致病菌检验-蜡样芽孢杆菌.

分离培养和证实试验:
分离培养：从MYP平板上挑可疑菌落到营养琼脂上进行纯培养。 证实试验： （1）形态观察 （2）培养特性 （3）生化性状及生化分型 ①生化性状 本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性； 溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条 件下能发酵葡萄糖。 ②生化分型 根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P 反应、明胶液化性状的试验，分成不同的型别。
蜡样芽孢杆菌
Hale Waihona Puke Baidu
报告
菌数测定：
将样品稀释液0.1 mL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂平板上 培养后，选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取5个典型菌落 做证实试验。根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数。 蜡样芽孢杆菌数=可疑菌落数×证实为阳性菌落数的比例×稀释倍数×10 MYP培养基中含有卵黄、甘露醇、多 粘菌素和pH指示剂酚红等。多粘菌素 可抑制杂菌的生长。 蜡样芽孢杆菌不发酵甘露醇，菌落为 粉红色（否则为黄色）。 该菌产生卵磷脂酶，由于脂肪和卵磷 脂被分解，在菌落周围产生粉红色的晕。
选择性培养基 （菌数测定） MYP 36℃±1℃ 12 h ~ 20 h
选择性培养基 （分离培养） MYP 36℃±1℃ 12 h ~ 20 h
特性、生化性状和生化分型试验。
④与类似菌的鉴别：主要是与苏 云金芽孢杆菌的鉴别。 ⑤结果报告：报告每g（mL）检样
中所含的蜡样芽孢杆菌数。
生长及菌落观察 染色镜检 生化试验 菌株保存 菌数计算 营养琼脂培养基
V-P反应
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
明胶液化
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
与类似菌鉴别：
表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 过氧化氢酶 动力 硝酸盐还原 酪蛋白分解 卵黄反应 葡萄糖利用（厌氧） 甘露醇 木糖 溶血 已知致病菌特性 巨大芽 孢杆菌 ＋ ＋/－ － ＋/－ － － ＋ ＋/－ － 蜡样芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 产生肠毒素 苏云金芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ 对昆虫致病的 内毒素结晶 蕈状芽孢杆菌 炭疽芽孢杆菌 ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋ 假根样生长 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋ 对动物和人致 病
表1 蜡样芽孢杆菌生化分型
生化试验
型别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
柠檬酸盐利用
＋ － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋
硝酸盐还原
＋ ＋ ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
淀粉水解
＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ － ＋
致 病 菌 蜡样芽胞杆菌 检 验
蜡样芽胞杆菌
（一）生物学特性 1、形态与染色
革兰氏阳性大杆菌，宽度在1 μm或1 μm以上，芽孢呈卵圆形，不 突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
2、培养特性
需氧，最适生长温度30~32℃。 在肉汤中混浊生长，有菌膜或壁环，振摇易乳化。 在普通琼脂平板上，菌落灰白色，不透明，边缘不整齐， 表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。 在血平板上，菌落呈浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状， 有溶血环。 在甘露醇卵黄多粘菌素平板上，菌落呈粉红色，具有白色 混浊环（不发酵甘露醇、产生卵磷脂酶）
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
三、检验方法
1、检验标准； GB 4789.14—2003 2、培养基和试剂 培养基: 肉浸液肉汤培养基 动力-硝酸盐培养基 血琼脂培养基 酪蛋白琼脂培养基 缓冲葡萄糖蛋白胨水 木糖-明胶培养基
甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基、 试剂：0.5%碱性复红染色液、革兰氏染色液、3%过氧化氢
3、生化反应
能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。
不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试验（+），液化明胶。
二、致病性
食品蜡样芽胞杆菌数量>106/g（mL）时常可导致食物中毒，
导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。 肠毒素类型： 耐热性肠毒素：100℃30min不能被破坏，常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。
注：＋ 90%~100%的菌株阳性；－ 90%~100%的菌株阴性；＋/－ 大多数菌株阳性；－/＋ 大多 数菌株阴性。
★鉴别：
蜡样芽孢杆菌在形态以及生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似 ，要 进行鉴别。主要是通过观察伴孢晶体来判断，苏云金芽孢杆菌有伴孢晶体， 蜡样芽孢杆菌无。
苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体
溶液、甲萘胺-乙酸溶液、对氨基苯磺酸-乙酸溶液。
3、检验程序
包括四个步骤： ①菌数测定:涂布甘露醇卵黄多粘 菌素（MYP） 平板计数。 ②分离培养:从MYP上 挑可疑菌 落进行纯培养。 ③证实实验:包括形态观察、培养
检 样 25 g（mL）加225 mL生理盐水
做成10-1~10-5的稀释液 37℃，18 h ~ 24 h