实验三、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。
在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。
污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。
该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。
当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。
特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。
在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。
溶血。
不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。
实验安排一、稀释菌悬液的制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。
（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。
三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。
五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。
取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。
一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、引言蜡样芽孢杆菌是一种常见的微生物，其活菌数含量的测定对于粮食、食品和医药行业具有重要意义。
本文档旨在提供一份蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程，以确保测定结果准确可靠。
二、仪器与试剂- 无菌培养基- 自动培养箱- 显微镜- 十倍镜- 干燥烘箱- 无菌分注器- 离心机- 紫外灯三、操作步骤1. 准备工作- 清洗并消毒所有使用过的实验器材。
- 配制无菌培养基，确保培养基的质量符合要求。
2. 样品处理- 将待测样品加入适量的无菌水中，并通过搅拌均匀。
- 取适量的处理后的样品，通过无菌分注器加入无菌培养基中。
3. 培养- 将含有待测样品的无菌培养基均匀涂布于一片无菌培养基平板上。
- 将平板放入自动培养箱中，设置适当的温度和培养时间进行培养。
4. 菌落计数- 取出培养完毕的平板，使用显微镜和十倍镜对菌落进行观察和计数。
- 记录菌落数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的菌落形成单位（CFU）。
5. 活菌数计算- 将菌落计数结果乘以相应的稀释倍数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的活菌数含量。
6. 结果确认- 将结果与标准值进行比较，确保测定结果准确可靠。
四、风险提示- 操作过程需保持无菌操作，避免污染。
- 使用紫外灯时需注意安全，避免直接照射眼睛和皮肤。
五、总结蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程是确保测定结果准确可靠的重要工作。
按照本文档的要求进行操作，能够有效地保证测定的准确性，并为粮食、食品和医药行业的安全生产提供科学依据。
实验三、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验
一、实验目的
1．学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。
2．了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特
性和生化特性。
二、实验原理
蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性 杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可 能有此菌存在，易从各种食品中检出。 蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、蔗糖和水杨苷，不 发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖和山梨醇，卵 磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血， 能在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下 能发酵葡萄糖。
（三）实验方法与步骤
检样 25g(ml)+225ml生理盐水
1.蜡样芽孢杆菌检验程序：
做成10-1-10-5的稀释液 37℃，18h-24h 选择性培养基（菌数测定） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 菌数计算 生长及菌落观察
中华人民共和国国家 标准食品卫生微生物 学检验蜡样芽孢杆菌 检验GB/T 4789.282003
5.与类似菌鉴别
本菌与其他类似菌的鉴别见表2。
特性 巨大 芽孢杆菌 蜡样 芽孢杆菌 ＋ ＋/ － ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋
产生 肠毒素
苏云金 蕈状 芽孢杆菌 芽孢杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋
灰疽 芽孢杆菌 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋
还原） 不变为阳性（亚硝酸盐
已分解成氨和氮气）
D、木糖-明胶（Gelatin）液化试验
结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
