纳豆激酶的生产提取工艺
纳豆激酶的提取研究
图&
不同饱和度的酶活
从图 & 可以看出， 当饱和度在 (%< 以下时， 酶活 随着饱和度的增加而增加； 当饱和度高于 (%< 时， 酶 活又随着饱和度的增加而下降。因此， 饱和度为 (%< 时， 盐析效果最好。
%1!#’ = #)* 时， 纳 豆 激 酶 在 洗 脱 时 间 为 &>(?!((#)*
时达到分离。
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分步法与一步法的选择
确定最佳 饱 和 度 为
参考文献：
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进行分步法或一步法的选择， 测沉淀 & 、 沉淀 (%< 后， 总酶活为酶活 & 、 结果如图 ! 。 ! 的酶活， ! 之和， 从图 ! 可以看出，沉淀 & 的酶活随着 饱 和 度 的 增加而增加； 而沉淀 ! 的活性在 !(< 时达到最高， 而 后随着饱和度的增加而降低；酶活的总和在 2(< 时 达到最高。因此， 将发酵液的饱和度先调至 2(< ， 离 心取沉淀，然后再将上清液调至 (%< 饱和度的盐析
工艺技术
(%% 2%% $%% !%% &%% % &% !% !( $% $( 2% 2( (%
沉淀 & 沉淀 ! 总和
析柱中， 待凝胶沉至离柱口约 !"# 的时候， 停止加凝 胶。用缓冲液平衡数小时， 再在胶柱上加入一张与内 径相近的滤膜片， 加入缓冲液平衡。吸干柱中多余的 缓冲液，用移液管加入 &#’ 用饱和硫酸铵提取的粗 酶液，待酶液完全渗入凝胶中时加入缓冲液进行洗 每管 $#’。收完 脱， 用自动收集器收集， &(#)* 一管， 后， 用紫外分光光度计测波长为 !+%*# 下的 ,- 值。 将各峰用纤维平板进行检测， 确定活性部分。
纳豆激酶分离纯化的工艺研究 韩超
• 2、把纯化液稀释20 倍点样于纤维蛋白平板，与80 U/mL 尿激酶标准品作对照，具有明显的溶纤效果。具体结果见 图1
出现明显的透明圈， 说明具有明显的溶纤 效果
• 3、按上述方法得到的纳豆激酶纯化液，经SDS-PAGE电 泳，得到一条单一色带（见图2），说明发酵液中的杂蛋 白已基本除掉；与标准蛋白比较，此单一带的分子量在 27~28 kD之间，这与有关文献报道的根据氨基酸序列结 算出的纳豆激酶精确分子量27.782 kD基本相符。
•
4、中试扩大试验按上述的试验方法作适当调
整后进行的中试扩大试验，收集OD280>0.05的 洗脱液。由此获得的纳豆激酶纯化液经广州药物 研究中心检测，纯度大于90% 。
•
5、冷冻干燥 用甘露醇和葡萄糖处理的纳豆激 酶纯化液冷冻干燥后，酶活力都比原来下降了 20~40%，使用甘氨酸处理，则冷冻干燥后的酶 活力仍能保持95% 以上，说明甘氨酸是纳豆激酶 冷冻干燥时很好的保护剂。故最终选取1%甘露醇 和2%甘氨酸作为纳豆激酶冷冻干燥的赋型剂，由 此制作出的纳豆激酶冻干制剂既有漂亮的饼形， 又基本能保持原来的酶活力。
希望大家批评指正！ 谢谢！
结论
• 1、 之前大部分文献报道的纳豆激酶分离纯化方法基本 都要经过硫酸铵沉淀、透析、阴阳离子交换层析或疏水层 析等多步层析（见表3），步骤繁复，时间长，操作工艺 复杂，且多为间歇操作，生产效率难以提高，选择性低， 从而造成纳豆激酶分离纯化的成本很高，也不适宜连续化 的大规模生产。本纯化工艺方法简单，发酵液经离心过滤 后，只需经过一步阳离子交换层析，就能获得纯度较高的 纳豆激酶纯化液。得到的纳豆激酶纯化液加入适当的赋型 剂真空冷冻干燥后，基本上就能出成品，适合在企业的大 规模连续生产中推广应用，从而真正实现科研成果向市场 产品的转化。
关于一种新型溶栓酶——纳豆激酶的简介
A novel nucleophilic catalytic mechanism for nattokinase. J Mol Graph Model 23(4):373–380
11
纳豆激酶作用机理
纳豆激酶
纤溶酶原激活物抑制剂
纤维蛋白
纤溶酶原激活物
纤溶酶
内源性尿激酶 纤维蛋白降解
尿激酶
纤溶酶原
纳豆激酶ＮＫ 可以直接激活纤溶酶原（ Pg ）产生纤溶酶（Pm）从而 降解血栓，也可直接对纤维蛋白进行降解，是研究较早且较完善的天然溶栓酶
纳豆激酶生产
2、植物分子农业（PMF）
