MMFSCNJ出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法
蜡样芽孢杆菌 食品法规
蜡样芽孢杆菌食品法规
蜡样芽孢杆菌是一种常见的细菌，主要存在于土壤、水、气等环境中，也可存在于一些食品中。
由于蜡样芽孢杆菌能产生耐热毒素，故在食品安全监管中备受关注。
目前，国内外对蜡样芽孢杆菌的食品法规主要有以下几点规定： 1.微生物指标：蜡样芽孢杆菌属于食品中的指标菌之一，其在食品中的数量应符合国家标准规定。
例如《食品安全国家标准食品安全微生物指标》中规定，各类食品中蜡样芽孢杆菌的限量标准均不得超过10CFU/g或CFU/mL。
2.食品安全标准：蜡样芽孢杆菌能够产生耐热毒素，因此在某些食品中的含量应该特别关注。
例如，我国《食品安全国家标准食品中耐热性毒素限量》中规定，蜜饯制品中耐热性毒素的限量标准应不得超过10μg/kg。
3.食品生产卫生管理：为了确保食品的安全，食品生产企业应加强生产卫生管理，控制蜡样芽孢杆菌的污染。
例如，我国《食品安全法》中规定，食品生产企业应具备相应的生产设施、设备和卫生条件，并实行食品安全管理制度，确保食品生产符合卫生标准。
总之，蜡样芽孢杆菌在食品安全监管中备受关注，各国都采取了相应的法规措施来确保食品的安全。
企业应加强生产卫生管理，确保食品的安全和健康。
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欧盟蜡样芽孢杆菌标准
欧盟蜡样芽孢杆菌标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：欧盟蜡样芽孢杆菌标准是指欧洲联盟制定的关于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的质量要求和检测方法的标准。
蜡样芽孢杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中的土壤、水源、植物等环境中。
它是一种潜在的食品污染源，能够在一定条件下产生产生毒素，引起食物中毒。
欧盟制定了一系列的标准，旨在控制和监测蜡样芽孢杆菌在食品中的含量，保障食品安全。
欧盟蜡样芽孢杆菌标准主要包括以下几个方面：1. 质量要求：欧盟规定了食品中蜡样芽孢杆菌的最大容许限量。
不同类型的食品具有不同的容许限量，其中以婴幼儿食品和食品中成分含水量高的产品要求最为严格。
这些限量的设定旨在保证人们在食用食品时不会遭受蜡样芽孢杆菌毒素的危害。
2. 检测方法：欧盟规定了蜡样芽孢杆菌的检测方法，包括取样方法、预处理方法、培养方法、毒素检测方法等。
这些方法一般由专业实验室进行操作，确保检测结果的准确性和可靠性。
3. 风险评估：欧盟对食品中蜡样芽孢杆菌的风险进行评估，分析潜在的风险因素和传播途径。
通过风险评估，可以及时采取控制措施，降低食品中蜡样芽孢杆菌的污染风险。
4. 风险管理：欧盟制定了一系列的风险管理措施，包括食品加工中的卫生规范、食品贮存和运输中的控制措施等。
这些措施旨在预防和控制蜡样芽孢杆菌在食品中的传播和繁殖。
欧盟蜡样芽孢杆菌标准的制定和执行，旨在保障食品安全，减少食品中蜡样芽孢杆菌的污染，降低人们因食用受污染食品而引发的食物中毒风险。
对于食品生产企业和相关部门而言，严格执行欧盟蜡样芽孢杆菌标准是确保产品质量和消费者健康的重要措施。
希望通过这些标准的制定和实施，可以有效地保障欧盟市场上食品的安全性，提高消费者对食品的信任度和满意度。
第二篇示例：欧盟蜡样芽孢杆菌标准（European Union Bacillus cereus Standard）是欧洲联盟为保障食品安全所制定的一项重要规范。
蜡样芽孢杆菌检测国标
蜡样芽孢杆菌检测国标蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病微生物，它会引起食物中毒的发生。
针对蜡样芽孢杆菌的检测方法，我国制定了相关国家标准，本文将从以下三个方面进行介绍。
一、蜡样芽孢杆菌简介
蜡样芽孢杆菌又称为蜡样芽孢菌（Bacillus cereus），是一种革兰氏阳性菌。
其孢子分布广泛，可以在空气、土壤、水、食品等各种环境中存活，甚至在高温加工食品中也可以存活。
蜡样芽孢杆菌是一种致病微生物，能够引起急性食物中毒，这是因为它产生的毒素能够影响肠胃道，引起呕吐、腹泻等症状。
二、蜡样芽孢杆菌检测国标
为了保障人们的食品安全，我国对食品中的蜡样芽孢杆菌进行了规范化的检测方法，主要是通过标准的培养及鉴定步骤进行。
1.样品采集：首先需要确定样品的种类，其次选择适当的采集方法，例如在市场上购买的食品需要在废弃部位进行采集，以保障采样的准确性。
2.样品处理：将采集到的食品样品进行前处理，包括样品的清洁去除外部污染等步骤。
3.菌液制备：将采样到的食品样品用合适的培养基进行培养，培养出的菌落进行鉴定，得到蜡样芽孢杆菌后进行菌液制备。
4.检测方法：采用PCR法、生物分子方法、蛋白质检测法等方式对菌液进行检测，以确认菌液中是否有蜡样芽孢杆菌存在。
5.结果判定：判定样品中是否存在蜡样芽孢杆菌，并进行定性和定量分析。
三、总结
蜡样芽孢杆菌检测国标对食品安全有着重要的意义，它通过科学、规范的检测方法保障了人们的食品安全。
在实际操作中，应加强样品采集及前处理，保证样品的准确性。
同时，为了提高检测的灵敏度和准确性，应选择合适的检测方法。
最后，需要将检测结果进行有效记录，以便后续参考。
蜡样芽胞杆菌检验
生化鉴定
挑取纯培养的单个菌落，进行 酪蛋白分解试验（+）、动力试验 （大多+）、V-P试验（+）、硝酸盐 还原试验（+）、糖发酵试验（+）、 溶菌酶耐性试验（+）。
根状生长试验
挑取单个可疑菌落平行划线接种于 营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h 蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征 蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛 玻璃状或融蜡状的菌落
蜡样芽胞杆菌检验 标准操作程序
国巢湖国巢
背景
革兰氏阳性芽胞杆菌 在自然界广泛存在 可引起食物中毒等食源性疾病
背景
国际上，早在1906年就有由该菌引起的病例报道，目前全世界 每年都有相当数量的病例发生
在国内，首次报告是1973年南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕 吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖 市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位
