蜡样芽胞杆菌及检验
蜡样芽孢杆菌国标检测方法
蜡样芽孢杆菌国标检测方法蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，它可以生长在食品和环境中，因此对于食品和饮料行业来说，蜡样芽孢杆菌的检测非常重要。
国际上已经制定了相关的标准，而国内也制定了具体的检测方法。
本文将介绍蜡样芽孢杆菌国标检测方法并展开详细描述，以供相关行业参考。
1. 国标检测方法蜡样芽孢杆菌国标检测方法主要采用了生物学检测和分子生物学检测方法。
生物学检测主要使用平板计数法和过滤膜法，分子生物学检测主要使用聚合酶链式反应法（PCR法）和实时荧光定量PCR法（qPCR法）。
2. 样品选择需要检测的样品包括：发酵食品、膳食补充剂、调味品、果蔬制品、肉制品和乳制品等。
3. 样品制备样品制备前应先进行预处理。
首先采样应在保持样品原有状态的基础上进行。
对于固体样品，应采用加热处理或浸泡法进行分离；对于液体样品，应使用过滤方法或离心沉淀法进行分离。
4. 平板计数法平板计数法是指直接将样品加入含有富含营养物质的寒天平板中，将平板培养在适宜的环境中，形成菌落后进行计数。
整个操作过程需要消毒操作标本及工具，取样后用无菌吸管挤压或邀约样本，点样于寒天平板上，用无菌毛细管在菌液上滴蒸馏水，最后在恰当条件下培养。
5. 过滤膜法过滤膜法将膜片放入模具上，加入样品后进行过滤，将膜片放入含营养物质的寒天平板中，使其形成菌落后，进行计数。
操作过程中需要对膜片进行密封操作以避免空气污染。
6. PCR法PCR法是指从样品中提取DNA，并使用特定引物进行扩增，在扩增过程中计量目的DNA 的含量。
PCR方法的核心技术是产生大量DNA分子复制，以此来检测目标DNA。
7. qPCR法qPCR法是指通过PCR法产生信息荧光信号，以定量检测目标DNA的含量。
qPCR法和PCR法类似，都是通过DNA扩增并检测扩增产物来判断样品是否含有目标DNA。
8. 标准限值国标GB 4789.38-2016中规定蜡样芽孢杆菌在各类食品和饮料中的限值分别为100CFU/g和10CFU/mL，不得检出则符合标准。
致病菌检验-蜡样芽孢杆菌.
V-P反应
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － －
明胶液化
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
与类似菌鉴别：
表2 蜡样芽孢杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 过氧化氢酶 动力 硝酸盐还原 酪蛋白分解 卵黄反应 葡萄糖利用（厌氧） 甘露醇 木糖 溶血 已知致病菌特性 巨大芽 孢杆菌 ＋ ＋/－ － ＋/－ － － ＋ ＋/－ － 蜡样芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ 产生肠毒素 苏云金芽孢 杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － ＋ 对昆虫致病的 内毒素结晶 蕈状芽孢杆菌 炭疽芽孢杆菌 ＋ － ＋ ＋/－ ＋ ＋ － － －/＋ 假根样生长 ＋ － ＋ －/＋ ＋ ＋ － － －/＋ 对动物
能分解葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水杨苷，产酸不产气。
不分解乳糖，甘露醇，阿拉伯糖，山梨醇，木糖 H2S（-），尿素酶试验（-）卵磷脂酶（+）， V-P试验（+），液化明胶。
二、致病性
食品蜡样芽胞杆菌数量>106/g（mL）时常可导致食物中毒，
导致中毒的主要原因是其产生的肠毒素 。 肠毒素类型： 耐热性肠毒素：100℃30min不能被破坏，常在米饭中形成。 不耐热肠毒素：能在各种食物中形成。
表1 蜡样芽孢杆菌生化分型
生化试验
型别 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
柠檬酸盐利用
＋ － ＋ － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋
硝酸盐还原
＋ ＋ ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － －
淀粉水解
＋ ＋ － ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ － ＋
临床症状：食物中毒，分为呕吐型和腹泻型两类。
食品中蜡样芽孢杆菌的检验
三、微生物检验
▪ 操作步骤： 2、分离试验
取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基（MYP）上，置37℃培养12-20h，挑取可疑的 蜡状芽胞杆菌菌落接种于肉汤和营养琼脂作成纯培养，然后做证实试验。 3 证实试验 （1）镜检观察形态 （2）培养特性 （3）生化性状及分型
三、微生物检验
▪ （三）结果报告 根据证实为蜡状芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以稀释倍数，即得每 g(ml)样品中所含蜡状芽孢杆菌数。如MYP平板上的可以菌落为25个，取5个鉴定，证实为四 个，乘上稀释倍数（104），再乘上1g(ml)检样数（取的是0.1ml样)，则 N=25*4/5*104*10=2*106 报告每个g(ml)检样中含蜡状芽胞杆菌的数量（个/个g(ml))
中乳。
▪ 麦芽糖：阳性
（三）、生化反应
▪ 甘露醇：阴性
