20121128蜡样芽孢杆菌检测
蜡样芽孢杆菌国标检测方法
蜡样芽孢杆菌国标检测方法蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，它可以生长在食品和环境中，因此对于食品和饮料行业来说，蜡样芽孢杆菌的检测非常重要。
国际上已经制定了相关的标准，而国内也制定了具体的检测方法。
本文将介绍蜡样芽孢杆菌国标检测方法并展开详细描述，以供相关行业参考。
1. 国标检测方法蜡样芽孢杆菌国标检测方法主要采用了生物学检测和分子生物学检测方法。
生物学检测主要使用平板计数法和过滤膜法，分子生物学检测主要使用聚合酶链式反应法（PCR法）和实时荧光定量PCR法（qPCR法）。
2. 样品选择需要检测的样品包括：发酵食品、膳食补充剂、调味品、果蔬制品、肉制品和乳制品等。
3. 样品制备样品制备前应先进行预处理。
首先采样应在保持样品原有状态的基础上进行。
对于固体样品，应采用加热处理或浸泡法进行分离；对于液体样品，应使用过滤方法或离心沉淀法进行分离。
4. 平板计数法平板计数法是指直接将样品加入含有富含营养物质的寒天平板中，将平板培养在适宜的环境中，形成菌落后进行计数。
整个操作过程需要消毒操作标本及工具，取样后用无菌吸管挤压或邀约样本，点样于寒天平板上，用无菌毛细管在菌液上滴蒸馏水，最后在恰当条件下培养。
5. 过滤膜法过滤膜法将膜片放入模具上，加入样品后进行过滤，将膜片放入含营养物质的寒天平板中，使其形成菌落后，进行计数。
操作过程中需要对膜片进行密封操作以避免空气污染。
6. PCR法PCR法是指从样品中提取DNA，并使用特定引物进行扩增，在扩增过程中计量目的DNA 的含量。
PCR方法的核心技术是产生大量DNA分子复制，以此来检测目标DNA。
7. qPCR法qPCR法是指通过PCR法产生信息荧光信号，以定量检测目标DNA的含量。
qPCR法和PCR法类似，都是通过DNA扩增并检测扩增产物来判断样品是否含有目标DNA。
8. 标准限值国标GB 4789.38-2016中规定蜡样芽孢杆菌在各类食品和饮料中的限值分别为100CFU/g和10CFU/mL，不得检出则符合标准。
蜡样芽孢杆菌检测国标
蜡样芽孢杆菌检测国标蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病微生物，它会引起食物中毒的发生。
针对蜡样芽孢杆菌的检测方法，我国制定了相关国家标准，本文将从以下三个方面进行介绍。
一、蜡样芽孢杆菌简介
蜡样芽孢杆菌又称为蜡样芽孢菌（Bacillus cereus），是一种革兰氏阳性菌。
其孢子分布广泛，可以在空气、土壤、水、食品等各种环境中存活，甚至在高温加工食品中也可以存活。
蜡样芽孢杆菌是一种致病微生物，能够引起急性食物中毒，这是因为它产生的毒素能够影响肠胃道，引起呕吐、腹泻等症状。
二、蜡样芽孢杆菌检测国标
为了保障人们的食品安全，我国对食品中的蜡样芽孢杆菌进行了规范化的检测方法，主要是通过标准的培养及鉴定步骤进行。
1.样品采集：首先需要确定样品的种类，其次选择适当的采集方法，例如在市场上购买的食品需要在废弃部位进行采集，以保障采样的准确性。
2.样品处理：将采集到的食品样品进行前处理，包括样品的清洁去除外部污染等步骤。
3.菌液制备：将采样到的食品样品用合适的培养基进行培养，培养出的菌落进行鉴定，得到蜡样芽孢杆菌后进行菌液制备。
4.检测方法：采用PCR法、生物分子方法、蛋白质检测法等方式对菌液进行检测，以确认菌液中是否有蜡样芽孢杆菌存在。
5.结果判定：判定样品中是否存在蜡样芽孢杆菌，并进行定性和定量分析。
三、总结
蜡样芽孢杆菌检测国标对食品安全有着重要的意义，它通过科学、规范的检测方法保障了人们的食品安全。
在实际操作中，应加强样品采集及前处理，保证样品的准确性。
同时，为了提高检测的灵敏度和准确性，应选择合适的检测方法。
最后，需要将检测结果进行有效记录，以便后续参考。
蜡样芽孢杆菌的检测
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实验步骤
2：样品稀释及计数：
1mL
1mL
1mL 1mL
1mL
10-1
肠
毒
素 耐 热
呕吐型 污染食品：米饭 我国多见
不 耐 热
腹泻型 污染食品：蛋白 型食品及果汁 欧美等国多见
污染途径： 泥土和灰尘 昆虫 不洁用具 不卫生的食品从业
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人员
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实验目的
1、掌握蜡样芽孢杆菌检验的主要步骤与方法。
2、了解蜡样芽孢杆菌菌落特点和掌握生化反 应结果的判断方法。
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检验程序
检样 50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液
10-1~10-6稀释液
选择性培养基 MYP 30°C , 24h
形态观察 菌数测定
证实试验
营养琼脂 30°C , 24h
革兰染色 生长及菌落观察 鉴别试验 生化反应 肠毒素测定
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报告
10
实验步骤
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产生溶血素：使胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB） 中的血细胞发生β溶血。
产生明胶酶：将明胶水解为多肽再水解为氨 基酸而使其由半固体转化为液态状。
触酶实验: 产生过氧化氢酶分解过氧化氢生成 水和氧气。
动力和硝酸盐试验: 蜡样芽胞杆菌运动活泼,能 还原硝酸盐为亚硝酸盐。
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实验材料
•甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板 •营养琼脂培养基 •L-酪氨酸营养琼脂培养基 •胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB) •动力-硝酸盐生化鉴定管 •木糖-明胶生化鉴定管 •硝酸盐试剂(1%对氨基苯磺酸溶液, 0.2% α-萘胺溶 液) •3%的双氧水 •革兰染液
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011
蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。