利用植物系统产生人类药用重组蛋白
烟叶
优 点 通过黄豆矮病毒（BeYDV）
的DNA复制系统
缺
点
1、NK被细胞壁包被，经胃肠道时被保护
口服给药；经消化系统消耗 克服 时不会诱导免疫原性反应 手段
1、纳豆激酶被蛋白糖基化，患者注射 产生副作用：免疫原性
在植物种子中表达重组蛋白
活性提性高得两到倍提高
纳豆激酶几个保守的氨基酸序列被认为是其活性的主要决定因素，因此可以通过 定点诱变，提高纳豆激酶的稳定性，如对pH和温度的稳定性，催化活性和抗氧化活性。
17 Cai D1, Zhu C1, Chen S2. Microbial production of nattokinase: current progress, challenge and prospect.World J Microbiol Biotechnol. 2017 May;33(5):84
7
整体来说存在 半衰期短、
成本高等问题
第一代溶栓药物
传统溶 栓药物
第二代溶栓药物
发酵法生产纳豆激酶的研究进展
作为微生物工业化发酵三大技术领域之一的菌 种选育，在微生物药物的发酵生产中有着至关重要 的地位。当前，发酵工业中使用的生产菌株，大部 分都是通过不同的育种技术而得到的具有高产目的 产物的菌株。
使用传统的物理诱变剂和化学诱变剂处理均匀
分散的菌悬液，通过物理辐射和化学试剂能与 DNA 相互作用的特点实现对菌种遗传物质的改变，进而 筛选出少数优良性状的突变株。 1.1.1 紫外诱变
窑 82 窑
农产品加工
2019 年第 6 期
基胍对 T-3 纳豆杆菌处理 20 min，诱变 2 轮，筛选 得到突变株 Y2-1 菌株，其产纳豆激酶活力比原始菌 株提高 14.8%，达到 5 740 IU/mL。 1.1.3 硫酸二乙酯诱变
硫酸二乙酯 （DES） 也属于烷化剂的一种，是一 种 常 见 的 化 学 诱 变 剂 。 许 建 平 等 人 [11]对 枯 草 杆 菌 B826 进行硫酸二乙酯处理，并筛选得到高效稳定的 突变株。
Hale Waihona Puke 中图分类号：Q815文献标志码：A
doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2019.06.062
（1. School of Medicine and Chemical Engineering，Yangling Vocational & Technical College， Yangling，Shaanxi 712100，China；2. China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 211198，China）
2019 年第 6 期
第 6 期 （总第 482 期）
农产品加工
No.6
2019 年 6 月
纳豆激酶生产工艺
纳豆激酶生产工艺纳豆知识1、纳豆和纳豆激酶的生产工艺(1)、纳豆的生产过程：精选小粒黄豆→浸泡→清洗→蒸煮→沥干→降温至70度→无菌接种(纳豆菌)→35-52度培养24-36小时→分装→冷冻保存→纳豆纳豆是日本的传统食品，是选用优质黄豆经纳豆菌生物发酵而成。
纳豆的外表带有一层白霜，用筷子搅拌时，会拉出粘丝，拉丝越多越好。
纳豆常配入海鲜酱油、芥末等调味料直接食用，也可烹制各类菜肴。
纳豆需要冷藏保鲜，保质期一般在7~10天。
近几十年来，随着纳豆的有益健康的功能不断被发现，纳豆在日本风靡全国，不断掀起"纳豆热潮"。
目前，日本纳豆产业的年销售额已达2000亿日元(折合150亿人民币)。
(2)、纳豆激酶的生产工艺：1：生产纳豆激酶有两种做法。
一是考虑到纳豆激酶属于高分子物质，所以只要将高分子物质抽取出来即可。
但是用这种方法纳豆中的维他命和纳豆菌也会一起被舍弃掉。
另一种方法是有选择地抽取纳豆菌和纳豆菌的副产物。
用这种方法的话，纳豆菌中所包含的全部的物质都有可能抽取出来。
两种抽取方法谁优谁劣可谓一目了然。
生产的纳豆激酶粉末含有纳豆菌所能生成的全部物质。
正因为如此，能够生产自然的、稳定性高的纳豆激酶粉末。
详细请登陆 2、纳豆激酶纳豆中的纳豆激酶是直接分解血栓的纤维蛋白酶。
具有强大的溶栓作用，比尿激酶的能力还要强，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600FU，在胃肠中不失活。