（三）、生化反应
▪ 木糖：阴性
（三）ห้องสมุดไป่ตู้生化反应
▪ 尿素酶试验：阴性
（三）、生化反应
未接种
接种
（四）、抵抗力
1、耐热； 2、对抗菌素的敏感性。
二、流行病学
（一）、细菌分布 蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已 从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种 甜点等。 在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉 和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
二、流行病学
（一）、细菌分布 以前调查各种食品514件，发现本菌：日本1641件中有193件阳性，阳性率11.8%；国内480件 中有221件阳性，阳性率46%；乳制品阳性率77%；水果、干果阳性率8.1%；肉制品阳性率26%。
蜡样芽孢杆菌检测国标
蜡样芽孢杆菌检测国标蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病微生物，它会引起食物中毒的发生。
针对蜡样芽孢杆菌的检测方法，我国制定了相关国家标准，本文将从以下三个方面进行介绍。
一、蜡样芽孢杆菌简介
蜡样芽孢杆菌又称为蜡样芽孢菌（Bacillus cereus），是一种革兰氏阳性菌。
其孢子分布广泛，可以在空气、土壤、水、食品等各种环境中存活，甚至在高温加工食品中也可以存活。
蜡样芽孢杆菌是一种致病微生物，能够引起急性食物中毒，这是因为它产生的毒素能够影响肠胃道，引起呕吐、腹泻等症状。
二、蜡样芽孢杆菌检测国标
为了保障人们的食品安全，我国对食品中的蜡样芽孢杆菌进行了规范化的检测方法，主要是通过标准的培养及鉴定步骤进行。
1.样品采集：首先需要确定样品的种类，其次选择适当的采集方法，例如在市场上购买的食品需要在废弃部位进行采集，以保障采样的准确性。
2.样品处理：将采集到的食品样品进行前处理，包括样品的清洁去除外部污染等步骤。
3.菌液制备：将采样到的食品样品用合适的培养基进行培养，培养出的菌落进行鉴定，得到蜡样芽孢杆菌后进行菌液制备。
4.检测方法：采用PCR法、生物分子方法、蛋白质检测法等方式对菌液进行检测，以确认菌液中是否有蜡样芽孢杆菌存在。
5.结果判定：判定样品中是否存在蜡样芽孢杆菌，并进行定性和定量分析。
三、总结
蜡样芽孢杆菌检测国标对食品安全有着重要的意义，它通过科学、规范的检测方法保障了人们的食品安全。
在实际操作中，应加强样品采集及前处理，保证样品的准确性。
同时，为了提高检测的灵敏度和准确性，应选择合适的检测方法。
最后，需要将检测结果进行有效记录，以便后续参考。
出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法
出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法1.适用范围本方法适用于出口食品的检验。
2.培养基和仪器2.1.培养基甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂；l-酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改良V-P培养基；动力培养基；胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)；Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂；V-P试剂；碱性复红染色液。
2.2.仪器吸管：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；涡动搅拌器；L形玻璃棒；恒温培养箱：30℃及36±1℃。
3.样品的保存和送检待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。
送达实验室后，应保存于4 ℃并尽快进行检验。
如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。
脱水食品可在常温下送检和储存。
4.样品的制备4.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。
称取50g放于无菌均质杯中。
4.2.加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r/min均质2min。
制成1∶10样品稀释液。
4.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。
4.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10－6。
5.检验步骤5.1.平板计数法取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。
用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。
每稀释度接种两个MYP琼脂平板。
将平板置于30℃培养24h。
选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。
并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。
蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。
如反应不典型，可继续培养24h再计数。
计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30℃培养24h，按第6章进行证实试验。
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程一、引言蜡样芽孢杆菌是一种常见的微生物，其活菌数含量的测定对于粮食、食品和医药行业具有重要意义。
本文档旨在提供一份蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程，以确保测定结果准确可靠。
二、仪器与试剂- 无菌培养基- 自动培养箱- 显微镜- 十倍镜- 干燥烘箱- 无菌分注器- 离心机- 紫外灯三、操作步骤1. 准备工作- 清洗并消毒所有使用过的实验器材。
- 配制无菌培养基，确保培养基的质量符合要求。
2. 样品处理- 将待测样品加入适量的无菌水中，并通过搅拌均匀。
- 取适量的处理后的样品，通过无菌分注器加入无菌培养基中。
3. 培养- 将含有待测样品的无菌培养基均匀涂布于一片无菌培养基平板上。
- 将平板放入自动培养箱中，设置适当的温度和培养时间进行培养。
4. 菌落计数- 取出培养完毕的平板，使用显微镜和十倍镜对菌落进行观察和计数。
- 记录菌落数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的菌落形成单位（CFU）。
5. 活菌数计算- 将菌落计数结果乘以相应的稀释倍数，得到待测样品中蜡样芽孢杆菌的活菌数含量。
6. 结果确认- 将结果与标准值进行比较，确保测定结果准确可靠。
四、风险提示- 操作过程需保持无菌操作，避免污染。
- 使用紫外灯时需注意安全，避免直接照射眼睛和皮肤。
五、总结蜡样芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程是确保测定结果准确可靠的重要工作。
按照本文档的要求进行操作，能够有效地保证测定的准确性，并为粮食、食品和医药行业的安全生产提供科学依据。
蜡样芽孢杆菌检测标准
蜡样芽孢杆菌检测标准蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的细菌，广泛存在于土壤、水、空气和食品中。
它是一种厌氧菌，在适宜的条件下能够迅速生长繁殖，因此对其检测标准十分重要。
蜡样芽孢杆菌的存在会对食品安全造成威胁，因为它可以产生多种毒素，其中包括引起食物中毒的致病毒素。
因此，对食品中蜡样芽孢杆菌的检测标准必须严格执行，以保障食品安全。
首先，蜡样芽孢杆菌的检测应该基于科学的方法和标准。
目前，国际上对蜡样芽孢杆菌的检测标准主要包括ISO标准和FDA标准。
ISO标准主要适用于食品和饮用水等领域，而FDA标准则更多地用于医药和化妆品等领域。
在执行检测时，应当严格按照相关标准进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
其次，蜡样芽孢杆菌的检测应该注重样品的采集和保存。
在采集样品时，应当避免外界污染，并选择适当的容器进行保存，以防止细菌的生长和繁殖。
同时，在运输和保存过程中，应当注意避免温度和湿度的变化，以确保样品的完整性和稳定性。
另外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测方法的选择和操作流程。
目前常用的检测方法包括培养法、PCR法和免疫学方法等。
在选择检测方法时，应当根据具体的检测对象和要求进行合理的选择，并严格按照操作流程进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
除此之外，蜡样芽孢杆菌的检测还应该关注检测结果的解读和评估。
在获得检测结果后，应当根据相关标准和法规进行结果的解读和评估，以确定是否符合安全标准。
同时，还应当对检测过程中出现的异常情况进行分析和处理，以确保检测结果的真实性和可靠性。
总的来说，蜡样芽孢杆菌的检测标准对于保障食品安全至关重要。
在执行检测时，应当严格按照科学的方法和标准进行操作，注重样品的采集和保存，选择合适的检测方法并严格执行操作流程，最终对检测结果进行准确的解读和评估。
只有这样，才能有效地预防和控制蜡样芽孢杆菌对食品安全造成的威胁。
实验三、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验
4．证实试验
（1）形态观察
本菌应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圆形， 不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操 作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）自来水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。 7）蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗
（2）培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环， 振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明， 表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性