溶血试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB琼脂（胰酪胨大豆羊血琼脂） 平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。
溶血试验
蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色 毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环 苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血 现象 多数炭疽芽胞杆菌为不溶血 巨大芽胞杆菌为不溶血
使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃ ～ 50℃的培养 箱里干燥，直到平板表面的水珠消失
30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h 同一稀释度3个平板所有菌落数合计 在15CFU～150CFU典型或可疑蜡样芽 胞杆菌菌落的平板，进行计数
从典型菌落中至少挑取5个（小于5 个全选），划线接种于营养琼脂平 板， 30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h， 进行确证实验
蜡样芽孢杆菌的检测
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实验步骤
2：样品稀释及计数：
1mL
1mL
1mL 1mL
1mL
10-1
肠
毒
素 耐 热
呕吐型 污染食品：米饭 我国多见
不 耐 热
腹泻型 污染食品：蛋白 型食品及果汁 欧美等国多见
污染途径： 泥土和灰尘 昆虫 不洁用具 不卫生的食品从业
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人员
5
实验目的
1、掌握蜡样芽孢杆菌检验的主要步骤与方法。
2、了解蜡样芽孢杆菌菌落特点和掌握生化反 应结果的判断方法。
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检验程序
检样 50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液
10-1~10-6稀释液
选择性培养基 MYP 30°C , 24h
形态观察 菌数测定
证实试验
营养琼脂 30°C , 24h
革兰染色 生长及菌落观察 鉴别试验 生化反应 肠毒素测定
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报告
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实验步骤
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产生溶血素：使胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB） 中的血细胞发生β溶血。
产生明胶酶：将明胶水解为多肽再水解为氨 基酸而使其由半固体转化为液态状。
触酶实验: 产生过氧化氢酶分解过氧化氢生成 水和氧气。
动力和硝酸盐试验: 蜡样芽胞杆菌运动活泼,能 还原硝酸盐为亚硝酸盐。
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实验材料
•甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板 •营养琼脂培养基 •L-酪氨酸营养琼脂培养基 •胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB) •动力-硝酸盐生化鉴定管 •木糖-明胶生化鉴定管 •硝酸盐试剂(1%对氨基苯磺酸溶液, 0.2% α-萘胺溶 液) •3%的双氧水 •革兰染液
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。
在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。
污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。
该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。
当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。
特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。
在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。
溶血。
不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。
实验安排一、稀释菌悬液的制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。
（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。
三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。
五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。
取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。
一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。
食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验
修订原则
• （2）保持与原标准的连续性。与现有国家标 准协调统一，鉴于我国已有相关的检测方法标 准，在内容设计时多参考了目前现行的标准条 款，如样品前处理步骤与沙门菌、大肠菌群检 测方法尽量相同，在常规生化、生化分型方面 尽量沿用原标准中的方法。这样既便于试验和 操作，又节省了检测成本。
新标准与GB/T 4789.14－2003相比主要修改如下
重新修订的意义