E、L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明 区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培 养72 h再观察。
关于食品中蜡样芽胞杆菌污染情况的调查分析
关于食品中蜡样芽胞杆菌污染情况的调查分析摘要] 目的：了解鄂尔多斯市蜡样芽胞杆菌在市售食品中的污染情况。
方法：按照食品安全国家标准《食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》GB4789.14对样品进行检测。
结果：5种场所4类食品中85份样品共检出蜡样芽胞杆菌11份，检出率为12.9%。
4种场所中的5类食品中，奶吧污染严重，奶吧中巴氏杀菌乳的检出率均为30%，其次是超市，超市的婴幼儿配方奶粉的检出率为23.3%；最后是学生午餐，检出率为10%。
结论：蜡样芽胞杆菌的检测在预防食源性疾病方面具有重大意义，各部门应加强对食品安全方面的重视。
[关键词] 蜡样芽胞杆菌，食品微生物检验，食源性疾病Investigation on Food Contamination Caused by Bacillus Cereus??Shang Yibo( Ordos Center of Disease Control & Prevention of Inner Mongolia Autonomous Region ) 【Abstract】?Objective: To investigate the contamination of food in sale in Ordos caused by bacillus cereus. Methods: ?Samples were tested according to National Food Safety Standard Food Microbiology Testing ?Bacillus Cereus Testing GB/T4789.14 Results: 11 out of 85 samples in 5 places of 4 kinds of food were detected bacillus cereus. The detection rate was 12.9%. Among 5 kinds of food in 4 places, milk bar was heavily contaminated, the detection rate of pasteurized?milk was 30%; the next is supermarket, the detection rate of baby?formula in supermarket was 23.3%; the last was students’ lunch, the detection rate was 10%. Conclus ion: The testing of ?bacillus cereus has?great?significance in the prevention of ?food borne?diseases, all departments involved should strengthen the??emphasis on?food safety.【Key Words】:? bacillus cereus, food microbiology testing, food borne?diseases 蜡样芽孢杆菌（学名：Bacillus cereus），又称仙人掌杆菌，是一种地方性，土壤生活的，革兰氏阳性，β溶血性的杆状细菌，它会引起食物中毒，例如"炒饭综合征"（Fried Rice Syndrome）。
蜡样芽胞杆菌检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验1 范围本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）的检验方法。
本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数；第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a)冰箱：2 ℃～5 ℃；b)恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃；c)均质器；d)电子天平：感量0.1 g ；e)无菌锥形瓶：100 mL、500 mL；f)无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头；g)无菌平皿：直径90 mm；h)无菌试管：18 mm×180 mm；i)显微镜：10倍～100倍（油镜）；j)L涂布棒。
3 培养基和试剂3.1磷酸盐缓冲液（PBS）：见附录A中A.1。
3.2 甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂：见附录A中A.2。
3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤：见附录A中A.3。
3.4营养琼脂：见附录A中A.4。
3.5 过氧化氢溶液：见附录A中A.5。
3.6 动力培养基：见附录A中A.6。
3.7 硝酸盐肉汤：见附录A中A.7。
3.8 酪蛋白琼脂：见附录A中A.8。
3.9 硫酸锰营养琼脂培养基：见附录A中A.9。
3.100.5%碱性复红：见附录A中A.10。
3.11 动力培养基：见附录A中A.11。
3.12 糖发酵管：见附录A中A.12。
3.13 V-P培养基：见附录A中A.13。
3.14 胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂：见附录A中A.14。
3.15 溶菌酶营养肉汤：见附录A中A.15。
3.16西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.16。
3.17明胶培养基：见附录A中A.17。