本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧 化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖； 能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵
葡萄糖。
A、 MYP平板实验
选择性培养基（分离培养） MYP 36 ℃ ±1℃ 12h~20h 营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 菌株保存
报
告
2．菌数测定
以无菌操作将检样25g或25 mL，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液
做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL，接种在两个选择培养基
（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置 37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢
还原） 不变为阳性（亚硝酸盐
已分解成氨和氮气）
D、木糖-明胶（Gelatin）液化试验
结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。 明胶凝固，为阴性，-。
E、L-酪氨酸分解试验
接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明 区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培 养72 h再观察。
蜡样芽孢杆菌的检测
2 实验结果
1 MYP平板上：粉红色菌落，菌落周围产生粉红色浑浊 圈。 2 L-酪蛋白琼脂培养基：菌落周围形成透明圈。 3 触酶试验：加入过氧化氢后30秒产生气泡。 4 TSSB平板上：菌落周围产生的β 溶血圈。（在菌落 周围出现一个大小不一的完全透明清楚的宽带）。
紫云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱得溶血现象， 而炭疽芽胞杆菌通常不溶血。 5 动力-硝酸盐生化鉴定管：细菌沿穿刺线扩散生长， 加硝酸盐试剂后培养基变红。
实验材料
•甘露醇-卵黄-多粘菌素（MYP）琼脂平板 •营养琼脂培养基 •L-酪氨酸营养琼脂培养基 •胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB) •动力-硝酸盐生化鉴定管 •木糖-明胶生化鉴定管 •硝酸盐试剂(1%对氨基苯磺酸溶液, 0.2% α-萘胺溶 液) •3%的双氧水 •革兰染液
检验程序
检样 50g(mL)+450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液
（第一次课）
蜡样芽胞杆菌概述
一 形态与染色
本菌是革兰氏阳性杆菌， 1.0~1.2μm×3~5μm,菌 体两端钝圆，有鞭毛， 无荚膜，多成短链状排 列。
本菌生长6小时以后可以 既可以形成芽孢，形成 的芽孢小于菌体横径， 位于中心或稍偏于一端。
二 培养特性
营养要求不高，在普通 培养基上可生长良好， 最适宜温度为28~35℃。 菌落较大，不透明，表 面粗糙似毛玻璃状或蜡 状，边缘常成扩展状。
实验步骤
2：样品稀释及计数：
1mL
1mL
1mL 1mL
1mL
10-1
10-6
9mL
9mL
9mL
9mL 9mL
1 每个稀释度混匀吹打完毕 后换用另一只灭菌吸管。 2 每稀释度接种两个平皿。
各稀释度0.1mL，L型玻棒均匀涂布 30℃ ，24h
一起蜡样芽孢杆菌食物中毒调查与检测
一起蜡样芽孢杆菌食物中毒调查与检测目的研究并分析一起由于蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒的原因，为食物中毒的处理提供科学有效的依据。
方法根据临床流行病学调查方式，结合患者临床表现与细菌学鉴定结果，分析食物中毒的原因。
结果本次食物中毒，中毒食物为油条与麻糕，共有32例患者，发病患者的病情较轻，无发热情况，病程较短，在经过针对性治疗后，所有发病患者均在24h内痊愈，无患者死亡。
结论蜡样芽抱杆的数量超过106个/g时，就可能导致食物中毒的发生，抑制蜡样芽抱杆生长与繁殖的最有效手段就是适当冷藏与高温杀菌，因此，为了预防食物中毒的发生，需要将食物进行冷藏保存或者高温消毒。
标签：蜡样芽孢杆菌；食物中毒；调查；检测蜡样芽胞杆菌是常见的食物中毒致病菌，在我国细菌性食物中毒中排在第三位，由于蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒有显著的季节性特征，一般情况下，以夏季、秋季居多，引起食物中毒的食物品种较多，多以米粉与剩米饭较为常见[1]。
1中毒经过与现场情况1.1中毒经过2013年8月7日，来自山西省太原市某旅游团，包括驾驶员与导游在内的41人夜宿我市某宾馆，该宾馆内无早餐供应，因此，一行人于次日早上8：00左右在宾馆附近的早餐店食用早餐，在食用完早餐之后，当天下午16点20分左右，23例陆续出现腹泻、腹痛的情况，少数患者出现头痛、头晕、呕吐的表现，截止到8月9日上午，共有32例发病，发病患者的病情较轻，无发热情况，病程较短，在經过针对性治疗后，所有发病患者均在24h内痊愈，无患者死亡。