纳豆激酶对血栓的作用时间长，与尿激酶3~5分钟作用时间相比，纳豆激酶作用长达8小时，而且安全、无副作用。
食用纳豆后，测定血液中形成血栓的物质会慢慢减少，溶解血栓的物质会越来越多，达到动态平衡。
常吃纳豆还会将毛细血管中的血栓溶解掉，有效改善微循环障碍。
A、人体实验结果发现纳豆激酶有以下作用：(1)缩短血栓溶解时间(2)增加血栓溶解面积(3)增加血栓溶解产物上图()是：纳豆消除体内血栓的临床实验(西村《视膜中心静脉闭塞症的治疗效果》)。
纳豆激酶生产工艺
纳豆激酶生产工艺纳豆知识1、纳豆和纳豆激酶的生产工艺(1)、纳豆的生产过程：精选小粒黄豆→浸泡→清洗→蒸煮→沥干→降温至70度→无菌接种(纳豆菌)→35-52度培养24-36小时→分装→冷冻保存→纳豆纳豆是日本的传统食品，是选用优质黄豆经纳豆菌生物发酵而成。
纳豆的外表带有一层白霜，用筷子搅拌时，会拉出粘丝，拉丝越多越好。
纳豆常配入海鲜酱油、芥末等调味料直接食用，也可烹制各类菜肴。
纳豆需要冷藏保鲜，保质期一般在7~10天。
近几十年来，随着纳豆的有益健康的功能不断被发现，纳豆在日本风靡全国，不断掀起"纳豆热潮"。
目前，日本纳豆产业的年销售额已达2000亿日元(折合150亿人民币)。
(2)、纳豆激酶的生产工艺：1：生产纳豆激酶有两种做法。
一是考虑到纳豆激酶属于高分子物质，所以只要将高分子物质抽取出来即可。
但是用这种方法纳豆中的维他命和纳豆菌也会一起被舍弃掉。
另一种方法是有选择地抽取纳豆菌和纳豆菌的副产物。
用这种方法的话，纳豆菌中所包含的全部的物质都有可能抽取出来。
两种抽取方法谁优谁劣可谓一目了然。
生产的纳豆激酶粉末含有纳豆菌所能生成的全部物质。
正因为如此，能够生产自然的、稳定性高的纳豆激酶粉末。
详细请登陆 2、纳豆激酶纳豆中的纳豆激酶是直接分解血栓的纤维蛋白酶。
具有强大的溶栓作用，比尿激酶的能力还要强，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600FU，在胃肠中不失活。
纳豆激酶对血栓的作用时间长，与尿激酶3~5分钟作用时间相比，纳豆激酶作用长达8小时，而且安全、无副作用。
食用纳豆后，测定血液中形成血栓的物质会慢慢减少，溶解血栓的物质会越来越多，达到动态平衡。
常吃纳豆还会将毛细血管中的血栓溶解掉，有效改善微循环障碍。
A、人体实验结果发现纳豆激酶有以下作用：(1)缩短血栓溶解时间(2)增加血栓溶解面积(3)增加血栓溶解产物上图()是：纳豆消除体内血栓的临床实验(西村《视膜中心静脉闭塞症的治疗效果》)。
纳豆激酶的提取、提纯程序
纳豆激酶的提取、提纯程序及活性测定孙雪天津工业生物技术研究所2013E8018261011由于我们实验室较少做酶的分离提纯，所以我选择了自己比较感兴趣的一种酶——纳豆激酶。
选择此酶的理由：人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、急性心肌梗塞等严重的心脑血管疾病，对中老年人的身体健康造成了很大的危害，目前全世界有血栓患者约1 500 万人，潜在的溶栓剂市场有20 亿美元[1]。
但当前的溶栓剂，如尿激酶( SK) 和链激酶(UK) ，它们作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选择性，副作用大；第二代溶栓剂如重组组织型纤溶酶原激活剂，存在着价格高的缺点等，难以成为适用于大众的药品。
而纳豆激酶具有溶栓能力强、无任何毒副作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点[2] ，市场前景极为诱人。
［3］纳豆激酶(Nattokinase , N K; 也称Subtilisin NAT ,Subtilisin BSP) 是由纳豆菌( Bacill us subtilis var. nat to) 产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶( Subtilisin)，属于水解酶类，催化蛋白质的水解。
现在可以由分离纯化的纳豆激酶DNA 序列推出其氨基酸序列,根据该顺序计算出该酶的分子量为27 728 u[4 ]，远小于尿激酶的分子量54 000 u。
用Svunsson柱型电泳法等电聚焦测得纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其p I 值为8. 6 ±0. 3。