在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。
污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。
该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。
当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。
特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。
引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。
在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。
在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。
在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。
在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。
溶血。
不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。
实验安排一、稀释菌悬液的制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。
（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。
三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。
五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。
取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。
一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、引言蜡样芽孢杆菌是一种常见的微生物，其活菌数含量的测定对于粮食、食品和医药行业具有重要意义。
本文档旨在提供一份蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程，以确保测定结果准确可靠。
二、仪器与试剂- 无菌培养基- 自动培养箱- 显微镜- 十倍镜- 干燥烘箱- 无菌分注器- 离心机- 紫外灯三、操作步骤1. 准备工作- 清洗并消毒所有使用过的实验器材。
- 配制无菌培养基，确保培养基的质量符合要求。
2. 样品处理- 将待测样品加入适量的无菌水中，并通过搅拌均匀。
- 取适量的处理后的样品，通过无菌分注器加入无菌培养基中。
3. 培养- 将含有待测样品的无菌培养基均匀涂布于一片无菌培养基平板上。
- 将平板放入自动培养箱中，设置适当的温度和培养时间进行培养。
4. 菌落计数- 取出培养完毕的平板，使用显微镜和十倍镜对菌落进行观察和计数。
- 记录菌落数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的菌落形成单位（CFU）。
5. 活菌数计算- 将菌落计数结果乘以相应的稀释倍数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的活菌数含量。
6. 结果确认- 将结果与标准值进行比较，确保测定结果准确可靠。
四、风险提示- 操作过程需保持无菌操作，避免污染。
- 使用紫外灯时需注意安全，避免直接照射眼睛和皮肤。
五、总结蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程是确保测定结果准确可靠的重要工作。
按照本文档的要求进行操作，能够有效地保证测定的准确性，并为粮食、食品和医药行业的安全生产提供科学依据。
蜡样芽孢杆菌检测标准
蜡样芽孢杆菌检测标准蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的细菌，广泛存在于土壤、水、空气和食品中。
它是一种厌氧菌，在适宜的条件下能够迅速生长繁殖，因此对其检测标准十分重要。
蜡样芽孢杆菌的存在会对食品安全造成威胁，因为它可以产生多种毒素，其中包括引起食物中毒的致病毒素。
因此，对食品中蜡样芽孢杆菌的检测标准必须严格执行，以保障食品安全。
首先，蜡样芽孢杆菌的检测应该基于科学的方法和标准。
目前，国际上对蜡样芽孢杆菌的检测标准主要包括ISO标准和FDA标准。
ISO标准主要适用于食品和饮用水等领域，而FDA标准则更多地用于医药和化妆品等领域。
在执行检测时，应当严格按照相关标准进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
其次，蜡样芽孢杆菌的检测应该注重样品的采集和保存。
在采集样品时，应当避免外界污染，并选择适当的容器进行保存，以防止细菌的生长和繁殖。
同时，在运输和保存过程中，应当注意避免温度和湿度的变化，以确保样品的完整性和稳定性。
另外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测方法的选择和操作流程。
目前常用的检测方法包括培养法、PCR法和免疫学方法等。
在选择检测方法时，应当根据具体的检测对象和要求进行合理的选择，并严格按照操作流程进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
除此之外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测结果的解读和评估。
在获得检测结果后，应当根据相关标准和法规进行结果的解读和评估，以确定是否符合安全标准。
同时，还应当对检测过程中出现的异常情况进行分析和处理，以确保检测结果的真实性和可靠性。
总的来说，蜡样芽孢杆菌的检测标准对于保障食品安全至关重要。
在执行检测时，应当严格按照科学的方法和标准进行操作，注重样品的采集和保存，选择合适的检测方法并严格执行操作流程，最终对检测结果进行准确的解读和评估。
只有这样，才能有效地预防和控制蜡样芽孢杆菌对食品安全造成的威胁。
实验三、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
4．证实试验
（1）形态观察