1.2现场情况分析该旅行团一行41人于8月7日在早餐店用餐，食物主要包括油条、稀饭、萝卜干、牛奶、咸菜豆子、麻糕几种，在食用时并未发现食物有异常情况，经过调查分析，41人中共7人食用油条，5人食用麻糕，其中2人同时食用油条与麻糕，35人食用牛奶，200ml袋装包装，生产日期为2013年6月1日，保质期45d，根据对发病患者的调查结果显示，所有发病患者均食用了牛奶、麻糕或者油条，未食用麻糕、油条与牛奶者未发病。
食品中蜡样芽孢杆菌芽孢EMA-qPCR 检测
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是 1.2 仪器设备
一种常见的兼性需氧革兰氏阳性致病
ABI 7500FAST 实时荧光 PCR 仪、
菌，极易污染乳制品、米饭、水果制 生物安全柜、超声波细胞破碎仪、显 品等食品 [1]。目前，检测方法主要是传 微镜。
图 3 不同光照时间处理对 EMA-qPCR 结果影响
管黑暗中室温放置 5 min。然后将离心 列， 设 计 引 物 和 探 针（ 南 京 金 斯
管放置冰上，分别强光下ຫໍສະໝຸດ 光 0、1、5、 瑞 生 物 公 司 合 成 ）。 上 游 引 物：
运用到蜡样芽孢杆菌实时荧光PCR检测中， 30 s，12 000 r/min 离心 2 min，取上
提高qPCR检测的准确度，降低假阳性率。 清用细菌 DNA 提取试剂盒提取 DNA。
1 材料和方法
1.4.2 溶菌酶法
1.1 菌种
向收集菌体的离心管加入 500 μL
蜡样芽孢杆菌 CMCC(B)63301。 无菌水，涡旋 30 s，再加入 1 μL 溶菌
统培养法，耗时费力，难以适应现代 1.3 蜡样芽孢杆菌芽孢的制备
食品生产的检验需要。
蜡样芽孢杆菌芽孢形成可以通过
蜡样芽孢杆菌实时荧光 PCR 技术 营养限量进行诱导，在培养基中添加 因具有检测时间短、操作简便等优点 Mn2+ 能提高芽孢的得率及稳定性。孔
得到广泛运用。蜡样芽孢杆菌在食品 雀石绿染色镜检芽孢生成情况。蜡样
酶（100 mg/mL），37 ℃ 水 浴 2 h， 12 000 r/min 离心 2 min，取上清提取 DNA。
1.4.3 煮沸法 在菌体中加入 500 μL 无菌水，涡 旋 30 s，置 95 ℃水浴 5 min，12 000 r/min 离心 2 min，取上清提取 DNA。 1.4.4 超声波破碎法 向 离 心 管 中 加 入 500 μL 的 无 菌 水，涡旋 30 s，放入超声波细胞破碎 仪超声波振荡 20 min（40%，5 s，5 s）， 12 000 r/min 离心 2 min，取上清提取 DNA。 1.5 EMA 使用浓度优化 用 ddH2O 配 制 0.1 mg/mL 的 EMA 溶液，-20 ℃避光保存。取 Mn2+ 营 养 肉 汤 中 30 ℃ 培 养 48 h 的 蜡 样 芽孢杆菌菌液于 80 ℃水浴中处理 20 min，灭活营养体细胞。将 EMA（0.1 mg/mL）分别加入装有 1 mL 上述灭 活 菌 液 的 离 心 管 中， 使 EMA 终 质 量 浓 度 分 别 达 到 0.1、1.0、2.0、5.0、 10.0、20.0 μg/mL，不加 EMA 的菌液 作为对照。充分混匀后，将离心管黑 暗中室温放置约 5 min，让 EMA 与细 菌 DNA 充分结合。然后将离心管放置 冰上，强光下曝光 20 min，以此为模 板采用超声波破碎法提取 DNA。 1.6 EMA 光照时间优化 添加 EMA 到 1.5 中所述灭活菌液 1 mL 离心管中，使每管 EMA 终浓度 达到 2.0μg/mL。充分混匀后，将离心
食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析及建立改进方法的研究
食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析及建立改进方法的研究摘要蜡样芽孢杆菌是一种常见的食品中毒原因之一，对人类健康产生严重影响。
为了有效检测食品中的蜡样芽孢杆菌，本文首先对现有的检测方法进行了分析，并发现它们存在一定的局限性。
随后，通过实验的方法研究了一种新的蜡样芽孢杆菌检测方法，并对其进行了改进，以提高检测的准确性和灵敏度。
本研究为食品安全提供了一种可靠的蜡样芽孢杆菌检测方法。
关键词：蜡样芽孢杆菌；食品安全；检测方法；准确性；灵敏度1. 引言食品中的微生物污染是食品安全的重要问题之一，而蜡样芽孢杆菌是其中常见的致病菌之一。
蜡样芽孢杆菌感染会引起食物中毒症状，严重时可能导致肠道炎症、腹泻和脱水等严重问题。
因此，开发一种高效的蜡样芽孢杆菌检测方法对于食品安全至关重要。
2. 现有方法的分析目前，常用的蜡样芽孢杆菌检测方法主要包括传统的培养方法和分子生物学方法。
传统的培养方法需要进行预培养、落订、筛选等步骤，耗时且操作繁琐。
虽然分子生物学方法如PCR技术在蜡样芽孢杆菌检测中具有高度灵敏度和特异性，但其也存在一些问题，例如样本处理过程中的核酸提取，特异性引物的选择，以及结果的解读等。
3. 新方法的研究本研究采用了一种新的蜡样芽孢杆菌检测方法，并对其进行了改进。
改进的方法主要包括样本前处理、特异性引物的设计以及结果的快速解读等方面。
首先，在样本前处理中，使用了一种有效的细菌提取方法，将样本中的蜡样芽孢杆菌快速提取出来，避免了其他微生物的干扰。
其次，在引物的设计中，根据蜡样芽孢杆菌的特定基因序列，设计了一对高度特异性的引物，以提高检测的准确性。
最后，在结果解读方面，采用了一种快速的荧光定量PCR技术，通过检测荧光信号的强度，可以快速确认样本中蜡样芽孢杆菌的存在。