（1）提高蜡样芽胞杆菌检出率 • 蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为30～32℃。 • 经标准修订协作组验证：蜡样芽胞杆菌在MYP培养基的 培养条件以30 ℃±1 ℃ 培养48h的生长率最高，平均生长 率达到了93.69%。其次为30 ℃±1℃ 培养24 h，平均生长 率为92.28%。生长率最低的培养条件为36 ℃±1 ℃ 培养2 4 h。平均生长率为82.32%。经统计学分析，30 ℃±1 ℃ 培养温度的生长率显著高于36 ℃±1 ℃(P﹤0.05），但在 培养温度相同的情况下，培育时间24h和48h蜡样芽胞杆菌 生长率无显著差异（P﹥0.05）。
64 45 50 64 71 50 25 52.71
74.42 112.50 74.63 91.43 120.34 54.95 73.53 82.54
（2）扩大检测范围
１. 增加食品中蜡样芽胞杆菌定性检测方法。 5家标准修订协作组，按新修订的《食品卫生微生物 学检验 蜡样芽胞杆菌检验》方法进行蜡样芽胞杆菌定 性试验结果，生肉样品的平均最低检出限为5.56 cf u/g，熟肉样品的平均最低检出限为1.94 cfu/g，米 饭样品的平均最低检出限为1.03 cfu/g，3种样品蜡 样芽胞杆菌定性试验的平均最低检出限为2.84 cfu/g
5.4 定量检测
• 5.4.1 样品的稀释 • 吸取1：10的样品匀液1 mL加到装有9 mL PBS的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品 匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操 作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每 递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
MM_FS_CNJ_0158 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法
出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法.适用范围本方法适用于出口食品地检验..培养基和仪器.培养基甘露醇卵黄多粘菌素琼脂()；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂；酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改良培养基；动力培养基；胰酪胨大豆羊血琼脂()；氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂；试剂；碱性复红染色液..仪器吸管：容量和，具刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；涡动搅拌器；形玻璃棒；恒温培养箱：℃及±℃..样品地保存和送检待检样品应保持在℃以下运送并尽可能不使其冷冻.送达实验室后，应保存于℃并尽快进行检验.如在内不能进行检验，应将样品储存在－℃，检验前再于室温下解冻.脱水食品可在常温下送检和储存..样品地制备.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎.称取放于无菌均质杯中..加无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以～均质.制成∶样品稀释液..取∶稀释液加到含有无菌磷酸盐缓冲液地稀释瓶中，充分混匀制成∶地稀释液. .每个稀释度换用支灭菌吸管，按上述操作程序进行倍递增稀释直至－..检验步骤.平板计数法取各稀释液接种到琼脂平板上.用灭菌形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面.每稀释度接种两个琼脂平板.将平板置于℃培养.选取具有～个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落地平板，进行计数.并计算同一稀释度两个平板地平均菌落数.蜡样芽孢杆菌在琼脂平板上生成地菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环.如反应不典型，可继续培养再计数.计数后，从每个平板至少选取个已计数地菌落分别接种于营养琼脂斜面，于℃培养，按第章进行证实试验.根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌地菌落数，按比例计算出该皿内地蜡样芽孢杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告.例：将检样－稀释液涂布于琼脂平板上，生成地可疑菌落数为个，取个进行鉴定，证实为蜡样芽孢杆菌地是个，则样品中蜡样芽孢杆菌数为(×)××＝×..最近似值()法适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于个地食品.选用三管法系列.取－、－、－三种稀释液，每种稀释液接种管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种.置于℃培养±.从长菌地试管取培养物划线接种到琼脂平板上.置℃培养～.从琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环地单个菌落，接种营养琼脂斜面，置℃培养，供作证实试验.根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌地管数，由表〔附录(补充件)〕计算蜡样芽孢杆菌地值，并作出报告..证实试验.形态观察取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检.蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大..生化学性状葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下℃培养.培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸).硝酸盐还原试验：接种于硝酸盐肉汤中，℃培养.加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色).试验：接种于改良培养基中，℃培养.加试剂及肌酸数粒，静止，应为阳性反应(伊红色).酪氨酸分解试验：接种于酪氨酸琼脂培养基上，℃培养，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶).阴性时应继续培养再观察.