4 蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）4.1检验程序蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序见图1。
图1 蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序4.2 操作步骤4.2.1 样品处理冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻，若不能及时检验，应放于-10 ℃ ~ -20 ℃保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2 ℃～5 ℃冰箱保存，24 h内检验。
蜡样芽孢杆菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病的效果及机理研究
蜡样芽孢杆菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病的效果及机理研究摘要：试验研究蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）cgmcc4348菌株对番茄灰霉病菌（botrytis cinerea）的生物防治效果，并初步探讨其抑菌机理，以寻找防治番茄灰霉病的新方法。
试验从定量生物测定、室内离体抑菌试验和盆栽试验3个方面考察其抑菌作用效果，并以硫酸铵分级沉淀法提取拮抗蛋白进行检测。
结果表明，室内抑菌试验的ec50为6.19 mg/l；盆栽试验中处理3对番茄灰霉病的平均防效达75.80%，与50 mg/l嘧霉胺处理的防效相当。
试验证明蜡样芽孢杆菌cgmcc4348对番茄灰霉病菌有较好防治效果。
关键词：蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）；番茄灰霉病菌（botrytis cinerea）；生物防治；cgmcc4348中图分类号：s436.3；s476.19 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）08-1817-04灰霉病可侵染200多种植物的花、果实及其他绿色组织[1，2]，导致组织腐烂，丧失利用价值。
近年来中国蔬菜灰霉病发生面积逐年增加，成为蔬菜生产的一大障碍[3]。
其中茄科蔬菜以番茄受害最重，一般发病田块番茄灰霉病造成的产量损失为20%～40%，重病田块达60%以上[4]。
长期以来生产上主要依靠化学农药防治灰霉病，病原菌对常用化学药剂极易产生抗药性，且长期依赖和大量使用化学农药会带来环境污染和食品安全等问题[5-7]。
多种真菌、细菌对灰霉病菌均有一定的抑制作用[8]，如木霉、粘帚霉、酵母菌、假单胞杆菌等，近年利用生防菌成为植物灰霉病防治的新策略。
作者在番茄病害生物防治研究中筛选到1株可有效抑制番茄灰霉病菌（灰葡萄孢菌，botrytis cinerea）的生防菌株，经鉴定为蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus），命名为cgmcc4348[9，10]。
本研究以室内抑菌试验与盆栽防效试验结合的方式来探讨该生防菌对灰霉病的防治效果，并提取有效拮抗蛋白进一步探索其抑菌机理，以期为设施茄果类蔬菜病害绿色防控技术提供科学依据。
欧盟蜡样芽孢杆菌标准
欧盟蜡样芽孢杆菌标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：欧盟蜡样芽孢杆菌标准是指欧盟针对食品安全领域中蜡样芽孢杆菌的监测、检测和控制制定的相关规定和标准。
蜡样芽孢杆菌是一种常见的细菌，存在于土壤、水源、动植物体表等环境中。
它可以在适宜的条件下繁殖生长，并产生毒素，对人体健康造成危害。
欧盟通过制定相应的标准，以确保食品中不含有危害健康的蜡样芽孢杆菌。
蜡样芽孢杆菌在食品中的检测主要是通过对食品样品进行采样，提取样品中的蜡样芽孢杆菌，然后进行培养、鉴定和计数。
欧盟要求食品生产企业在生产过程中对食品进行严格的监控，确保食品中蜡样芽孢杆菌的数量符合规定的标准。
如果食品中的蜡样芽孢杆菌超过规定的限量，必须立即采取措施加以处理，以避免对消费者造成健康风险。
欧盟蜡样芽孢杆菌的标准主要包括以下几个方面：1. 检测方法：欧盟规定了蜡样芽孢杆菌的检测方法，包括培养、分离、鉴定和计数等步骤。
食品生产企业必须使用认可的检测方法对食品进行检测，确保检测结果的准确性和可靠性。
2. 菌落数量限量：欧盟规定了食品中蜡样芽孢杆菌的菌落数量限量。
不同类型的食品对蜡样芽孢杆菌的容许量也会有所不同。
食品生产企业在生产过程中必须严格按照标准的要求进行控制，保证食品中的蜡样芽孢杆菌数量在安全范围内。
3. 处理措施：如果食品样品中的蜡样芽孢杆菌超过规定的限量，食品生产企业必须立即采取措施，如停产、召回产品等，以避免对消费者造成健康风险。
企业还必须配合相关部门进行溯源调查，查明蜡样芽孢杆菌的来源，并采取措施避免再次发生类似事件。
4. 标签要求：欧盟规定在食品包装上必须标明食品中是否含有蜡样芽孢杆菌，并注明蜡样芽孢杆菌的数量是否符合标准要求。
消费者通过检查食品包装上的标签信息可以了解食品的安全性和质量。
欧盟蜡样芽孢杆菌标准是欧盟为确保食品安全和保护消费者健康而制定的重要规定。
食品生产企业必须严格遵守蜡样芽孢杆菌的检测、限量和处理要求，确保生产的食品符合相关标准，保障消费者的权益和健康。
腐乳中蜡样芽胞杆菌的鉴定分析
腐乳中蜡样芽胞杆菌的鉴定分析摘要：目的:对某公司送检的腐乳产品进行蜡样芽胞杆菌检验时检出的可疑菌株进行鉴定分析和总结，避免发生由于产品被污染造成的食品安全事件。
方法：按GB 4789.14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》进行取样及鉴定分析[1]。
结果：从送检的腐乳产品中检测出蜡样芽胞杆菌，结果数据为1.8×103CFU/g。
结论：蜡样芽胞杆菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，超过一定限量便会产生毒素继而引起食物中毒，因此防止产品被蜡样芽胞杆菌污染是腐乳生产企业避免发生食品安全事件的重要保证。