[5 ]提取提纯程序：纳豆激酶是胞外酶［6］，故可利用纳豆菌的发酵液提取，省去了细胞破碎和缓冲液抽提的步骤。
具体方法如下［7］：（1）将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中，37℃恒温培养，4 000 rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液。
（2）用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等。
取上清液缓慢加入硫酸铵至25％饱和度，低温过夜，4 000 rpm离心30 min去除杂蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为60％，低温过夜，4 000 rpm离心30 min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液。
《纳豆激酶培训》课件
02
纳豆激酶的生产工艺
纳豆激酶的生产原料
纳豆
作为主要原料，纳豆是大豆经过纳豆菌发 酵后得到的产物，含有丰富的纳豆激酶。
生产用水
用于纳豆激酶提取和制备的水应符合相关 质量标准，以保证产品的纯度和安全性。
辅助性和 生物利用度的添加剂或载体。
纳豆激酶的生产过程
纳豆发酵
副作用轻微
在正常使用情况下，纳豆 激酶的副作用较为轻微， 如少数人可能出现胃肠道 不适、过敏反应等。
特殊人群慎用
孕妇、哺乳期妇女、儿童 及老年人等特殊人群在使 用纳豆激酶前应咨询医生 意见。
纳豆激酶的适用人群及使用方法
适用人群
适用于心脑血管疾病患者，帮助 改善血液循环，预防血栓形成。
使用方法
建议每天服用1-2次，每次1-2粒 ，根据个人情况适量增减。
纳豆激酶培训
CONTENTS
• 纳豆激酶简介 • 纳豆激酶的生产工艺 • 纳豆激酶的应用领域 • 纳豆激酶的市场前景 • 纳豆激酶的安全性及注意事项
01
纳豆激酶简介
纳豆激酶的来源
01
纳豆激酶是从纳豆中提取的一种 酶，纳豆是一种传统的日本食品 ，由大豆经过发酵而成。
02
纳豆激酶在纳豆发酵过程中产生 ，是纳豆中的重要生物活性成分 。
详细描述
纳豆激酶具有调节血糖和血脂的作用，可以辅助治疗糖尿病。研究表明，纳豆 激酶可以降低血糖和糖化血红蛋白水平，改善胰岛素抵抗，减轻糖尿病并发症 如心血管疾病、视网膜病变和肾脏疾病等的发生。
抗衰老保健
总结词
纳豆激酶具有抗衰老保健作用，能够清除自由基、抗氧化、增强免疫力。
详细描述
纳豆激酶含有丰富的抗氧化物质，如维生素C、维生素E和谷胱甘肽等，可以清除自由基、抗氧化、增强免疫力， 从而达到抗衰老保健的作用。研究表明，长期服用纳豆激酶可以改善皮肤弹性和光泽度，减少皱纹和色斑等衰老 迹象。
超滤法提取纳豆激酶的技术参数优化
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2010年第35卷第5期纳豆激酶(NK)是纳豆在发酵过程中由纳豆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成小肽和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样可直接溶解血栓[1]。
研究表明，纳豆激酶是一种溶栓效果十分显著，并且能够预防和抑制血栓产生与扩增的具有潜在药用价值的物质。
近年来国内外纳豆激酶分离纯化的相关研究很多，主要有层析法、磁性微球分离法、集成化分离技术，包括双水相亲和分配技术、扩张床吸附技术、混合模式扩张床吸附技术等。
以上分离Study on technology for extracting nattokinase by ultrafiltrationCHEN Jing-xin,LIU Yan-yan,SHA Wei,ZHANG Li-ping *(The Food Science of Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy,Daqing 163319)Abstract:Objective ：Studyed the impact of membrane flux on utrafiltration