PCR HPV-DNA荧光定量检测标准操作程序
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
HPV荧光PCR
人乳头状瘤病毒（HPV）实时荧光定量PCR 培训大纲一、实时荧光定量PCR技术所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。
与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR产物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。
这是DNA定量技术的一次飞跃。
1、实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR 反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。
在探针完好的状态下，5′端报告荧光基团的激发光被3′端的淬灭荧光基团所抑制。
PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5′→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。
通过定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期。
软件通过标准品的待测品的对数期比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。
1.1 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
图1. Ct值的确定1.2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SD cycle 6-151.3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
荧光定量PCR仪操作流程资料
荧光定量PCR仪操作流程1、开启电脑，并打开Smart Cycler开关,启动Smart软件，系统用户名为Smart，密码为Cycler。
若Create Run 图标非灰色，表明机器已与电脑连接，否则应重新连接，直至Create Run 图标变亮。
2、定义一个程序⑴. 点击Define Protocols 图标。
⑵. 点击New Protocols 图标。
⑶. 输入一个独特的程序名。
⑷. 输入热循环参数。
⑸.点击Save Protocol按钮。
3、创建运行⑴. 点击Create Run 图标。
⑵. 输入一个Run Name。
⑶. 选择Dye Set。
⑷. 点击Add/Remove Site按钮⑷a. 突出一个程序名。
⑷b. 突出位点。
⑷c.点击右箭头。
⑷d.重复⑷a-⑷c步骤直到所有程序和点都被选定。
⑸.点击OK。
⑹.点击Start Run按钮。
4、实时监控反应过程（这一步可省）5、实验完毕，分析实验结果运行开始后，程序会自动切换到View Results栏。
在运行过程中，用户能实时监控温度和光学数据，选择图表，分析设置和样品类型信息。
在运行完成前后及运行期间，分析设置、图表和样品类型信息可以改变。
运行过程中，可以查看存在电脑中的以前的运行。
6、保存并输出实验数据⑴点击View Results显示栏的Export按钮。
⑵检查输出数据类型。
⑶点击Export Data根目录里的Export按钮。
⑷从Look In下拉菜单里选择一个文件夹。
程序默认为Smart Cycler文件夹里的Export文件夹。
⑸.输入一个文件名或接受一个默认的文件名，点击Save。
生物技术中心仪器管理人：李红兵2006年10月15日。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
PCR法检测HPV
PCR法检测HPV引言PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可以在短时间内扩增DNA分子。
本文将介绍PCR法在检测人状瘤病毒（HPV）中的应用。
HPV简介HPV是一类寄生病毒，可以感染人类的皮肤和黏膜，特别是性传播器官，其感染与许多疾病如人类状瘤、宫颈癌等密切相关。
因此，及早检测和诊断HPV感染对预防和治疗相关疾病具有重要意义。
PCR法在检测HPV中的应用PCR法可以通过扩增和检测HPV的DNA片段来确认HPV感染。
以下是PCR法检测HPV的步骤：1. 样本采集：从患者的皮肤或黏膜中采集病毒样本，例如宫颈脱落细胞样本。
2. DNA提取：使用化学方法将样本中的DNA提取出来，以便后续的PCR扩增。
3. PCR扩增：利用特定的引物和酶，将HPV DNA片段扩增为大量复制物。
4. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA标准分子进行凝胶电泳分析，以确认是否存在HPV DNA。
PCR法检测HPV的疗效和限制PCR法具有以下优点：- 灵敏度高：可以检测到极低浓度的HPV DNA，即使在感染早期也能够准确诊断。
- 特异性强：由于引物的特异性，PCR法可以准确区分不同类型的HPV DNA。
- 结果快速：PCR法能够在几个小时内获得检测结果。
然而，PCR法也存在一些限制：- 假阳性结果：由于实验室操作和污染等因素的影响，有时可能出现假阳性结果。
- 无法区分活动感染和残留病毒：PCR法只能检测到HPV DNA的存在，无法确定感染是否处于活跃状态。
