e10-1天冬氨酸蛋白酶与金属蛋白酶

e10-1 天冬氨酸蛋白酶与金属蛋白酶

天冬氨酸蛋白酶的催化机制一般可分为以下几步：

1. 水和多肽底物进入两重对称的活性中心。

2.两个Asp残基的羧基具有不同的pKa。pKa高的Asp残基（Asp32）上的羧基作为广义碱从水分子中抽取一个质子，随之产生的OH-亲核进攻肽键上的羰基碳，形成氧负离子。氧负离子再转而亲核进攻活性中心pKa低的Asp215残基上的羧基，从中夺取质子，于是pKa 低的Asp残基充当广义酸，为氧负离子提供质子，形成四面体状中间物。

3. Asp32和Asp215相互之间进行酸碱反应，质子从Asp32传到Asp215。

4. Asp32和Asp215的酸碱催化导致四面体中间物的拆分，产物得以释放。最后Asp32和Asp215再次进行质子交换，从而使得它们各自回到催化前的状态。

属于金属蛋白酶的有：嗜热菌蛋白酶（thermolysin）、羧肽酶A（carboxypeptidsase A，CPA）和B，这里以CPA为例简要说明它们的催化机理。

CPA 主要催化肽链C-端为芳香族氨基酸或侧链较大的脂肪族氨基酸残基的水解。它属于使用Zn2+进行催化的水解酶家族的一员，属于这一家族的水解酶还有血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme）、胶原酶（collagenase）和某些细胞外基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）。

图e10-1(1) 羧肽酶A疏水口袋与底物的结合以及作为广义碱催化的Glu270

CPA的特异性由其活性中心的形状和化学性质决定，多肽底物结合在疏水口袋之中。疏水口袋特别适合容纳C-端为芳香族或较大的脂肪酸氨基酸的侧链。参与对多肽底物C-端氨基酸残基选择的有Asn144、Arg145和Tyr248，它们与末端羧基以氢键结合[图e10-1(1)]。CPA的两个催化基团一个是Glu270，另一个Zn2+，它们直接参与水解反应。Glu270 作为一个广义碱，激活作为弱亲核进攻试剂的水分子，或者自己作为亲核基团直接进攻肽键上的羰基碳；Zn2+与CPA分子上的三个氨基酸残基——His69、His196和Glu72配位结合，如果没有底物，则还有一个水分子会与Zn2+配位结合，这个水分子很可能就是参与水解的。如果有底物，Zn2+就与底物C-端肽键上的羰基氧结合，产生临近和稳定效应。

关于两个催化基团催化的确切机制还有争议[图e10-1(2)]，一种观点认为（机制A），Glu270直接作为亲核催化剂，进攻肽键的羰基碳，导致羧酸酐中间物的形成，而Zn2+是作为亲电催化剂将底物水分子“抓”到中间物旁边；另一种观点认为（机制B），Glu270和Zn2+分别作为广义碱和Lewis酸进行催化。

图e10-1(2) 羧肽酶A的两种催化机制