关键词：腐乳；蜡样芽胞杆菌；食品安全；鉴定分析Identification and Analysis of Bacillus cereus in SufuJi Yu-heng1,Zheng Qi-jie2（1.Zhongshan Supervision Testing Institute of Quality & Metrology,Guangdong Zhongshan,528400;2.Technology Center of Zhongshan Customs District,Guangdong Zhongshan,528400）ABSTRACT: The suspicious strains detected in the test of Bacillus cereus for a brand of Sufu products were identified, analyzed and summarized to avoid food safety incidents caused by contamination of products. According to the Chinese national food safety standard Food Microbiological Examination: Bacillus cereus (GB 4789.14–2014)，sampling and identification analysis. Bacillus cereus was detectedfrom Sufu products. The results were as follows: 1.8×103CFU/g.Bacillus cereus has strong resistance to external harmful factors andis widely distributed. Toxins will be produced when it exceeds acertain limit, which will lead to food poisoning. Therefore,preventing products from being contaminated by Bacillus cereus is animportant guarantee for sufu production enterprises to avoid foodsafety incidents.Key words: sufu; Bacillus cereus; food safety;identification and analysis蜡样芽胞杆菌（学名：Bacillus cereus），大小为（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm），芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。
盒饭中蜡样芽孢杆菌的检测与鉴定研究
盒饭中蜡样芽孢杆菌的检测与鉴定研究作者：黄夏婵,易子真来源：《现代食品》 2019年第4期摘要:目的:对样品中分离的蜡样芽孢杆菌进行分析,为蜡样芽孢杆菌检测提供数据依据,探索蜡样芽孢杆菌最准确、最简便的鉴定方法。
方法:使用VITEK 2 compact、根状生长试验和蛋白质毒素结晶试验鉴定蜡样芽孢杆菌,采用单盒生化鉴定管进行生化分型。
结果:VITEK 2 compact 结合根状生长试验以及蛋白质毒素结晶试验可以准确鉴定出不同菌体形态的蜡样芽孢杆菌。
在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)平板上典型蜡样芽孢杆菌菌体形态有多种类型时应该选取有代表性的数量进行鉴定,蛋白质毒素结晶试验中菱形蛋白结晶体的判断是区分苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的关键性确证指标。
关键词:蜡样芽孢杆菌;菌落形态;菌株鉴定蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)广泛分布于自然界中,近年来在各类食品中的检出率较高。
蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种,为革兰氏阳性杆菌,兼性需氧,形成芽孢,引起食物中毒的菌株多为周身鞭毛,有动力[1]。
根据《香港食品微生物含量指引(2014 修订版)》,一般即食食品中含有超过105 CFU·g-1 蜡样芽孢杆菌,可能危害食用者的健康或不宜供人食用,如污染菌量小则不足以致病[2]。
在我国,蜡样芽孢杆菌的检出则主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
蜡样芽孢杆菌可引起呕吐型和腹泻型食物中毒。
呕吐型食物中毒主要由低分子量的呕吐毒素(Cereulide)引起[3],该毒素常在米饭类食品中被检出,耐热,耐蛋白酶水解酶,对酸碱稳定,高温121 ℃处理30 min仍不失活[4-5]。
腹泻型食物中毒主要由腹泻毒素引起,能导致腹泻型胃肠炎。
在日常检验工作中发现,苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)平板上的形态特征、生理生化特征非常相似,而且有着极高的DNA同源性,这时检验结果的准确性显得相当重要。
蜡样芽胞杆菌检测
3 培养基和试剂
• 3.1 磷酸盐缓冲液（PBS） • 3.2 甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂 • 3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤 • 3.4 营养琼脂 • 3.5过氧化氢溶液 • 3.6动力培养基 • 3.7硝酸盐肉汤 • 3.8酪蛋白琼脂
3 培养基和试剂
• 3.9 硫酸锰营养琼脂培养基 • 3.10 糖发酵管 • 3.11 V-P培养基 • 3.12 胰酪胨大豆羊血（TSSB）琼脂 • 3.13 溶菌酶营养肉汤 • 3.14 西蒙氏柠檬酸盐培养基 • 3.15 明胶培养基
