《分子诊断项目》PPT课件
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Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变 的发明者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。
随着PCR技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针 杂交定量PCR方法
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4
PCR基本原理
类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板， 利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附 加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补 链的过程。
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5
DNA 合成的必备要素
DNA Polymerase
dNTPs
single-stranded template
primer
编辑ppt
6
定量PCR概念
以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，对PCR起始模板量的定量
编辑ppt
7
常规PCR与定量PCR的比较
反应方式
编辑ppt
19
注意事项
编辑ppt
16
ＰＣＲ与乙肝标志物阳性率比较
── ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─
例数
HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 阳 性 率 (％ )
────────────────────────────────────
threshold=10×SD cycle0-15
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9
Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作 出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷 贝数。
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10
反应液成分
结果检测 结果性质 结果准确性
常规 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶 琼脂糖凝胶电泳 定性 无法区别假阴性、假阳 性
定量 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照 ELISA，或实时荧光检测 定量，或定性
有效识别假阴性假阳性
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8
实时荧光定量PCR原理
８ ６ ＋ ３ ４ ３ ９ .５ ３
４５
＋ ＋ １ ９ ４ ２ .２ ２
４ ２ ＋ ５ １ １ .９ ０
编辑ppt
17
标本留取及检测步骤
标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免 溶血和脂血。 检测步骤：1.反应液配制
2.核酸提取 3.核酸扩增 结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线 得到病毒的拷贝或IU/ML。
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18
注意事项
1.分区操作：PCR具有超敏感性，因此在 检测过程中应分区操作，即分为试剂准备 区，样品处理区，PCR扩增区。 2.试验前实验室应使用紫外消毒至少30分 钟。 3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时 更换，吸液时避免飞溅。
发夹引物（sunrise primer) 蝎状引物（scorpion primer) 复合探针（complex probes)
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12
Taqman探针原理
探针的5'端标记一个荧光基 团，3'标记另一个荧光基团。 5'端荧光基团吸收能量后将 能量转移给临近的3’端荧光 淬灭基团（FRET），正常 情况下检测不到该探针5'端 荧光基团发出的荧光信号。
指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号 的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对
未知模板进行定量分析。
Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：
分子诊断室项目介绍
内容
1.HBV-DNA荧光定量PCR 2.流式基本应用 3.染色体核型分析
HBV DNA荧光定量PCR
PCR技术简介
1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室 mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术， 从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望 成为现实。
1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪， 从而使PCR技术的自动化成为现实。
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13
Taqman探针原理
当溶液中模板变 性后低温退火时， 引物与探针同时 与模板结合。在 引物的介导下， Taq酶沿模板向前 合成子链，当延 伸至探针结合处， 发生链的置换；
编辑ppt
14
Taqman探针原理
Taq 酶的5‘—3’ 外切 酶活性
将探针5‘端连接的荧光基团
从探针上切割下来，游离于
２ ８ ＋ ＋ ＋ ２ ７ ９ ６ .４ ３
２９ ＋ ＋ ＋
２９ １００
１０
＋
＋
１０ １００
２８
＋
１ ３ .５ ７
３７
＋
＋
３ ８ .１ １
１０
＋
０
０
１０
＋
＋
０
０
────────────────────────────────────
荧光定量的标准曲线
未知标本 标准曲线
38
log (F2/F1) log (F2/F1)
Crossing Point (Cycles)
Target
n
n
编辑ppt
loBaidu Nhomakorabea (copy number)
11
荧光检测模式
（1）SYBR Green I 染料 （2）水解探针（Taqman） （3）杂交探针（Hybridization Probes） （4）分子信标（molecular beacon)
反应体系中，从而脱离3’端
荧光淬灭基团的屏蔽，发出
荧光，荧光信号与PCR产物
的数量成比例。因此根据
PCR反应液的荧光强度即可
计算出初始模板的数量。
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15
定量PCR在乙肝检测中意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播
随着PCR技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针 杂交定量PCR方法