4. 结果与讨论通过对一系列不同食品样本的检测，发现本研究中建立的蜡样芽孢杆菌检测方法在准确性和灵敏度方面均有显著提高。
样本前处理方面，高效的提取方法可以从复杂的食品样本中快速提取蜡样芽孢杆菌。
腐乳中蜡样芽胞杆菌的鉴定分析
腐乳中蜡样芽胞杆菌的鉴定分析摘要：目的:对某公司送检的腐乳产品进行蜡样芽胞杆菌检验时检出的可疑菌株进行鉴定分析和总结，避免发生由于产品被污染造成的食品安全事件。
方法：按GB 4789.14-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》进行取样及鉴定分析[1]。
结果：从送检的腐乳产品中检测出蜡样芽胞杆菌，结果数据为1.8×103CFU/g。
结论：蜡样芽胞杆菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，超过一定限量便会产生毒素继而引起食物中毒，因此防止产品被蜡样芽胞杆菌污染是腐乳生产企业避免发生食品安全事件的重要保证。
关键词：腐乳；蜡样芽胞杆菌；食品安全；鉴定分析Identification and Analysis of Bacillus cereus in SufuJi Yu-heng1,Zheng Qi-jie2（1.Zhongshan Supervision Testing Institute of Quality & Metrology,Guangdong Zhongshan,528400;2.Technology Center of Zhongshan Customs District,Guangdong Zhongshan,528400）ABSTRACT: The suspicious strains detected in the test of Bacillus cereus for a brand of Sufu products were identified, analyzed and summarized to avoid food safety incidents caused by contamination of products. According to the Chinese national food safety standard Food Microbiological Examination: Bacillus cereus (GB 4789.14–2014)，sampling and identification analysis. Bacillus cereus was detectedfrom Sufu products. The results were as follows: 1.8×103CFU/g.Bacillus cereus has strong resistance to external harmful factors andis widely distributed. Toxins will be produced when it exceeds acertain limit, which will lead to food poisoning. Therefore,preventing products from being contaminated by Bacillus cereus is animportant guarantee for sufu production enterprises to avoid foodsafety incidents.Key words: sufu; Bacillus cereus; food safety;identification and analysis蜡样芽胞杆菌（学名：Bacillus cereus），大小为（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm），芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。
盒饭中蜡样芽孢杆菌的检测与鉴定研究
盒饭中蜡样芽孢杆菌的检测与鉴定研究作者：黄夏婵,易子真来源：《现代食品》 2019年第4期摘要:目的:对样品中分离的蜡样芽孢杆菌进行分析,为蜡样芽孢杆菌检测提供数据依据,探索蜡样芽孢杆菌最准确、最简便的鉴定方法。
方法:使用VITEK 2 compact、根状生长试验和蛋白质毒素结晶试验鉴定蜡样芽孢杆菌,采用单盒生化鉴定管进行生化分型。
结果:VITEK 2 compact 结合根状生长试验以及蛋白质毒素结晶试验可以准确鉴定出不同菌体形态的蜡样芽孢杆菌。
在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)平板上典型蜡样芽孢杆菌菌体形态有多种类型时应该选取有代表性的数量进行鉴定,蛋白质毒素结晶试验中菱形蛋白结晶体的判断是区分苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的关键性确证指标。
关键词:蜡样芽孢杆菌;菌落形态;菌株鉴定蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)广泛分布于自然界中,近年来在各类食品中的检出率较高。
蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种,为革兰氏阳性杆菌,兼性需氧,形成芽孢,引起食物中毒的菌株多为周身鞭毛,有动力[1]。