system pressure,ultrafiltration temperature and pH,determined the optimum conditions of nattokinase separation.Methods:the raw materials was prepared from crude nattokinase liquid,by ultrafiltration and chromatography determined the specific activity,purification multiples and recovery rate.Results:The optimized conditions were as following:reaction pressure 0.25MPa,liquid temperature 37℃,liquid pH 7,the specific activity 9610.46IU/mg,the purification multiple 2.36and the recovery rate 92.3%,the purified enzyme was demonstrated by SDS -PAGE to be a homogeneous protein,molecular mass was about 28000u.Conclusion:It is feasible to separate and purify nattokinase by using ultrafiltration technology,and it can elevate activity and the recovery rate.Key words:nattokinase;ultrafiltration;enzyme activity;purification multiple;recovery 陈景鑫，刘妍妍，沙维，张丽萍*(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319)摘要：目的：研究超滤系统中超滤压力、超滤温度、料液pH 值主要参数对膜通量的影响，确定超滤分离纳豆激酶的最佳工艺条件。
（提高纳豆激酶的方法）自制纳豆,游刃有余
（提高纳豆激酶的方法）自制纳豆,游刃有余三、提高纳豆激酶的方法材料一:纳豆激酶的生产提供一种得率高，酶活高，成本低，可进行产业化生产的纳豆激酶的生产方法。
依次包括下述两个步骤：(一)、发酵；所述第的发酵是固体发酵，该发酵过程依次有如下工序:①用特制浸泡液浸泡优质黄豆，所述的特制浸泡液的配方为：牛肉浸膏5～l0g，蛋白胨4～12g，酵母浸出汁3—8g，NaCl 5～l0g，葡萄糖l5～20g，自来水l000ml，PH值为6.8～7，浸泡到黄豆吸足水份，豆无硬心，表面无皱纹为止；②装瓶灭菌接种：采用常规灭菌方法，等瓶温自然冷却至40℃以下，在无菌条件下接种，接种所用的菌种是枯草芽孢杆菌；③培育：采用常规培养条件；采用高低温培养方法，先在37℃下培养22—32小时后马上转入3～10℃条件下保温，l2～24小时获得发酵物。
(二)、将经发酵步骤后得到的干燥物粉碎；①干燥：采用常规方法。
干燥工序中采用的是将发酵物进行低温真空冷冻干燥，发酵物水分小于l5％时干燥结束。
②粉碎是采用细胞破壁技术。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物，其特殊之处在于：制备片剂、冲剂、硬胶囊、软胶囊或口服液时，在所得产物中直接添加可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糊精(等)配料调整至每克内有200～680的酶活单位。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物每克内有200～380的酶活单位，具有预防心血管疾病的作用。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物每克内有300～680的酶活单位，具有治疗心血管疾病的作用。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的冻干粉每克内含大于800的酶活单位，制备的针剂纯度达95％以上。