- 资源需求高：PCR法需要专业实验室和设备支持，对设备、试剂等资源有一定要求。
结论PCR法是一种常用、灵敏和可靠的方法来检测HPV感染。
该方法在早期诊断、预防和治疗相关疾病中具有重要作用。
然而，为了提高检测准确性，减少假阳性结果的发生，操作者应严格控制实验条件，并采取相应的对照试验和质量控制措施。
人乳头瘤病毒型核酸检测标准操作规程(PCR-荧光探针法)_重复
人乳头瘤病毒6,11型核酸检测标准操作规程（PCR－荧光探针法）1.目的：规范人乳头瘤病毒(HPV)6,11型核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围：PCR实验室。
3.职责：3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：4.1《中山大学达安基因股份有限公司人乳头瘤病毒（6,11型）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书》4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：采用一对特异性引物和一条特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测人乳头瘤病毒（HPV）6,11型DNA。
5.3 性能参数：5.3.1 检测下限： 5.0×102基因拷贝/ml。
5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。
5.4.1.1 男性尿道分泌物：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
5.4.1.2 女性生殖道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
5.4.1.3 女性尿道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
02 HPV病原体(流式荧光法)测定标准操作规程
人乳头状瘤病毒病原体检测(流式荧光法)标准操作规程一、检验目的人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)病原体检测用于临床尖锐湿疣体表面脱落细胞，妇女宫颈细胞及宫颈粘液标本中26种HPV病毒DNA的分型检测。
可作为HPV感染的辅助诊断。
二、适用范围1. 适用于下生殖道分泌物、宫颈脱落细胞等样本的采集，接受，处理，检测及报告。
2. 适用仪器：ABI7000 PCR扩增仪、LIFE EXPRESS基因扩增仪、Luminex200流式分析仪。
三、方法原理本试剂盒系由人乳头状瘤病毒(HPV)核酸提取试剂、HPV杂交检测试剂等组成。
用Chelex-100树脂法抽提宫颈脱落细胞基因后，采用多重PCR技术对DNA进行扩增，并以流式荧光杂交法对扩增产物进行检测分析，判定样品中是否存在HPV。
多重PCR可有效扩增HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66共13种高危亚型，此外还可以有效扩增HPV6、11、40、42、44、53、54、55、56、61、68、73、83等亚型。
微球杂交液中包含多种荧光编码微球，每种荧光编码微球的表面都共价交联有寡核苷酸探针，在杂交过程中探针特异性识别并结合PCR产物中的靶序列，再经过和荧光素反应后形成微球－探针－扩增产物－荧光素的复合物，经Luminex流式分析仪阅读时，可获得该复合物的微球编码及荧光强弱信号，最后经过透景HPV专用的分析软件判定相应的检测结果。
四、性能指标1. 检测灵敏度：本试剂盒的最低检测限为10-20拷贝(0.02ng/ml)2. 检测特异性：阳性参比品符合率：试剂盒对26种HPV亚型的阳性参比品进行2次平行坚持测，结果均为阳性。
阴性参比品符合率：试剂盒对正常人基因组参比品进行2次平行检测，结果均为阴性。
3. 检测重复性：分别对HPV16、HPV18、HPV31、HPV45和 HPV33共5种高危亚型阳性参比品进行10次平行检测，结果一致且准确。
PCR-HPV-DNA荧光定量检测标准操作程序
P C R-H P V-D N A荧光定量检测标准操作程序(总4页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除1.目的：明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行巨细胞病毒核酸定量的检测。
2.适用范围：适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。
适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术样品要求：宫颈脱落细胞3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂盒。
5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒6.标准操作：试剂准备（在试剂准备区操作）将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱，反复冻融不可超过三次），取出PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000转/分钟10s从试剂盒中取出DVA聚合酶，8000转/分钟lOs。
