20121128蜡样芽孢杆菌检测

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根状生长实验
• 间隔0.5cm左右距离划平行直线于营养琼脂平板上，30±1 ℃培养24h±2h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。蜡 样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。
蜡样芽胞杆菌
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联系厂家换货。 自行配置50%卵黄。（ 无菌操作， 卵黄与等量灭菌生理盐水混合） 异常 正常
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生化鉴定套装
• 可使用陆桥或海博生化鉴定套装
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生化试验(陆桥)
柠（枸） -
标准菌株
蜡样芽孢杆菌标准菌株ATCC11778 ATCC菌株不需要配置活化液，复溶后可直接涂抹平板。 生长温度范围为20-45℃，最适生长温度为30-37 ℃。
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菌落形态
ATCC 11778 产生卵磷脂酶 不发酵甘露醇 发酵甘露醇
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蜡样芽孢杆菌显色培养基（海博）
• 原理：蜡样芽孢杆菌代谢产生碱性蛋白酶，可水解酪蛋白 成为小分子肽段，使菌落周围的培养基变透明。 • 采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。
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GB/T 4789.14-2003
• 检验程序：
与6.1操作步骤不一致， 此处稀释液培养不执行。
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菌数测定
将原来5个稀释度调整为2-3个稀释度。
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GB 4789.14-XXXX
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芽孢
• 在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成 的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。 • 芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在 顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形（前孢子）。 • 有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，称芽孢杆菌。 • 另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈 梭形或鼓槌状，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌。 • 2，6-吡啶二羧酸（DPA）
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蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽胞杆菌的区别
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生化分型 （选作）
根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液 化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别 。
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明胶液化实验
• 注意事项： • 1.明胶观察结果时，需放4℃,30min,而后观察结果，呈液 体状态为阳性，固态为阴性。 • Baidu Nhomakorabea.葡萄糖利用试验，需厌氧条件培养，变为黄色为阳性。
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动 +
硝 +
VP -
木 -
明 +
葡 （厌氧） +
甘 -
明胶、硝酸盐穿刺接种，其他滴加菌液
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形态观察
芽孢（隐藏的生命）
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条件合适
营养体
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芽孢染色
• 染液：孔雀绿+沙黄
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Thank You !
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生化性状
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蛋白质毒素结晶试验
步骤： 1.取室温放置3 d～4 d的营养琼脂培 养物少许涂于载玻片。 2.自然干燥，微火固定，甲醇作用30s， 火焰干燥. 3.滴0.5％碱性复红，火焰加热（微 见蒸气，勿使染液沸腾)持续1 min～2 min，移去火焰。更换染色液加温30 s， 水清洗、晾干后镜检。 结果观察： 观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深 红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白 结晶体（伴孢晶体） 。
蜡样芽孢杆菌检验
刘晓川 中心实验室---20121128
GB/T 4789.14-2003
• • • • 检测程序 错误纠正及细节修改 形态观察 生化试验
GB 4789.14-征求意见稿
• • • • • • • 主要修改如下： 修改标准的中英文名称 增加第二法MPN法 更改MYP培养条件 增加根状生长实验 增加溶菌酶实验 增加附录A、附录B
过氧化氢酶实验
• 3%过氧化氢溶液，临用前配置，用水稀释 • 挑取单个菌落置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2ml ，观察结果 • 阳性半分钟内产生气泡 • 阴性不产生气泡 • 原理： 过氧化氢酶 过氧化氢 水+氧气 • 载玻片接触酶实验 • 不建议将过氧化氢直接滴加于平皿上
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芽孢
蛋白结晶体
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溶菌酶耐性试验
• 用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中， 36℃±1℃培养24 h。蜡样芽胞杆菌在本培养基(含0.001 ％溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。 • 结果观察：混浊现象 • 培养基：溶菌酶肉汤基础+溶菌酶溶液
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附加试剂异常问题
• 甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基
50%卵黄生产时污染微生物，平板培 养后变黄，同时有异味。
生化试验(海博)
1.揭开盖板 4.制备菌液，加入试剂孔
2.撕开封口膜
5.盖上盖板，培养后填写结果 表并报告。
3.标记
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培养特性
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溶血实验
• 胰酪胨大豆养血（TSSB）琼脂 陆桥CM136（TSSB基础） + P62（无菌脱纤维羊血） • 30±1℃培养24±2h，菌落浅灰色，不透明，似白色毛玻 璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。
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• • • • • 蜡样芽孢杆菌呈现蓝绿色，菌落较大。 苏云金芽孢杆菌呈现蓝绿色。 单增李斯特菌呈现深蓝色。 其他菌呈现黄色或无色。 G-菌抑制。
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蕈状芽胞杆菌
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酪蛋白酶实验
• • • • 酪蛋白琼脂 培养基成分中酪蛋白不会溶解 接种可以菌落，36±1 ℃培养48±2h 阳性菌落周围培养基出现澄清透明区， 表示产生酪蛋白酶。 • 阴性反应继续培养72h观察
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淀粉酶实验
培养基： 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）+0.2%可溶性淀粉，灭菌倒板。 步骤： 1.接种平板，36±1℃培养18-24h； 2.滴加鲁格氏碘液，阳性培养基蓝色，菌落周围有透明圈。 原理：碘+淀粉------蓝色