溶菌酶试验：用直径接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，℃培养.该菌在本培养基(含地溶菌酶)中能生长.如出现阴性反应，应继续培养.卵磷脂酶试验：接种于琼脂平板上，℃培养.阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵磷脂酶)..蜡样芽孢杆菌与类似菌地鉴别试验动力试验：用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，℃培养.有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长，形成所谓地蜂巢状扩散.也可用悬滴法检查.蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽杆菌则不运动.根状生长试验：用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上，℃培养～.蜡样芽孢杆菌群地多数菌株形成粗糙地似毛玻璃状或融蜡状地菌落.其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长地特征.溶血试验：取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，～℃培养.蜡样芽孢杆菌落周围呈现β型完全溶血地溶血环.苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱地溶血现象，而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血.蛋白质结晶毒素试验：取经℃培养并于室温放置～地营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜.经自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分钟后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满碱性复红液，放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续，移去火焰，使载片放置再倾去染液.用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检.观察有无游离芽孢和染成黑色地菱形毒素结晶体.如发现游离芽孢形成地不丰富，应将培养物置室温～再行检查.苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌群地其他菌种则为阴性.结果解释及报告：符合蜡样芽孢杆菌群地特征，有活泼地动力，很强地溶血能力，不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素，可报告为蜡样芽孢杆菌.对偶尔遇到地一些少数可疑菌株，可以根据需要进行其他试验.如青霉素酶、噬菌体试验等..来源：—。
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、引言蜡样芽孢杆菌是一种常见的微生物，其活菌数含量的测定对于粮食、食品和医药行业具有重要意义。
本文档旨在提供一份蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程，以确保测定结果准确可靠。
二、仪器与试剂- 无菌培养基- 自动培养箱- 显微镜- 十倍镜- 干燥烘箱- 无菌分注器- 离心机- 紫外灯三、操作步骤1. 准备工作- 清洗并消毒所有使用过的实验器材。
- 配制无菌培养基，确保培养基的质量符合要求。
2. 样品处理- 将待测样品加入适量的无菌水中，并通过搅拌均匀。
- 取适量的处理后的样品，通过无菌分注器加入无菌培养基中。
3. 培养- 将含有待测样品的无菌培养基均匀涂布于一片无菌培养基平板上。
- 将平板放入自动培养箱中，设置适当的温度和培养时间进行培养。
4. 菌落计数- 取出培养完毕的平板，使用显微镜和十倍镜对菌落进行观察和计数。
- 记录菌落数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的菌落形成单位（CFU）。
5. 活菌数计算- 将菌落计数结果乘以相应的稀释倍数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的活菌数含量。
6. 结果确认- 将结果与标准值进行比较，确保测定结果准确可靠。
四、风险提示- 操作过程需保持无菌操作，避免污染。
- 使用紫外灯时需注意安全，避免直接照射眼睛和皮肤。
五、总结蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程是确保测定结果准确可靠的重要工作。
按照本文档的要求进行操作，能够有效地保证测定的准确性，并为粮食、食品和医药行业的安全生产提供科学依据。
食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析
食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析杨广锐【摘要】蜡样芽孢杆菌分布广泛，是常见的食品污染菌和条件致病菌，通过产生呕吐毒素和腹泻毒素导致食物中毒。
对常规检测方法、酶反应检测方法、PCR技术和免疫学技术检测方法进行归类分析，总结各种检测方法的优点和局限性。
【期刊名称】《食品安全导刊》【年(卷),期】2014(000)026【总页数】3页(P63-65)【关键词】蜡样芽孢杆菌;检测;局限性【作者】杨广锐【作者单位】石河子大学食品学院【正文语种】中文蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是芽孢杆菌属（Bacillus）中的一种革兰氏阳性杆菌，菌体大小为（1.0μm~1.2μm）×（3μm~5μm），杆状菌体有成链的趋势，芽孢呈椭圆形，中生，孢子囊不明显膨胀。
蜡样芽孢杆菌能够发酵葡萄糖产酸，不发酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇，可将硝酸盐还原，过氧化氢酶试验阳性，能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶。
最高生长温度35℃~45℃，最低生长温度10℃~20℃，能够在7% NaCl中生长，生长在葡萄糖洋菜上的细胞含有复红不着色的小球，不产生细胞内蛋白晶体[1]。