根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管= MIX + DVA聚合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1空白管对照+1管阳性对照) 取PCR反应管转移至样本制备区。
样本处理(在样本处理区进行)取宫颈脱落细胞样本0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1)13000转/分钟离心1分钟弃上清，加入细胞保存液重悬细胞13000转/分钟离心1分钟，尽量弃干净上清每样本加入50ul细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10分钟。
13000转/分钟离心10分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA)。
取上清作为PCR扩增的模板，其余保存于一20℃在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样本DVA,空白对照、阳性对照，盖紧管盖，稍做离心(反应总体积为2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照)。
荧光pcr检测操作流程
荧光pcr检测操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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荧光定量PCR实验标准操作 SOP
荧光定量PCR实验操作SOP一、实验目的通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结果的分析。
二、实验准备：1. 进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR 操作实验室需紫外灯照射15 分钟，关闭紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。
2. 进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR模板污染。
3. 实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。
4. 准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR 实验操作的耗材（要求无菌）1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、1.5ml 离心管，用于荧光定量PCR 操作的试剂: 荧光定量PCR Master Mix、H2O，DNA 或cDNA 模板（注意必须在配制完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）.5. 一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
6. 实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。
三、实验步骤：1. 荧光定量PCR MIX 的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix 按照20uL反应体系内容如下：Primer F: 0.8ul(0.4uM)Primer R: 0.8ul(0.4uM)2×TB Green Premix: 10ulROX: 0.4ulH2O: 6ulMIX Total: 18ulMIX配制通常准备10%冗余量。
2. MIX 配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA 小心加入装有反应液体的反应管内：DNA/cDNA Template: 2ul(<100ng)荧光定量PCR 反应总体积：20ul.3. 模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；4. 严格按照荧光定量PCR 仪的操作手册启动仪器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR 扩增程序、荧光定量PCR 样品孔信息），保存文件，最好以日期及样品名称命。
HPV SOP - 不带提取
人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒（荧光PCR 法）标准操作流程一、目的：规范实验室操作，正确使用PCR扩增仪进行HPV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。
二、适用范围：人乳头状瘤病毒(HPV)基因分型检测试剂盒在扩增仪上进行扩增以及分析。
三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：【检验方法】1. 试剂准备（试剂准备区）a) 从-20℃取出试剂盒，将各试剂融化混匀并短暂离心后备用。
计算需要进行的反应份数n （n=待测样本数+空白对照1份+阳性对照1份）。
b) 取出8个离心管分别标记1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#和8#，分别加入n×10μl 核酸扩增反应液，然后对应每个编号离心管分别加入n×8μl A反应液（1#）、n×8μl B反应液（2#）、n×8μl C反应液（3#）、n×8μl D反应液（4#）、n×8μl E反应液（5#）、n×8μl F反应液（6#）、n×8μl G反应液（7#）、n×8μl H反应液（8#）。