下面将通过实施例对方案作详细叙述：第一部分：纳豆激酶的生产方法1、使用特制浸泡液的实施例及其与使用常规浸泡液的产物酶活比较实验条件：300ml三角瓶加入特制浸泡液浸泡过的大豆l0g，调PH7，121℃灭菌15min，接入枯草芽孢杆菌斜面菌种，在37℃条件下培养24小时，常规干燥、常规粉碎后测定酶活。
生物工程下游技术纳豆激酶提取实验
《生物工程下游技术》综合实验——纳豆激酶的分离纯化摘要从纳豆发酵液中提取纳豆激酶，采用30~70%饱和度的硫酸铵盐析，Sephadex G-75凝胶过滤层析对活性组分进行分离提纯。
然后检测各个步骤的样品的蛋白质含量，绘制凝胶层析图，得出峰值，最后对整个纯化方案进行评价。
结果表明，本次实验纯化回收率较低。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的，透明质酸(hyaluronicacid，简称HA)，是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。
关键词：纳豆激酶硫酸铵盐析凝胶层析目录1 前言 (4)2 材料和仪器 (4)2.1 仪器 (4)2.2 材料 (4)2.3 试剂及溶液配制 (4)3 实验方法 (5)3.1 纳豆的制作 (5)3.2 纳豆激酶的粗提 (5)3.2.1 浸提 (5)3.2.2 硫酸铵盐析 (5)3.3 Sephadex G-75凝胶层析进行纯化 (6)3.4 蛋白质含量的测定 (7)4 结果与分析 (7)4.1 蛋白质含量测定结果 (7)4.2 层析收集液测定结果 (7)4.2.2 绘制纳豆激酶的层析图 (8)4.2.3 纯化方案进行评价 (9)5 讨论 (9)5.1方法分析 (9)5.2 问题及其猜想 (10)参考文献 (12)1 前言心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其死亡率已超过了癌症。
而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用于治疗血栓的药物,如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等,但是它们大多为注射用药,使用不便,且副作用大、半衰期短,很难满足血栓治疗的需要。
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纳豆激酶的生产提取工艺
纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。
具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。
一、发酵液生产
1、菌种活化
无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。
2、种子液的制备
种子培养基成分
无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L
其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）
挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。
3、发酵培养
无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L
其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）
按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。
二、预处理和固液分离
采用离心的方法。
将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。
收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。
三、提取
1、分级盐析法
使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。
将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。
