现代食品发酵技术教案 柠檬酸

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第四章柠檬酸

教研室：生物工程教师姓名：陆步诗、余有贵

0级食品质量与安全方2H.2007,2009 教学过程

4.1生产流程

4.2原料预处理

薯干经粉碎，以16％～20％的比例在调浆罐中加水调浆，pH自然5.5；添加0.1％中温型α-淀粉酶，0.070MPa液化10～15min；过滤除渣；通过(NH)S0计量罐控制并调节培养基中含氮量为

90％～85％；连续灭菌后，泵入已灭菌的发酵罐中，装料量为发酵罐体积的0.4％～0.2．442％。

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4.3菌种及其扩大培养

1、菌种采用薯干原料进行液体深层通气发酵的菌株主要有黑曲霉Co827(上海工业微生物研究所选育)和黑曲霉T419(天津工业微生物研究所选育)，此二菌株具有糖化力高、产酸力强、发酵周期短、产物单一的特点，同时还具有营养要求低、耐高浓度柠檬酸、遗传性状稳定等优良性状，发酵60～90h，产酸率可达15％～20％，糖化率在97％以上，已被大多数厂家采用。

2、扩大培养

根据黑曲霉在实验室扩大培养阶段获得的是孢子还是菌丝体，其扩大培养分为孢子扩大培养和麸曲扩大培养2种方式。孢子扩大培养是利用液体或固体表面培养，收集黑曲霉孢子，再进行种子罐扩大培养或直接进行发酵盘液体浅层发酵生产柠檬酸；麸曲扩大培养是利用固体醅培养出黑曲霉菌丝体，再进行种子罐扩大培养或直接进行曲盘固体浅层发酵生产柠檬酸。

目前，我国普遍采用麸曲扩大培养方式，其工艺流程如下：试管斜面固体菌种的表面培养→250～500mL茄子瓶固体表面培养→1000～2000mL三角瓶麸曲固体表面培养→种子罐液体菌种通气培养。

Be 察氏琼脂培养基或麦芽汁琼脂培养基(10 1)试管斜面固体菌种的表面/。的无酒花麦汁，

培养/。，用碱调10Be55℃糖化3～4h，滤液用水调至％琼脂2)或米曲汁琼脂培养基(1份米曲加4份水，灭菌后，摆放斜面，冷却后，以无菌操作，加热溶化，分装试管，121℃30minpH6.O，加琼脂2％)，待长满茂盛5d2白金耳或0.1mL孢子悬液，32℃培养4～接人已活化好的黑曲霉试管斜面菌种1～的黑曲霉孢子即可使用。500mL～与试管斜面固体培养基相同，加热溶化，分装250 2)250～500mL茄子瓶固体表面培养5mL4茄子瓶，每瓶～5cm厚，121℃30min灭菌、冷却后，采用无菌操作，在试管斜面培养物中加入，待长满茂盛lmL孢子悬液接人茄子瓶固体培养基中，32℃培养6～7d无菌水，制成孢子悬液，将的黑曲霉孢子即可使用。比例混合：(1.O～1.3) 按麸皮(过60目筛)：水=l～ 3)10002000ml三角瓶麸曲固体表面培养～250采用无菌操作，在～2000mL三角瓶，每瓶50～lOOg，121℃30min灭菌、冷却后，后分装1000三角瓶固体～2000mL茄子瓶固体培养物中加入无菌水，制成孢子悬液，将孢子悬液接入500mL1000次，疏后，菌丝长满曲料表面，翻曲1培养基中，进行麸曲固体表面培养。30～32℃培养14～16h ，待长满孢子，制成麸曲即可使用。，翻曲1d2次；再培养3～4d松结块；继续培养自然％的比例在调浆罐中加水调浆，以16％～20pH 4)种子罐液体菌种通气培养薯干经粉碎，灭～15min；过滤除渣；泵入O.15MPa 15min-5.5；添加0.1％中温型α淀粉酶，0.070MPa液化10，以4)S0(NH)计量罐向种子罐中添加0.5％(NHS0％；通过菌的种子罐中，装料量为种子罐的7044224435℃；在种子罐中接入黑曲霉孢子或灭菌，冷却至提高糖化力；搅拌均匀后，实罐0.1MPa 30 min4；通风量根据～50kPa35℃±1℃；罐压维持cfu麸曲，接种量为孢子数10／mL；培养温度控制在2033，为孢子萌10h～6；h／10 m～9，孢子吸水膨胀，通风量保持6h～O：)为例10m以(培养阶段而定

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18／72 mh。种子培养m／h；10h，为菌丝体生长繁殖期，通风量增至36～发期，通风量保持33～

18

不24um(2.0mL／100g，而且菌丝球直径为2．O～2.5、滴定酸度为1.5～28h，当培养液的pH降至 4

cfu／mL时，种子培养结束。超过100um)，菌丝球数目达到(1～2)×104.4 发酵

待发酵罐中发酵培养基冷却至35℃时，利用无菌压缩空气将种子罐中的培养液泵人发酵罐，进行液体深层通气发酵。一般来说，发酵前期(0～18h)为菌丝生长和淀粉糖化阶段(当产酸量与还原糖的总量接近起始可发酵糖总量时，糖化阶段完成)；发酵中后期(18～90h)为柠檬酸合成与积累阶段。