c) 混匀并短暂离心后，依次分装至对应编号PCR八联管中，每管18μl，总共分装n排PCR 反应八联管，1排PCR八联管为1人份。
2. 加样（1）小心打开PCR八联管盖，每份待测样本核酸溶液、空白对照按照2μl/管依次加入对应编号含有A-H反应体系的PCR八联管中，1排PCR八联管为1人份，阳性对照（A-H组）同样按照2μl/管分别加入对应的A-H反应体系的PCR八联管中，总体积为20μl/管。
（2）盖紧PCR八联管盖，低速短暂离心。
3. PCR扩增检测（核酸扩增区）3.1 将反应管放入荧光PCR 扩增仪进行扩增检测。
4. 结果分析4.1 杭州博日Linegene 9600荧光定量PCR仪：反应结束保存结果，根据分析后图像调节基线的起始循环、终止循环（可以根据实际情况自行调整，起始循环可以在3~15、终止循环可设在5~20，调整空白对照的扩增曲线平直或低于阈值线；也可由仪器进行自动判读，起始循环为3、终止循环为15），点击确定自动获得分析结果，在同一界面的显示区察看结果。
HPV操作步骤
步骤
注意事项
同时准备
转移PCR管里的液体50μl至10ml离心管
争取一次性吸取成功
PCR管在冰水混合盒一般放置2分钟以上再转移，从蜡中心突破
用无水乙醇将枪头擦拭
水浴恒温摇床杂交1小时
一定要盖好盖子并且尽量固定，同时控制好时间
是否固定可以摇荡看看
膜条取出置于蒸馏水管漂洗同时弃10ml离心管
这里也可以同时pcr管编号转移标本液约1ml于1ml的离心粘液不要吸取不要过猛不接触离心管内圈离心5分钟12000开干式恒温仪去上清液倒准备吸纸或用移液枪沿页面慢慢吸下去加生理盐水震荡至均匀酌情加入该步离心5分钟12000或者这步开干式恒温仪去上清液倒准备吸纸或用移液枪沿页面慢慢吸下去加入dna提取液50并震荡至均匀这里注意吸取上珠子放入干式恒温仪10010分钟键调节时间必须要100才能放入并计时这里可以配杂i杂ii溶ii
洗净结合管
倒掉杂II，加入溶II
这里不用将膜条取出，直接水浴恒温摇床，摇到显色液配好即可
配置显色液。每条膜条：
3ml溶II+0.3ml溶III+1.5μl溶IV。溶III最后加，最关键
倒掉溶II，将膜条转移至显色管，显色5分钟
洗净洗脱管
若是前面忘了配一管蒸馏水，这里可以配，但是要放在水里预热
膜条从显色管里取出放入蒸馏水管稍微漂洗（约1~2分钟）
结合液配好后，便可以将膜条从蒸馏水管里取出放入结合液中。结合液、洗脱液、显色液要现配
配结合液，以5条膜条为基数：15ml杂I+40μl溶I。即每条膜条为：3ml杂I+8μl溶I。
结合管里水浴恒温摇床10分钟
洗净蒸馏水管，再配一管蒸馏水放于水浴恒温摇床预热
PCR HPVDNA荧光定量检测标准操作程序.pptx
2. 适用范围： 1. 适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。 2. 适合仪器：LightCycler480 型核酸扩增荧光检测仪 3. 方法原理：采用 PCR 方法结合荧光探针的扩增技术 4. 样品要求：宫颈脱落细胞 3. 职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂 盒。
Rate
Mode
(min:sec) (℃/sec)
Analysis Mode
1ห้องสมุดไป่ตู้
1
95
10:00min 20
None
None
95
2 45 60
15sec
20
None
None
60sec
Single Quantification
3
1
38
5sec
20
None
None
5. 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6.将待反应的 PCR 反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在 程序中设定好样孔位置。 7. 按仪器操作规程开始循环。
2. 样本处理(在样本处理区进行)
1. 取宫颈脱落细胞样本 0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到 2m1)
2.
13000 转/分钟离心 1 分钟
3. 弃上清，加入 0.5m1 细胞保存液重悬细胞
4.
13000 转/分钟离心 1 分钟，尽量弃干净上清
5. 每样本加入 50ul 细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸 10 分钟。
5. 质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6. 标准操作： 1. 试剂准备（在试剂准备区操作） 1.将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱， 反 复冻融不可超过三次），取出 PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000 转/分钟 10s 从试剂盒中取出 DVA 聚合酶，8000 转/分钟 lOs。 2.根据当次实验标本量，取出相应试剂（1 管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚 合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为 n (n=标本数+1 空白管对照+1 管阳性对照) 取 PCR 反应管转移至样本制备区。