项目
蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus
革兰氏染色
+a
过氧化氢酶
+
动力
+/-b
硝酸盐还原
+
酪蛋白分解
+
溶菌酶耐性
+
卵黄反应
+
葡萄糖利用（厌氧）
+
V-P试验
+
甘露醇产酸
-
溶血（羊红细胞）
+
根状生长
-
蛋白质毒素晶体
-
a：+ 表示 90%～100%的菌株阳性；
b：+/- 表示大多数的菌株阳性；
c：- 表示 90%～100%的菌株阴性；
40
48
120.00
48
120.00 45
112.5 0
45
112.5 0
67
25
37.31
26
38.81 50 74.63 50 74.63
浙江省CDC1
70
73 104.28 73 104.28 64 91.43 64 91.43
广东微生物研 究所
3株蜡样芽孢杆菌产酶特性的检测
3株菌吲哚试验均阴性 , 说明均不含有色氨酸 酶 , 即不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚 。
3 讨论
由于仔猪消化道系统发育不全及断奶应激等原因 决定了其消化酶的分泌不足消化能力差 , 而且肠道内 的大肠杆菌等腐败菌增多 , 会产生一些有害物质如吲 哚 、氨和硫化氢等 , 这些物质能潜在抑制生长和致癌
[ 4 ] 李松彪 , 秦翠丽 , 张许科 , 等. 动物微生态制剂的生产及其应 用 [ J ]. 河南畜牧兽医 , 2001, 22 (10) : 13214.
[ 5 ] 冯亚强 , 薛恒平. 芽孢杆菌微生态制剂的应用进展 [ J ]. 中国 饲料 , 1995, 10: 8210.
[ 6 ] 张正相 , 罗孝伦 , 王明福 , 等. 几种生物制剂对仔猪腹泻的预 防与治疗效果比较 [ J ]. 贵州畜牧兽医 , 2001, 25 (6) : 528.
畜牧与兽医 2009年 第 41卷 第 9期
·75·
疾病 防治
人参皂苷及其衍生物抗马立克氏病毒的作用
褚秀玲 1 , 苏建青 1 , 付本懂 2 , 王 鲁 3 , 伊鹏霏 2 , 王春元 2 , 申海青 2 , 韦旭斌 23
(1. 聊城大学农学院 , 山东 聊城 252000; 2. 吉林大学畜牧兽医学院 , 吉林 长春 130062; 3. 贵州大学动物科学学院 , 贵州 贵阳 550025)
Z1 、 Z2 菌分解培养基中的酪蛋白产生碱性物质 ,
·74·
Animal Husbandry & Veterinary M edicine 2009 Vol141 No19
使石蕊变蓝 , Z3 菌产生蛋白酶分解酪蛋白 , 使牛奶 变澄清 。 214 卵磷脂酶产生试验
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4．证实试验
（1）形态观察
本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圆形， 不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操 作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗
（2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧 化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖； 能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵
葡萄糖。
A、 MYP平板实验
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 mL，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液
做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL，接种在两个选择培养基
（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢
还原） 不变为阳性（亚硝酸盐
已分解成氨和氮气）
D、木糖-明胶（Gelatin）液化试验
结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
E、L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明 区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培 养72 h再观察。
（1）蜡状芽胞杆菌在甘露醇
卵黄多粘菌素琼脂(MYP)
上的菌落为粉红色(表示不发 酵甘露醇)，周围有粉红色的 晕（表示产生卵磷脂酶）。
B、血平板实验
在血液琼脂平板上形成浅灰 色、不透明、似毛玻璃状的
菌落。菌落周围初呈草绿色
溶血,时间稍长即完全透明。
C、动力-硝酸盐还原实验
呈现红色，为阳性，记+ 无红色出现，为阴性，记若无颜色变化，须加入少量锌 粉 变红者为阴性（硝酸盐未被
耐热性肠毒素：100℃30分钟不能被破坏，为引起呕吐 型中毒的致病因素,常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种 食物中形成。
蜡样芽胞杆菌生物学性状
1、形态和染色特性
该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽
胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列,
无荚膜，有周生鞭毛。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
流行病学特点
1、季节性特点： 以夏、秋季，尤其是6～10月为多见。 2、食品种类 －剩饭，特别是大米饭。 －乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、 豆芽、甜点心、调味汁、色拉。 国内：与淀粉质食品相关多。