1)接种量的控制在一定范围内，孢子接种量与产酸速率成正比。从理论上讲，菌球体的极限数量与接种孢子数量相等。由于孢子相互吸附以及孢子在发酵液中萌发时菌丝互相缠绕等物理作用，大多数菌丝球是由几个孢子、乃至一团孢子形成的。孢子接种量越大，菌丝球直径越小、越多，产 4

。cfu／mL酸率越高。一般接种量为孢子数10×1028℃，导致长菌和产酸缓慢；高于在黑曲霉液体深层发酵中，温度低于 2)发酵温度的控制

40℃～38℃，甚至可采用18h)，温度控制在3637℃，导致杂酸形成过量。一般来说，发酵前期(0～ 35℃±1℃。～90h)，温度降为高温培养，促进菌丝生长和淀粉糖化；发酵中后期(18，促使淀粉糖化；4.54.O～～18h)，发酵液pH值控制在 (3)发酵液pH值的控制发酵前期(0左右，有利于柠檬酸的合成与积累。研究表明，在黑2.5pH值降至发酵中后期(18～90h)，发酵液以上，容易产生草酸；如3.0pH值在(18～90h)的产酸阶段，如果发酵液曲霉液体深层发酵中后期值下降～90h)pH值升至pH5.0以上，则容易生成葡萄糖酸。另外，为防止发酵中后期(18

果发酵液的碳酸钙，以维持发／L后，在发酵液中添加(5～10)g过快而导致菌体早衰，一般在发酵24～48h pH值水平。酵产酸阶段正常的黑曲霉生长期溶氧分柠檬酸发酵是典型好氧发酵，对氧十分敏感。 (4)通风供氧和搅拌的控制

。当发酵进入产酸期时，在一定范围内，产酸，产酸期溶氧分压不得低于3.2kPa压不得低于1.8kPa3.2kPa溶氧分压下降到10kPa时，产酸速率下降不大；速率几乎与溶氧分压成正比，溶氧分压下降到以下时，产酸能力完全丧失，而且)时，产酸能力基本丧失；溶氧分压下降到

1.8kPa(临界溶氧分压(h.L)／～3)g使产酸速率保持在低溶氧下产酸能力的丧失，很少能重新恢复。通过通风量的控制，(23发酵罐而言，发的水平，如果产酸速率过快，则造成菌体早衰，柠檬酸的最终产量下降。对于50m～0.12(18～90h)，通风量控制在08(0～18h)，通风量控制在O．～0.1vvm；发酵中后期酵前期33自吸式桨叶低搅拌100m110r箭叶涡轮搅拌桨式发酵罐的搅拌速率控制在90～／min，50mO.15vvm。／135rmin。整个发酵期间罐压保持O.1MPa。式发酵罐的搅拌速率控制在，当发酵液中总糖含90h60～ (5)发酵终点控制以薯干粉为原料，黑曲霉液体深层通气发酵至、糖的转化L／～以下、产生的柠檬酸浓度达到／降至残糖含量为／～量自140160gL2gL120155g ％时，可升温终止发酵，泵送至贮罐中，及时进行提取。97％～93率达到．名师精编优秀教案

4.5 提取

柠檬酸提取的方法有钙盐法、萃取法、离子交换法、电渗析法等。但目前国内大多采用钙盐一离子交换法，其工艺流程为：

发酵醪的预处理→过滤→中和沉淀→酸解→净化脱色。

1)发酵醪的预处理新鲜成熟发酵醪升温至75～90℃，温度不宜过高，加热时间不宜过长。其原理是杀死柠檬酸生产菌和杂菌，终止发酵，并防止柠檬酸被代谢分解；使蛋白质变性，絮凝和破坏胶体，降低料液黏度，利于过滤；使菌体中的柠檬酸部分释放。加热温度过高或时间过长，会使菌体破裂自溶，释放出蛋白质，使料液黏度增加、颜色变褐，不利于净化。

2)过滤过滤目的是去除发酵醪中的悬浮物、草酸，尽可能减少滤液的稀释度，把柠檬酸的损失减少到最低限度。其原理是用一种多毛细孔的过滤介质，利用过滤介质两侧的压力差为推动力，使柠檬酸发酵醪的液体通过小孔，得到澄清的滤液，而菌体、纤维等残渣悬浮物被截留、积累在介质表面形成滤饼。过滤效果取决于滤饼的厚度和特性，滤饼达到一定厚度时，才变成真正的过滤介质，为此，开始过滤时流速不宜过大，否则细小颗粒宜穿过介质空隙而未被截留，只有当介质表面积有滤饼时，滤液才变清；由于草酸钙溶解度低于硫酸钙，在一次滤液中加硫酸钙，使生成草酸钙，在复滤时再一并除去。

过滤液质量主要参数：一次滤液柠檬酸(一水)≥9.Og／100mL，悬浮物≤O.1g／100mL；滤饼含水量≤55％～70％，柠檬酸(一水)≤2.5％；复滤液柠檬酸(一水)≥9.0g／100mL，悬浮液≤5mg