目前，国内外对于蜡样芽孢杆菌的检测方法，主要有常规检测方法、酶反应检测方法、PCR技术和免疫学技术检测方法等。
常规的检测方法一般分为平板计数法和MPN计数法，检测步骤都包括分离培养、纯化培养、证实试验等过程。
在证实试验中，有革兰氏染色、葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、改良V-P试验、L-酪氨酸分解试验、溶菌酶试验、动力试验、溶血试验、蛋白毒素结晶试验等[6-7]。
常规检测方法的优点是技术成熟、容易操作，国家标准和行业标准中的检验方法都是微生物实验室中常见的基础操作，具有一般微生物检测基础的人员都可以完成检测。
同时，常规检测方法也存在以下缺点：①常规检测方法中使用的甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）培养基，在配置时需要使用鸡蛋制作50%卵黄液加入基础培养基中，以无菌操作取出卵黄的过程比较麻烦，且容易污染影响检验结果[7]。
MMFSCNJ出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法
MM_FS_CNJ_0341出口食品产气荚膜梭状芽孢杆菌平板计数法MM_FS_CNJ_0341出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法1.适用范围本方法适用于出口食品的检验。
2.主要试剂和仪器2.1.主要试剂（包括培养基）胰月示.－亚硫酸盐－环丝氨酸（TSC）琼脂；D－环丝氨酸溶液；卵黄乳液；缓冲动力－硝酸盐培养基；乳糖－明胶培养基；产芽孢肉汤；多价蛋白胨－酵母膏（PY）培养基；硫乙醇酸盐液体培养基；蛋白胨水；亚硝酸盐试剂；缓冲甘油－氯化钠溶液。
2.2.仪器吸管1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；超低温冰箱；恒温培养箱：36±1℃；恒温水浴箱：46±1℃；培养皿：90或100mm；显微镜。
3.过程简述3.1.样品制备3.1.1.样品的贮存和运送如不能立即进行检验时，应在样品中加等量缓冲甘油－氯化钠溶液（液体食品应加双料的）。
将样品作低温保存，直到检验，运送样品时，应使样品保持冷冻状态，并要避免容器破损。
3.1.2.制样将样品解冻，取25g移入灭菌均质杯，加225mL蛋白胨水，以13000r／min 均质2min，如为液体样品，则取样25mL，加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，摇匀，吸取此1∶10样品匀液10mL加于90mL蛋白胨水中，摇匀，制成1∶100样品稀释液，必要时，按此法将样品作进一步的倍递增稀释，如从10－3～10－4……。
3.2.检验3.2.1.平板计数法倾注不含卵黄的TSC琼脂到10个灭菌平皿中，每皿约5mL，并迅速旋转平皿，使琼脂铺平。
当琼脂凝固后，将每个平皿编号标记，以无菌操作，吸取稀释液样品1mL分别加到每个琼脂平板表面中心。
再向平皿中倾注不含卵黄的TSC 琼脂15mL，缓慢地旋转平皿，使其与接种物混合均匀。
也可用灭菌L形玻璃棒，将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于含卵黄乳液的TSC琼脂上，将平板水平静置5～10min，使接种物被吸收。
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MM_FS_CNJ_0158出口食品蜡样芽孢杆菌微生物法
MM_FS_CNJ_0158
出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法
1.适用范围
本方法适用于出口食品的检验。
2.培养基和仪器
2.1.培养基
甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)；
胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；
酚红葡萄糖肉汤；
硝酸盐肉汤；
营养琼脂；
l-酪氨酸营养琼脂；
溶菌酶营养肉汤；
改良V-P培养基；
动力培养基；
胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)；
Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液；
亚硝酸盐试剂；
V-P试剂；
碱性复红染色液。
2.2.仪器
吸管：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；
菌落计数器；
均质器；
厌氧培养装置；
涡动搅拌器；
L形玻璃棒；
恒温培养箱：30℃及36±1℃。
3.样品的保存和送检
待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。
送达实验室后，应保存于4 ℃并尽快进行检验。
如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。
脱水食品可在常温下送检和储存。
4.样品的制备
4.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。
称取50g放于无菌均质杯中。
4.2.加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r/min均质2min。
制成1∶10样品稀释液。
4.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。
4.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10－6。
5.检验步骤
5.1.平板计数法
取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。
用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。
每稀释度接种两个MYP琼脂平板。
将平板置于30℃培养24h。
选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。
并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。
蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。
如反应不典型，可继续培养24h再计数。