HPV-DNA标本处理的标准操作程序1
×××院临床分子生物实验室质量手册文件编号：序号：共 2 页第版第次修改主题：HPV-DNA标本处理的标准操作程序颁布日期：HPV-DNA标本处理的标准操作程序一、目的：规范临床分子生物实验室对临床标本的处理，提高检测结果的准确率。
二、适用范围：人乳头状瘤病毒（HPV）基因微阵列分型检测试剂盒。
三、职责：由临床分子生物实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：1、将样本及阴性对照品置室温解冻，按习惯将标本编号，按相应数量取出样本管，对应编号。
2、有效细胞的收集：2.1 对于宫颈脱落细胞标本，先振荡混匀临床样本10秒，取800μl临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液（若收集到的有效细胞太少的话，可再次吸取取800μl临床样本加入样本管，14000rpm离心5分钟，去上清液）；2.2 对于男性标本（棉拭子），先加入1ml生理盐水，充分振荡洗脱细胞，倒出洗脱液，14000rpm离心5分钟，去上清液；2.3 对于血液太多的临床标本，可将收集到的细胞用已灭菌的蒸馏水漂洗一次，再离心收集细胞。
3、加入400μl溶液Ⅰ(如果出现沉淀应在45 ℃水浴中预热)，将收集到的细胞振荡混匀，在100 ℃煮沸15分钟。
4、从沸水中取出样本管，点动离心，开盖，加入400μl溶液Ⅱ，混匀后，室温下放置2分钟后，14000 rpm离心5分钟，将上清液倒入废液缸，14000rpm离心1分钟，用200μl移液器，轻轻将剩余的上清液吸尽，枪头切勿碰到离心沉淀方向的管壁，以免将DNA吸掉。
5、开盖静置至少2分钟，加入60μl溶液Ⅲ充分溶解，静置10分钟。
14000rpm离心1分钟取1μl样品做PCR检测, 或者贮存-20℃冰箱中备用。
HPV 样本处理流程图此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
荧光定量PCR仪操作规程
荧光定量PCR仪操作规程1．开机程序（1）打开电脑，进入桌面。
（2）打开PCR仪器的电源开关（注：该仪器有两个电源开关，一个控制PCR 仪，一个控制光源系统）。
（3）双击桌面上的软件图标，点击“yes”,进入软件的主菜单。
(4)或打开开关，视窗上显示“SELF TEST”，显示10秒中后，显示RUN-ENTER 菜单：“RUN ENTER PROGRAM”准备执行程序。
2．关机程序(1) 保存数据，退出软件的主菜单。
(2) 关掉电脑，关闭PCR仪器的电源开关。
3.程序文件的设置及打开(1)实验程序已预先设定点击软件左方主目录中的“Library”，进入该界面后。
选择“ViewProtocol(查看协议)”页面，根据路径，找到预存的程序文件。
放入样本管，关紧盖子。
运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：“-ENABLE DISABLE HEATED LID” 按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。
(2)创建新的程序文件点击软件左方主目录中的“Workshop”，进入该界面。
选择“Edit Prot ocol”页面，输入相应的温度、时间、重复的循环数（Repeats），增加或删除步骤（Cycle和Step），在“Select data collection step（s）”中选择需要进行荧光收集的步骤。
完成后，在“Protocol Filename”中输入程序的文件名，点击“Save this protocol”。
如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕显示“ -NEW LIST EDIT DELET”，按《Proceed》，1）选择NEW，命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认。
输入程序步骤：名字输入后，显示“ STEP1TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》则可以输入温度（0～100℃），按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于测量特定DNA序列数量的技术。
它可以快速、准确地定量检测目标DNA的含量，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析等领域。
下面将介绍荧光定量PCR实验的步骤。
一、实验前准备在进行荧光定量PCR实验之前，需要做好实验前的准备工作。
1. 设计引物和探针：根据目标DNA序列设计引物和探针，确保其特异性和互补性。
2. 准备模板DNA：从样品中提取目标DNA，并进行纯化和定量。
3. 制备PCR反应体系：根据PCR反应的需要，准备好PCR反应体系，包括引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等。
4. 验证引物和探针的特异性：使用目标DNA和非目标DNA进行聚合酶链式反应，通过凝胶电泳验证引物和探针的特异性。
二、荧光定量PCR实验步骤1. 反应体系配置：按照实验设计，配置好PCR反应体系。
将引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等加入反应管中，然后加入适量的去离子水。
