗溶液。
0.2mM的油酸完全培养基:1ml的20mM的油酸加入99ml的完全培养基中。
a-SMA抗体工作液:a-SMA一抗(200μg/ml)取20μl加入到980μl的PBS中。
FITC标记的山羊抗小鼠二抗工作液:FITC标记的山羊抗小鼠二抗(200μg/ml)取20μl 加入到980μl的PBS中。
20%DMSO细胞冻存液:2ml的DMSO溶液加入8ml的完全培养基中。
油红O染液:油红O储存液与双蒸水以3:2的比例混合,并用滤纸进行过滤,使用前2h内配制。
2.2 HSC-T6细胞培养基本操作方法细胞传代:观察培养瓶(25cm2)中细胞贴壁融合达90%时,即可进行细胞的传代,操作步骤如下。
开启生物安全柜紫外消毒30min,以75%乙醇擦拭台面灭菌,并预先准备3个细胞培养瓶(25cm2)、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培养基,取出长满细胞的培养瓶,倒空瓶中的培养基,加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍,倒空PBS 缓冲液,每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液,使胰酶溶液平铺在细胞层面上,缓缓摇动细胞培养瓶,待细胞70%脱落时加入1ml的完全培养基终止胰酶的消化作用,并用吸头反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来,转移液体至15ml的离心管中,1800r/min离心5min,小心吸弃离心管中的液体,并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞,倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中,37℃,饱和湿度,5%CO2细胞培养箱中培养,6h后持续观察细胞贴壁状态,待细胞达到50%~70%贴壁融合时倒空瓶中培养基,重新加入5ml的含0.2mM油酸的完全培养基,继续培养。
细胞冻存:消化、离心、重悬步骤同细胞传代,取1ml的细胞重悬液,加入1ml的20%DMSO 的细胞冻存液颠倒混匀,并移至2ml的冻存管中,冻存管中细胞经4℃(20min)、-20℃(20min)的程序降温后,转移至液氮中冻存。
细胞复苏:从液氮中取出冻存的细胞,立刻置于37℃水浴中快速晃动冻存管使细胞快速解冻,倒置显微镜下观察细胞密度并接种到培养瓶中,37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。
2.3 HSC-T6细胞a-SMA免疫组化染色细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中,待细胞达到50%贴壁融合时,进行a-SMA免疫组化实验,步骤如下:2.3.1 细胞固定:培养皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和甲醇,置于-20℃进行细胞固定,20min 后弃固定液,用PBS反复漂洗3遍,每次5min。
2.3.2细胞通透化:培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液,室温放置20min后弃去通透液,PBS反复漂洗3遍,每次5min。
2.3.3封闭用免疫组化笔在培养皿中划圈,并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min,然后取出PBS漂洗3次,每次5min。
2.3.4一抗孵育培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50μL,4℃孵育过夜,经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次,每次5min。
2.3.5二抗孵育培养皿中滴加Elivision试剂盒中的增强剂1滴(大约50μL),并于室温孵育20min,PBS漂洗3次,每次3min,然后每张组织切片滴加Elivision试剂盒中的二抗1滴(大约50μL),37℃孵育30min,PBS漂洗3次,每次3min。
2.3.6 DAB显色培养皿中滴加新鲜配制的DAB溶液50μL,室温孵育10min,显微镜下观察有细胞中有明显的棕黄色颗粒状沉淀时,立刻将组织切片放入自来水中漂洗以终止反应。
2.3.7苏木素复染苏木素复染3min,自来水冲洗使培养皿中的细胞核返蓝。
2.3.8封片培养皿中滴加甘油,并以盖玻片封片。
2.3.9观察拍片在正置光学显微镜下观察HSC-T6细胞胞浆中alpha平滑肌激动蛋白染色,并于40倍、100倍、200倍下拍照。
2.4 HSC-T6细胞a-SMA细胞免疫荧光细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中,待细胞达到50%贴壁融合时,进行a-SMA细胞免疫荧光实验,步骤如下:2.4.1 细胞固定:培养皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和异丙醇,置于-20℃进行细胞固定,20min后弃固定液,用PBS反复漂洗3遍,每次5min。
2.4.2细胞通透化:培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液,室温放置20min后弃去通透液,PBS反复漂洗3遍,每次5min。
2.4.3封闭用免疫组化笔在培养皿中划圈,并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min,然后取出PBS漂洗3次,每次5min。
2.4.4一抗孵育培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50μL,4℃孵育过夜,经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次,每次5min。
2.4.5二抗孵育培养皿中滴加50μL稀释后的FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗,37℃孵育1h,PBS漂洗3次,每次5min。
2.4.6观察拍片设置荧光倒置显微镜激发波长为488nm,观察细胞alpha-平滑肌肌动蛋白荧光显色,并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。
2.5 HSC-T6细胞油红O染色细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中,并以含0.2mM油酸的完全培养基进行干预,使细胞富集脂肪滴,细胞待细胞达到50%贴壁融合时,进行油红O染色实验,步骤如下:2.5.1 细胞固定:培养皿中加入4%多聚甲醛溶液,室温固定30min,弃固定液,用PBS反复漂洗3遍,每次5min。