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4
PCR基本原理
类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板， 利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附 加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补 链的过程。
编辑ppt
5
DNA 合成的必备要素
DNA Polymerase
dNTPs
single-stranded template
primer
编辑ppt
6
定量PCR概念
以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，对PCR起始模板量的定量
编辑ppt
7
常规PCR与定量PCR的比较
反应方式
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19
注意事项
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ＰＣＲ与乙肝标志物阳性率比较
── ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─
例数
HBsAg HBcIgG HBcIgM HBeAg HBeAb HBsAb PCR 阳 性 率 (％ )
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threshold=10×SD cycle0-15
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Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct 值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作 出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷 贝数。
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反应液成分
结果检测 结果性质 结果准确性
常规 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶 琼脂糖凝胶电泳 定性 无法区别假阴性、假阳 性
定量 PCR 2 步法 3 步法 dNTP，引物，模板， 酶，探针，参照 ELISA，或实时荧光检测 定量，或定性
有效识别假阴性假阳性
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实时荧光定量PCR原理
８ ６ ＋ ３ ４ ３ ９ .５ ３
４５
＋ ＋ １ ９ ４ ２ .２ ２
４ ２ ＋ ５ １ １ .９ ０
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标本留取及检测步骤
标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免 溶血和脂血。 检测步骤：1.反应液配制
2.核酸提取 3.核酸扩增 结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线 得到病毒的拷贝或IU/ML。
编辑ppt
18
注意事项
1.分区操作：PCR具有超敏感性，因此在 检测过程中应分区操作，即分为试剂准备 区，样品处理区，PCR扩增区。 2.试验前实验室应使用紫外消毒至少30分 钟。 3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时 更换，吸液时避免飞溅。
发夹引物（sunrise primer) 蝎状引物（scorpion primer) 复合探针（complex probes)
编辑ppt
12
Taqman探针原理
探针的5'端标记一个荧光基 团，3'标记另一个荧光基团。 5'端荧光基团吸收能量后将 能量转移给临近的3’端荧光 淬灭基团（FRET），正常 情况下检测不到该探针5'端 荧光基团发出的荧光信号。
指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号 的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对
未知模板进行定量分析。
Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧 光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：
分子诊断室项目介绍
内容
1.HBV-DNA荧光定量PCR 2.流式基本应用 3.染色体核型分析
HBV DNA荧光定量PCR
PCR技术简介
1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室 mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术， 从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望 成为现实。
1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪， 从而使PCR技术的自动化成为现实。
编辑ppt
13
Taqman探针原理
当溶液中模板变 性后低温退火时， 引物与探针同时 与模板结合。在 引物的介导下， Taq酶沿模板向前 合成子链，当延 伸至探针结合处， 发生链的置换；
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14
Taqman探针原理
Taq 酶的5‘—3’ 外切 酶活性
将探针5‘端连接的荧光基团
从探针上切割下来，游离于
２ ８ ＋ ＋ ＋ ２ ７ ９ ６ .４ ３
２９ ＋ ＋ ＋
２９ １００
１０
＋
＋
１０ １００
２８
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１ ３ .５ ７
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３ ８ .１ １
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０
１０
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荧光定量的标准曲线
未知标本 标准曲线
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log (F2/F1) log (F2/F1)
Crossing Point (Cycles)
Target
n
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loBaidu Nhomakorabea (copy number)
11
荧光检测模式
（1）SYBR Green I 染料 （2）水解探针（Taqman） （3）杂交探针（Hybridization Probes） （4）分子信标（molecular beacon)
反应体系中，从而脱离3’端
荧光淬灭基团的屏蔽，发出
荧光，荧光信号与PCR产物
的数量成比例。因此根据
PCR反应液的荧光强度即可
计算出初始模板的数量。
编辑ppt
15
定量PCR在乙肝检测中意义
1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播