2. PCR反应条件设定：根据引物和探针的特性，设定PCR反应的温度和时间参数。
一般来说，PCR反应包括预变性、变性、退火和延伸四个阶段，其中变性温度为95℃，变性时间为30秒，退火温度为60℃，退火时间为30秒，延伸温度为72℃，延伸时间根据目标片段的长度而定。
3. PCR反应体系装入仪器：将装有PCR反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪器中。
4. 荧光定量PCR实验运行：启动荧光定量PCR仪器，按照预设的PCR反应条件进行PCR反应。
仪器会根据设定的温度和时间参数进行PCR反应，并实时检测荧光信号。
5. 数据分析与结果解读：荧光定量PCR仪器会自动记录PCR反应过程中的荧光信号，根据荧光信号的变化可以计算出目标DNA的数量。
通过对比不同样品的荧光信号差异，可以定量分析目标DNA 的含量。
妇科pcr检测操作流程
妇科pcr检测操作流程
妇科PCR检测是一种常用的检测方法，用于检测女性生殖系统相关疾病的存在。
下面将介绍妇科PCR检测的操作流程。
首先，进行妇科PCR检测前，需要准备好所需的实验器材和试剂。
实验器材包括PCR仪、离心机、移液器等，试剂包括PCR试剂盒、引物、酶等。
接着，收集患者的样本。
妇科PCR检测通常采集的样本包括宫颈分泌物、阴道分泌物等。
在采集样本时，需要确保样本的纯净度和完整性，避免外界污染。
然后，进行DNA提取。
将采集到的样本放入离心管中，加入DNA提取试剂，经过离心等步骤，将样本中的DNA提取出来，以备后续PCR反应使用。
接下来，进行PCR反应。
将提取的DNA加入PCR试剂盒中，加入引物和酶，设置PCR反应条件，进行PCR扩增反应。
PCR反应的条件包括温度、时间等参数，需要根据具体的实验要求进行设置。
最后，进行PCR产物分析。
将PCR反应产物进行电泳分析，通过电泳图谱来判断目标基因是否存在，从而判断患者是否患有相关疾病。
总的来说，妇科PCR检测是一种简单、快速、准确的检测方法，可以帮助医生及时发现和诊断女性生殖系统相关疾病。
在进行妇科PCR检测时，需要注意操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望以上介绍对您有所帮助。
HPV DNA检测标准操作程序
入空白对照、阳性质控、阳性DNA对照，建议加样编号顺序如下：首先依次是不同的样本编号，最后为阳性质控、阳性DNA对照、与空白对照管（蒸馏水）。
6.2.3 从冰箱中取出PCR试剂盒，将PCR Premix融化后，与Taq酶管一起放入离心机中点动离心。
6.2.4 将试剂放入生物安全柜内，将已点动离心了的PCR premix管、Taq酶管插在冰块上保持在低温条件下。
6.1.6 按照反应数计算所需的PCR各个组份的数量来准备PCR Mastermix（可参照PCR MIX与酶混合比例如下表）。
6.2.7 在生物安全柜内，按已计算好的PCR premix用量，从冰中取出相应的PCR premix管吸取准确量后加入对应的1.5ml离心管中，将PCR premix管放回冰块中。
6.2.8 垂直将枪头小心打入废液缸中，确保移液枪前臂没有碰到废液缸口。
6.2.9 从冰中取出Taq酶管，按计算好的用量（可参照PCR MIX与酶混合比例附表），吸取准确量后分别加入对应的1.5ml离心管中。
6.2.10 盖紧1.5ml离心管盖，同时将PCR premix管及Taq酶管从超净台中取出放回-20℃冰箱的原包装中，标注已使用数量。
6.2.11 将已加入PCR premix和Taq酶的1.5ml离心管在涡旋器上振荡5sec，放入离心机点动离心。
6.2.12 在生物安全柜中，将6种PCR混合液分装入对应的0.2ml PCR扩增管中，每管加入混合液18ul，加完后将所有PCR管盖盖上。
6.3 DNA提取6.3.1将临床样本及阴性对照品置室温下解冻，把标本编号，取出相应数量的样本管，对应编号。
6.3.2 将临床样本振荡混匀，伸入采集管底部吸取临床样本0.8ml 至管底，。
PCR-DNA荧光定量实验步骤及注意事项
Slan+YMDD试剂操作PCR-DNA实验注意事项1．加样方面（混匀，不要有气泡，管壁上不要有液体）2．试剂方面（冷冻，不宜反复冻融超过3次；可分装）3．使用非肝素钠抗凝剂采血管4．实验室方面（实验做完注意通风、84清理台面、紫外线杀菌）5．注意污染（平常配试剂管盖的放置不要污染、加样时指甲及手套不要碰到管内壁）实验操作步骤1.室温融解2.取血清（或标准品）50ul 加入50ul 核酸提取液先震荡混匀10秒然后6000转瞬间离心一下（等离心机转速到了接近6000按停止）99度水煮或干浴10分钟，稍微弹碎；然后13000转离心10分钟保留上清液备用3.配混合液取N*36ul 混合液+ N*0.4ul TAQ酶混匀（先震荡混匀10秒然后6000转瞬间离心）（N为管数，实际上我们要取N+1 因为加样管壁上会沾液不多配会导致最后一个有误差例如有10个样本则取11*36+11*0.4；）4.取上述混合液36.5ul分别加入pcr反应管不要有气泡管壁不要有水珠5.加样取4ul上清液加入pcr管加样枪在液体里面反复打个7~8下最后在离心机稍微离一下6000转瞬间离心6.上机反应检查管壁水珠气泡实验结果方面1.标准曲线相关系数至少为-0.99 越小越好2.根据曲线分析结果（曲线是否稳，无波浪）38循环曲线抬头为阴性实线抬头曲线不抬头为YMDD变异（实线---病毒量虚线---判断有无变异）21个循环值大概为7次方后面加3.5个循环减少一个次方即24.5左右为6次方......上述操作不一定全正确，请自行参考各试剂厂试剂说明书以及检验方面相关资料此文本仅为学习方便之途，为Vrirus实验当中自己理解，与各位互相分享学习Virus编辑于2013解释权归Virus所有联系:ooo788@。