本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圆形， 不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操 作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗
（2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧 化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖； 能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵
葡萄糖。
A、 MYP平板实验
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 mL，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液
做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL，接种在两个选择培养基
（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢
还原） 不变为阳性（亚硝酸盐
已分解成氨和氮气）
D、木糖-明胶（Gelatin）液化试验
结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
E、L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明 区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培 养72 h再观察。
蜡样芽孢杆菌的检测.ppt
实验结果
3 计数（表面涂布法）
1克样品中含的蜡样芽孢杆菌数： 证实阳性菌落数 挑取的菌落数
MYP平板上的菌落数×
× 稀释倍数× 10
举例：将检样10-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板 上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定， 证实为蜡样芽胞杆菌的是4个，则1g样品中含的蜡 样芽孢杆菌数为（25×4/5）×104×1/0.1
检验程序
检样 50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液
10-1~10-6稀释液 选择性培养基 MYP
30°C , 24h
形态观察 菌数测定 营养琼脂 30°C , 24h 证实试验
革兰染色 生长及菌落观察 鉴别试验
生化反应
肠毒素测定
报告
实验步骤
1
样品的保存和送检 待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。 对可疑是该菌引起的食物中毒的病人，应取可疑食 物或病患者的呕吐物、粪便，且立刻在3小时内送检。 送达实验室后，应保存于4℃并尽快检验。
4 证实试验
预 实 验 营 养 琼 脂 培 养 基
菌落形态观察
革兰染色
镜检观察菌体
生 化 实 验
卵磷脂酶实验 L-酪氨酸分解实验
触酶实验 溶血实验
双氧水
MYP琼脂平 板 L-酪氨酸琼脂培养基
鉴 别 试 验
胰酪胨大豆羊血琼脂平板
动力与硝酸盐还原实验
动力-硝酸盐生化鉴定管
1 形态观察 本菌革兰染色阳性，呈短链或长链，芽孢位于菌体 中央或偏端，不是菌体胀大。
2、了解蜡样芽孢杆菌菌落特点和掌握生化反 应结果的判断方法。
实验原理：蜡样芽胞杆菌具有以下生化特性：
不发酵甘露醇：在甘露醇-卵黄-多粘菌素 （MYP）琼脂平板上生成微粉红色菌落。 产生卵磷脂酶：分解MYP琼脂中的卵磷脂， 在菌落周围产生粉红色混浊环（沉淀环）。
蜡样芽孢杆菌国标检测方法
蜡样芽孢杆菌国标检测方法蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病菌，可以引发许多疾病，比如肺炎、食物中毒等。
因此，对于蜡样芽孢杆菌的检测方法非常重要。
目前，我国规定的蜡样芽孢杆菌国标检测方法共包括以下几个步骤：首先，样品前处理。
在此步骤中，需要将待检样品样品进行预处理，确保样品中的蜡样芽孢杆菌含量达到检测标准。
一般而言，对于不同类型的样品，处理方法也会有所不同。
比如在食品及饲料中检测，可以添加适当数量的生长因子，利于蜡样芽孢杆菌的生长和繁殖；在水及废水中检测，需要进行过滤、浓缩等步骤，以提高样品中菌落的数量。
其次，培养。
在此步骤中，待检样品需要在适当的培养基上进行培养，并采用适宜的培养条件和温度，使蜡样芽孢杆菌营养生长，并清晰地表现出其形态特征。
比如在肉汤杨氏平板上进行培养，在37℃下进行孵育，并对培养基的pH值和氧气浓度进行控制，以确保蜡样芽孢杆菌可以正常生长。
第三，菌落特征的观察。
在此步骤中，需要对培养出的蜡样芽孢杆菌菌落的特征进行观察。
一般而言，蜡样芽孢杆菌的菌落呈灰白色，中心较高，表面光滑细腻，菌体呈杆状，染色后呈青紫色，有时并可呈蓝绿色。
最后，进行鉴定和计数。
在此步骤中，需要对菌落进行进一步的鉴定和计数。
一般而言，可以采用荧光抗体技术、PCR扩增等方法进行检测，以确保检测结果的准确性和可靠性。
以上就是针对蜡样芽孢杆菌国标检测方法的详细介绍。
对于我们日常生活中经常遇到的食品、水源等，如果能够采用这些方法进行检测，那么对于保障我们的健康会起到非常重要的作用。
同时，也提醒大家在生活中注意卫生，遵守食品安全规定，以免受到蜡样芽孢杆菌等致病菌的侵害。
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培养特性
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联系厂家换货。 自行配置50%卵黄。（ 无菌操作， 卵黄与等量灭菌生理盐水混合） 异常 正常
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菌数测定
将原来5个稀释度调整为2-3个稀释度。
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GB 4789.14-XXXX
形态观察
芽孢（隐藏的生命）
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条件合适
营养体
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芽孢染色
• 染液：孔雀绿+沙黄
蕈状芽胞杆菌
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酪蛋白酶实验