根据《香港食品微生物含量指引(2014 修订版)》,一般即食食品中含有超过105 CFU·g-1 蜡样芽孢杆菌,可能危害食用者的健康或不宜供人食用,如污染菌量小则不足以致病[2]。
在我国,蜡样芽孢杆菌的检出则主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
蜡样芽孢杆菌可引起呕吐型和腹泻型食物中毒。
呕吐型食物中毒主要由低分子量的呕吐毒素(Cereulide)引起[3],该毒素常在米饭类食品中被检出,耐热,耐蛋白酶水解酶,对酸碱稳定,高温121 ℃处理30 min仍不失活[4-5]。
腹泻型食物中毒主要由腹泻毒素引起,能导致腹泻型胃肠炎。
在日常检验工作中发现,苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)平板上的形态特征、生理生化特征非常相似,而且有着极高的DNA同源性,这时检验结果的准确性显得相当重要。
蜡样芽孢杆菌国标检测方法
蜡样芽孢杆菌国标检测方法蜡样芽孢杆菌是一种常见的致病菌，可以引发许多疾病，比如肺炎、食物中毒等。
因此，对于蜡样芽孢杆菌的检测方法非常重要。
目前，我国规定的蜡样芽孢杆菌国标检测方法共包括以下几个步骤：首先，样品前处理。
在此步骤中，需要将待检样品样品进行预处理，确保样品中的蜡样芽孢杆菌含量达到检测标准。
一般而言，对于不同类型的样品，处理方法也会有所不同。
比如在食品及饲料中检测，可以添加适当数量的生长因子，利于蜡样芽孢杆菌的生长和繁殖；在水及废水中检测，需要进行过滤、浓缩等步骤，以提高样品中菌落的数量。
其次，培养。
在此步骤中，待检样品需要在适当的培养基上进行培养，并采用适宜的培养条件和温度，使蜡样芽孢杆菌营养生长，并清晰地表现出其形态特征。
比如在肉汤杨氏平板上进行培养，在37℃下进行孵育，并对培养基的pH值和氧气浓度进行控制，以确保蜡样芽孢杆菌可以正常生长。
第三，菌落特征的观察。
在此步骤中，需要对培养出的蜡样芽孢杆菌菌落的特征进行观察。
一般而言，蜡样芽孢杆菌的菌落呈灰白色，中心较高，表面光滑细腻，菌体呈杆状，染色后呈青紫色，有时并可呈蓝绿色。
最后，进行鉴定和计数。
在此步骤中，需要对菌落进行进一步的鉴定和计数。
一般而言，可以采用荧光抗体技术、PCR扩增等方法进行检测，以确保检测结果的准确性和可靠性。
以上就是针对蜡样芽孢杆菌国标检测方法的详细介绍。
对于我们日常生活中经常遇到的食品、水源等，如果能够采用这些方法进行检测，那么对于保障我们的健康会起到非常重要的作用。
同时，也提醒大家在生活中注意卫生，遵守食品安全规定，以免受到蜡样芽孢杆菌等致病菌的侵害。
设备清洗后顶水的疑似蜡样芽胞杆菌检验方法
设备清洗后顶水的疑似蜡样芽胞杆菌检验方法
1、常规鉴定方法
传统检测方法是将分离培养后的可疑菌落做生化反应试验，溶血试验，协同溶血试验，动物试验，典型运动等鉴定，被确定为蜡样芽孢杆菌后进一步进行血清分型。
目前我国常用的蜡样芽孢杆菌的检验方法是国标法GB4789.14-2003，以及行业标准SN/T0176-1992（进出口食品蜡样芽孢杆菌检验方法）和SN/T 255211-2010（乳及乳制品微生物学检验方法）。
目前检测方法中常用的选择性培养基主要有蜡样芽孢杆菌选择琼脂（PEMBA）、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基（MYP），显色养基主要是BCM。
PEMBA已经是化标准组织（ISO）公认的检验蜡样芽孢杆菌的选择性培养基，主要用于临床样本。
MYP广泛用于蜡样芽孢杆菌的分离和计数。
BCM 和MYP相比菌落技术和分离更容易，有较高选择性，能形成离散的不连在一起的菌落。
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蜡样芽胞杆菌及检验
在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8版中，蜡样芽胞杆菌的分类地位为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。
根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。
1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。
一、生物学特性
1、形态特性
蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。
引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力。
2、培养特性
蜡样芽胞杆菌生长温度为25-37℃，最佳温度30-32℃。
在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。
在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状。
偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。
在甘露醇��卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。
3、生化特性
b+/-，50-50% 菌株是阳性；
c-， 90-100% 菌株是阴性；
d-，绝大多数菌株是阴性。
4、耐热性
蜡杆芽胞杆菌耐热，其37℃16小时的肉汤培养物的D80℃值（在80℃时使细菌数减少90%所需的时间）约为10-15分钟；使肉汤中细菌（2.4×107/mL）转为阴性需100℃20分钟。