计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30℃培养24h，按第6章进行证实试验。
根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。
例：将检样10－4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽孢杆菌的是4个，则1g 样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×104×10＝2×106。
5.2.最近似值(MPN)法
适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个/g的食品。
选用三管法MPN系列。
取10－1、10－2、10－3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL。
置于30℃培养48±2h。
从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。
置30℃培养24～48h。
从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30℃培养24h，供作证实试验。
根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表〔附录C(补充件)〕计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g，并作出报告。
6.证实试验
6.1.形态观察
取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检。
蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。
6.2.生化学性状
葡萄糖发酵试验：
接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35 ℃培养24h。
培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。
硝酸盐还原试验：
接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养24h。
加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。
V-P试验：
接种于改良V-P培养基中，35℃培养48h。
加V-P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应(伊红色)。
L-酪氨酸分解试验：
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35 ℃培养48h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。
阴性时应继续培养72h再观察。
溶菌酶试验：
用直径2mm接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，35 ℃培养24h。
该菌在本培养基(含0.001%的溶菌酶)中能生长。
如出现阴性反应，应继续培养24h。
卵磷脂酶试验：
接种于MYP琼脂平板上，35 ℃培养24h。
阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵磷脂酶)。
6.3.蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验
动力试验：
用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30 ℃培养24h。
有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长，形成所谓的蜂巢状扩散。
也可用悬滴法检查。
蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽杆菌则不运动。
根状生长试验：
用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上，30℃培养18～24h。
蜡样芽孢杆菌群的多数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。
其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长的特征。
溶血试验：
取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，30～32 ℃培养24h。
蜡样芽孢杆菌落周围呈现β型完全溶血的溶血环。
苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象，而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。
蛋白质结晶毒素试验：
取经30 ℃培养24h并于室温放置2～3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。
经自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分钟后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满0.5%碱性复红液，放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续1.5min，移去火焰，使载片放置0.5min再倾去染液。
用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。
观察有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。
如发现游离芽孢形成的不丰富，应将培养物置室温2～3d再行检查。
苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌群的其他菌种则为阴性。
结果解释及报告：
符合蜡样芽孢杆菌群的特征，有活泼的动力，很强的溶血能力，不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素，可报告为蜡样芽孢杆菌。
对偶尔遇到的一些少数可疑菌株，可以根据需要进行其他试验。
如青霉素酶、噬菌体试验等。
7.来源：
SN 0176—92。