• • • • 酪蛋白琼脂 培养基成分中酪蛋白不会溶解 接种可以菌落，36±1 ℃培养48±2h 阳性菌落周围培养基出现澄清透明区， 表示产生酪蛋白酶。 • 阴性反应继续培养72h观察
GB/T 4789.14-2003
• 检验程序：
与6.1操作步骤不一致， 此处稀释液培养不执行。
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附加试剂异常问题
• 甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基
50%卵黄生产时污染微生物，平板培 养后变黄，同时有异味。
• 原理：蜡样芽孢杆菌代谢产生碱性蛋白酶，可水解酪蛋白 成为小分子肽段，使菌落周围的培养基变透明。 • 采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。
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芽孢
• 在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成 的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。 • 芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在 顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形（前孢子）。 • 有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，称芽孢杆菌。 • 另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈 梭形或鼓槌状，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌。 • 2，6-吡啶二羧酸（DPA）
蜡样芽孢杆菌检验
刘晓川 中心实验室---20121128
GB/T 4789.14-2003
• • • • 检测程序 错误纠正及细节修改 形态观察 生化试验
GB 4789.14-征求意见稿
• • • • • • • 主要修改如下： 修改标准的中英文名称 增加第二法MPN法 更改MYP培养条件 增加根状生长实验 增加溶菌酶实验 增加附录A、附录B
动 +
硝 +
VP -
木 -
明 +
葡 （厌氧） +
甘 -
明胶、硝酸盐穿刺接种，其他滴加菌液
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• • • • • 蜡样芽孢杆菌呈现蓝绿色，菌落较大。 苏云金芽孢杆菌呈现蓝绿色。 单增李斯特菌呈现深蓝色。 其他菌呈现黄色或无色。 G-菌抑制。
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蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽胞杆菌的区别
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生化鉴定套装
• 可使用陆桥或海博生化鉴定套装
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生化试验(陆桥)
柠（枸） -
过氧化氢酶实验
• 3%过氧化氢溶液，临用前配置，用水稀释 • 挑取单个菌落置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2ml ，观察结果 • 阳性半分钟内产生气泡 • 阴性不产生气泡 • 原理： 过氧化氢酶 过氧化氢 水+氧气 • 载玻片接触酶实验 • 不建议将过氧化氢直接滴加于平皿上
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根状生长实验
• 间隔0.5cm左右距离划平行直线于营养琼脂平板上，30±1 ℃培养24h±2h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。蜡 样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。
蜡样芽胞杆菌
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菌落形态
ATCC 11778 产生卵磷脂酶 不发酵甘露醇 发酵甘露醇
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蜡样芽孢杆菌显色培养基（海博）
溶血实验
• 胰酪胨大豆养血（TSSB）琼脂 陆桥CM136（TSSB基础） + P62（无菌脱纤维羊血） • 30±1℃培养24±2h，菌落浅灰色，不透明，似白色毛玻 璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。
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生化性状
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蛋白质毒素结晶试验
步骤： 1.取室温放置3 d～4 d的营养琼脂培 养物少许涂于载玻片。 2.自然干燥，微火固定，甲醇作用30s， 火焰干燥. 3.滴0.5％碱性复红，火焰加热（微 见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min～2 min，移去火焰。更换染色液加温30 s， 水清洗、晾干后镜检。 结果观察： 观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深 红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白 结晶体（伴孢晶体） 。
生化试验(海博)
1.揭开盖板 4.制备菌液，加入试剂孔
2.撕开封口膜
5.盖上盖板，培养后填写结果 表并报告。
3.标记
内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY (GROUP)CO.,LTD 內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙 PRESENTATION TITLE & DATE 20.09.09
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