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进行巨细胞病毒核酸定量的检测。
2.适用范围：
2.1适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。
2.2适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪
2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术
2.4样品要求：宫颈脱落细胞
3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂盒。
5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒
6.标准操作：
6.1 试剂准备（在试剂准备区操作）
6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱，反复冻融不可超过三次），取出PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000转/分钟10s从试剂盒中取出DVA聚合酶，8000转/分钟lOs。
6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管=1
7.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1空白管对照+1管阳性对照) 取PCR反应管转移至样本制备区。
6.2样本处理(在样本处理区进行)
6.2.1.取宫颈脱落细胞样本0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1)
6.2.2. 13000转/分钟离心1分钟
6.2.3.弃上清，加入0.5m1细胞保存液重悬细胞
6.2.4. 13000转/分钟离心1分钟，尽量弃干净上清
6.2.5.每样本加入50ul细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10分钟。
6.2.6. 13000转/分钟离心10分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA)。
6.2.7取上清2.0ul作为PCR扩增的模板，其余保存于一20℃
6.2.8在对应的PCR反应管中分别加入2ul处理好的样本DV A,空白对照、阳性对照，盖
紧管盖，稍做离心(反应总体积为2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照以及一个空白对照)。
转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序
6.3 PCR扩增（在扩增区操作）
6.3.1打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.3.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.3.3设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;Passive Reference选择none(见表1)
表1: 设置四种荧光检测通道
6.3.4将循环条件设定为
6.3.5检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.3.6将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好样孔位置。
6.3.7按仪器操作规程开始循环。
6.3.8扩增结束后取出PCR反应管，关闭扩增仪电源，反应管直接放入焚烧垃圾桶内。
6.3.9分析数据，在Analysis Notes窗口中注明检测基线值、试剂批号、阳参批号
等相关信息，进行结果分析。
6.3.10关闭计算机。
6.4检验结果判断：
6.4.1基线，阂值的设定:基线的确定为:取3-15个循环的荧光信号:阈值设定:使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值为Under
6.4.2质控对照
1阴性对照Ct值均应显示为Undet
2阳性对照Ct值≤36
3内对照β-globin在Cy5通道Ct值≤40
符合以上三个条件，此反应是为有效
6.4.3结果判断
1样本在FAM、HEX、ROX通道Ct值显示为Undet，内对照β-globin在Cy5通道Ct值≤40,判断为阴性
2样本在FAM、HEX、ROX通道Ct值≤40, 内对照β-globin在Cy5通道Ct值≤40判断为阳性
3若样本在FAM、HEX、ROX通道40<Ct值<45的样本建议重做，重做结果Ct值<40者为阳性，否则为阴性
7.支持性文件：
7.1 《高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR一荧光探针法)》说明书（潮州凯普生物化学有限公司）
7.2 检测结果报告程序。
7.3 LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪说明书
8.此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。