再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。
将过夜的发酵液4 ℃冷冻离心10 min，离心转速10000 r/min，得到的沉淀为含有少量杂蛋白的纳豆激酶。
2、超滤的方法
由于纳豆激酶的相对分子量大于超滤膜的的截留相对分子质量，可利用小分子及水能够透过半透膜而纳豆激酶被截留的原理进行除盐。
将上述的盐析沉淀溶解后，使用超滤装置，将盐析液在空压（0.1 Mpa）下进行超滤（膜截留相对分子质量为1.0×104），期间不断向截留液补加蒸馏水。
超滤大约持续1h，超滤过程中不断取出少许透过液，加入溶液，检测是否白色沉淀产生，如无沉淀说明盐离子己除净，超滤结束。
四、精制
1、离子交换层析
离子交换层析是利用高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行分离的方法。
蛋白质的等电点是离子交换层析的重要依据，文献报道的纳豆激酶的等电点pI 8.6±0.3，选择SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换树脂对纳豆激酶进一步分离纯化。
将弱阳离子交换剂SP Sepharose Fast Flow装柱,用一定体积的0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)平衡离子交换层析柱。
静置待沉降后用缓冲液以3 mL/min 流速压住，继续用样品缓冲液润洗树脂，直到离子强度及蛋白质浓度洗脱至基线，洗脱液pH与样品缓冲液pH 一致；纳豆激酶经盐析得到的粗酶液经超滤脱盐后,调整离子强度及pH，然后将粗酶液缓慢加入层析柱中，打开柱出口，让酶液进入树脂，
直到酶液表面与树脂的表面重合，关闭出口；先用先用0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)洗脱未吸附的蛋白，然后用含0.5 mol/L NaCl 的0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
2、凝胶过滤层析
凝胶过滤,亦称分子筛层吸附、排阻层析。
它是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析的一种方法。
文献报道纳豆激酶的分子量27.300-35.000 KDa，因此选择Sephadex G-75 凝胶对纳豆激酶进行进一步的分离纯化。
凝胶的预处理：称取一定量的Sephadex G-75 凝胶，加入100倍的0.2 mol/L p H7.5 磷酸盐缓冲液后恒温水浴加热，逐渐升高温度至近沸，缓慢搅拌持续2 h后取出，冷却至室温即可。
此法既可以杀菌消毒，同时可以排除凝胶内的气泡。
凝胶过滤层析：首先向凝胶柱中加入约1/3 柱高的缓冲液，打开层析柱出口，当有液体流出时关闭出口，以排除层析柱下层支撑滤片下空隙里的气泡。
然后将溶胀好的凝胶和缓冲液按3:1 的比例混匀成的凝胶浆边搅拌边缓慢、连续沿玻璃棒加入层析柱中（此过程必须一次完成，不能间断，否则柱面不平影响分离效果），当凝胶加到柱顶端后，打开柱底出口加快装住过程，然后用约3倍柱体积的缓冲液洗脱平衡凝胶柱。
打开凝胶柱下端出口，当缓冲液平面与凝胶面相平时关闭出口，将离子交换层析中有纳豆激酶酶活的洗脱液缓慢加入柱中，当酶液全部渗入凝胶中，缓慢加入约4cm 高的缓冲液后开始洗脱。
收集洗脱液。
3、SDS-PAGE 电泳检测
将凝胶过滤层析中的洗脱液收集后，进行SDS-PAGE 电泳检测。
将样品浓缩，与样品缓冲液（20μL+5μL）在离心管内混合均匀，100 ℃沸水浴中加热5 min，待冷却至室温后将20μL 样品注入点样孔中；连接好电极，调整电压为40 V，电泳约30 min 至分离胶，然后重新调整电压为100 V，电泳约 2 h 至溴酚蓝靠近凝胶的底部，关闭电源，电泳结束，得到电泳图，若得到单一的纳豆激酶蛋白条带，表明分离得到的纳豆激酶已经达到电泳纯。
五、成品制作
将上述得到的高纯度的纳豆激酶溶液用孔径的10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，再将得到的浓缩液经真空冷冻干燥后得到纳豆激酶粉末。
也可采用冷冻浓缩的方法对溶液进行浓缩，和可采用喷雾干燥的方法得到纳豆激酶干粉。