实验三、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验

4．证实试验
（1）形态观察
本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圆形， 不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操 作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗
（2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧 化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖； 能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵
葡萄糖。
A、 MYP平板实验
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 mL，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液
做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL，接种在两个选择培养基
（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢
还原） 不变为阳性（亚硝酸盐
已分解成氨和氮气）
D、木糖-明胶（Gelatin）液化试验
结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
E、L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明 区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培 养72 h再观察。
（1）蜡状芽胞杆菌在甘露醇
卵黄多粘菌素琼脂(MYP)
上的菌落为粉红色(表示不发 酵甘露醇)，周围有粉红色的 晕（表示产生卵磷脂酶）。
B、血平板实验
在血液琼脂平板上形成浅灰 色、不透明、似毛玻璃状的
菌落。菌落周围初呈草绿色
溶血,时间稍长即完全透明。
C、动力-硝酸盐还原实验
呈现红色，为阳性，记+ 无红色出现，为阴性，记若无颜色变化，须加入少量锌 粉 变红者为阴性（硝酸盐未被
耐热性肠毒素：100℃30分钟不能被破坏，为引起呕吐 型中毒的致病因素,常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种 食物中形成。
蜡样芽胞杆菌生物学性状
1、形态和染色特性
该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽
胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列,
无荚膜，有周生鞭毛。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
流行病学特点
1、季节性特点： 以夏、秋季，尤其是6～10月为多见。 2、食品种类 －剩饭，特别是大米饭。 －乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、 豆芽、甜点心、调味汁、色拉。 国内：与淀粉质食品相关多。
致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌 外，肠毒素也是重要的致病因素。
实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验
一、实验目的
1．学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。
2．了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特
性和生化特性。
二、实验原理
蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性 杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可 能有此菌存在，易从各种食品中检出。 蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、蔗糖和水杨苷，不 发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖和山梨醇，卵 磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血， 能在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下 能发酵葡萄糖。
（4）L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培
养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培
养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白
酶）。阴性时应继续培养72 h再观察。 （5）溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液
一环,接种于溶菌酶肉汤中，35℃培养24h。 该菌在本培养基（含0.001％的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
5.与类似菌鉴别
本菌与其他类似菌的鉴别见表2。
特性 巨大 芽孢杆菌 蜡样 芽孢杆菌 ＋ ＋/ － ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋
产生 肠毒素
苏云金 蕈状 芽孢杆菌 芽孢杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋
灰疽 芽孢杆菌 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋
2、培养特性
（1）需氧菌，生长温度范围在10-45℃之间。最适
生长温度为28-35℃。
（2）在普通培养基上生长良好。
本菌在普通琼脂平板上，生长
的菌落呈乳白色，不透明，直
径4-6mm,边缘不整齐，表面粗 糙，呈毛玻璃状或白蜡状。
（3）在血液琼脂平板上形成浅
灰色、不透明、似毛玻璃状的
菌落。菌落周围初呈草绿色溶
（三）实验方法与步骤
检样 25g(ml)+225ml生理盐水
1.蜡样芽孢杆菌检验程序：
做成10-1-10-5的稀释液 37℃，18h-24h 选择性培养基（菌数测定） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 菌数计算 生长及菌落观察
中华人民共和国国家 标准食品卫生微生物 学检验蜡样芽孢杆菌 检验GB/T 4789.282003
杆菌在此培养基上的菌落为粉红色（表示不发酵甘露醇）周围有粉红
色的晕（表示产生卵磷脂酶）。 计数后，从中挑取5个这样的菌落作证 实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内
的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数源自得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。
3．分离培养
将检样或其稀释液划线于上述选择性培 养基平板上，置37℃培养12～20h，挑取 可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营 养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试 验。
血,时间稍长即完全透明。 （4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇 卵黄多粘菌素琼脂(MYP) 上的菌落为粉红色(表示不发
酵甘露醇)，周围有粉红色的
晕（表示产生卵磷脂酶）。
（5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常 常有菌膜或壁环，振摇易乳化。
3、生化性状
（1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中， 厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变 为黄色。 （表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸） （2）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。 （3） V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35℃ 培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止 1h，应为阳性反应（伊红色）。
四、实验结果
根据以上实验作出检验报告。
对动物和 人致病
－/＋．
过氧化氢酶 ＋ 动力 ＋/ － 硝酸盐还原 － 酪蛋白分解 ＋/－ 卵黄反应 － 葡萄糖利用（厌氧）－ 甘露醇 ＋ 木糖 ＋/－ 溶血 － 已知致病性
对昆虫致病的 假根 内毒素结晶 样生长
注：＋．90%~100%的菌株阳性 大多数菌株阴性
－．90%~100%菌株阴性 ＋/－.大多数菌株阳性