致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌 外，肠毒素也是重要的致病因素。
实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验
一、实验目的
1．学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。
2．了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特
性和生化特性。
二、实验原理
蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性 杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可 能有此菌存在，易从各种食品中检出。 蜡样芽孢杆菌能发酵麦芽糖、蔗糖和水杨苷，不 发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖和山梨醇，卵 磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血， 能在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下 能发酵葡萄糖。
（4）L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培
养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培
养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白
酶）。阴性时应继续培养72 h再观察。 （5）溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液
一环,接种于溶菌酶肉汤中，35℃培养24h。 该菌在本培养基（含0.001％的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
5.与类似菌鉴别
本菌与其他类似菌的鉴别见表2。
特性 巨大 芽孢杆菌 蜡样 芽孢杆菌 ＋ ＋/ － ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋
产生 肠毒素
苏云金 蕈状 芽孢杆菌 芽孢杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋
灰疽 芽孢杆菌 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋
2、培养特性
（1）需氧菌，生长温度范围在10-45℃之间。最适
生长温度为28-35℃。
（2）在普通培养基上生长良好。
本菌在普通琼脂平板上，生长
的菌落呈乳白色，不透明，直
径4-6mm,边缘不整齐，表面粗 糙，呈毛玻璃状或白蜡状。
（3）在血液琼脂平板上形成浅
灰色、不透明、似毛玻璃状的
菌落。菌落周围初呈草绿色溶
（三）实验方法与步骤
检样 25g(ml)+225ml生理盐水
1.蜡样芽孢杆菌检验程序：
做成10-1-10-5的稀释液 37℃，18h-24h 选择性培养基（菌数测定） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 菌数计算 生长及菌落观察
中华人民共和国国家 标准食品卫生微生物 学检验蜡样芽孢杆菌 检验GB/T 4789.282003
杆菌在此培养基上的菌落为粉红色（表示不发酵甘露醇）周围有粉红
色的晕（表示产生卵磷脂酶）。 计数后，从中挑取5个这样的菌落作证 实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内
的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数源自得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。
3．分离培养
将检样或其稀释液划线于上述选择性培 养基平板上，置37℃培养12～20h，挑取 可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营 养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试 验。
血,时间稍长即完全透明。 （4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇 卵黄多粘菌素琼脂(MYP) 上的菌落为粉红色(表示不发
酵甘露醇)，周围有粉红色的
晕（表示产生卵磷脂酶）。
（5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常 常有菌膜或壁环，振摇易乳化。
3、生化性状
（1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中， 厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变 为黄色。 （表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸） （2）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。 （3） V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35℃ 培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止 1h，应为阳性反应（伊红色）。
四、实验结果
根据以上实验作出检验报告。
对动物和 人致病
－/＋．
过氧化氢酶 ＋ 动力 ＋/ － 硝酸盐还原 － 酪蛋白分解 ＋/－ 卵黄反应 － 葡萄糖利用（厌氧）－ 甘露醇 ＋ 木糖 ＋/－ 溶血 － 已知致病性
对昆虫致病的 假根 内毒素结晶 样生长
注：＋．90%~100%的菌株阳性 大多数菌株阴性
－．90%~100%菌株阴性 ＋/－.大多数菌株阳性