其游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。
二、流行病学
1、细菌分布
蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。
已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。
在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。
2、流行情况
蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。
蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。
引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。
中毒的发病率较高，一般为60-100%。
但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。
1985年9月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调查所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。
3、临床症状
当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中
毒。
蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。
呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。
腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。
三、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生肠毒素。
它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。
致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。
致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。
A、样品制备
无菌操作称取样品50g放入灭菌搅拌缸内。
加Butterfield�s磷酸盐缓冲稀释液450mL，以高速（18.000-21.000rpm）均质2min。
用上述1:10稀释液，连续稀释供蜡样芽胞杆菌计数。
B、蜡样芽胞杆菌平板计数
移取10mL均质样液（1:10稀释）加到90mL空白液中，从10-2到10-6制备一系列稀释液，充分混匀，并继续稀释直到10-6为止。
取样品的各个稀释液（包括1:10）0.1mL接种2只MYP（甘露醇一卵黄多粘菌素琼脂）平板，用灭菌玻璃棒在每只平板表面涂布均匀。
将平板置30℃培养24小时，并检查菌落周围有沉淀圈者，表示产生卵磷脂酶。
蜡样芽胞杆菌菌落通常是粉红色，随着培养时间的延长则更明显。
如果上述反应不
清晰，应将平板再培养24小时后计数，从MYP平板上挑取典型菌落5个或更多，移种到营养琼脂斜面上供蜡样芽胞杆菌证实试验用。
C、蜡样芽胞杆菌的最大近似数
MPN技术被推荐用于食品中低于10个/g蜡样芽胞杆菌的检验。
某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。
在胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中接种3管MPN系列，10-1、10-2、10-3的稀释液各接种1mL于3管。
将培养管置30℃培养48±2小时，检查生长密集、典型的蜡样芽胞杆菌。
将阳性管培养物划线接种于MYP平板，于30℃培养24-48小时。
以下步骤同B。
D、蜡样芽胞杆菌的证实试验
从MYP琼脂平板上挑取5个或更多的伊红粉色，卵磷脂酶阳性的菌落，移种到营养琼脂斜面上，置30℃培养24小时。
取培养物作了革兰氏染色和显微镜观察。
再用3mm直径的接种环取培养物到装有0.5mL灭菌磷酸缓冲稀释液的13×100mm试管中，充分混悬均匀。
用于下列试验。
·酚红葡萄糖肉汤
·硝酸盐肉汤
·改良的V-P培养基
·酪氨酸琼脂
·溶菌酶肉汤
·MYP琼脂
蜡样芽胞杆菌的分离物应符合下述条件。
1)革兰氏阳性产芽胞大杆菌，其芽胞不突出体外；
2）在MYP琼脂上产生卵磷脂酶而不发酵甘露醇；
3）厌氧培养生长，发酵葡萄糖产酸；
4）还原硝酸盐；
5）VP阳性；
6）分介L-酪氨酸；
7）在含0.001%溶菌酶的培养基中能生长。
E、蜡样芽胞杆菌群的鉴别试验
从表1可见D部分所述的生化特性为蜡样芽胞杆菌群所共有。
要鉴别典型蜡样芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌群的其它种还需进一步进行下述试验。
·动力试验
·根状生长试验
·溶菌活性试验
·蛋白质毒素结晶试验
蜡样芽胞杆菌具有动力、强溶血、不形成根状菌落，或不产生蛋白
质毒素结晶。
蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18%的条件下仍能存活或生长。
通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。