纳豆激酶的生产提取工艺

纳豆激酶的生产提取工艺

纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。

一、发酵液生产

1、菌种活化

无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

2、种子液的制备

种子培养基成分

无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L

其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）

挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。

3、发酵培养

无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L

其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）

按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。

二、预处理和固液分离

采用离心的方法。将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。

三、提取

1、分级盐析法

使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。

将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。将过夜的发酵液4 ℃冷冻离心10 min，离心转速10000 r/min，得到的沉淀为含有少量杂蛋白的纳豆激酶。

2、超滤的方法

由于纳豆激酶的相对分子量大于超滤膜的的截留相对分子质量，可利用小分子及水能够透过半透膜而纳豆激酶被截留的原理进行除盐。

将上述的盐析沉淀溶解后，使用超滤装置，将盐析液在空压（0.1 Mpa）下进行超滤（膜截留相对分子质量为1.0×104），期间不断向截留液补加蒸馏水。超滤大约持续1h，超滤过程中不断取出少许透过液，加入溶液，检测是否白色沉淀产生，如无沉淀说明盐离子己除净，超滤结束。

四、精制

1、离子交换层析

离子交换层析是利用高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行分离的方法。蛋白质的等电点是离子交换层析的重要依据，文献报道的纳豆激酶的等电点pI 8.6±0.3，选择SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换树脂对纳豆激酶进一步分离纯化。

将弱阳离子交换剂SP Sepharose Fast Flow装柱,用一定体积的0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)平衡离子交换层析柱。静置待沉降后用缓冲液以3 mL/min 流速压住，继续用样品缓冲液润洗树脂，直到离子强度及蛋白质浓度洗脱至基线，洗脱液pH与样品缓冲液pH 一致；纳豆激酶经盐析得到的粗酶液经超滤脱盐后,调整离子强度及pH，然后将粗酶液缓慢加入层析柱中，打开柱出口，让酶液进入树脂，

直到酶液表面与树脂的表面重合，关闭出口；先用先用0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)洗脱未吸附的蛋白，然后用含0.5 mol/L NaCl 的0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。

2、凝胶过滤层析

凝胶过滤,亦称分子筛层吸附、排阻层析。它是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析的一种方法。文献报道纳豆激酶的分子量27.300-35.000 KDa，因此选择Sephadex G-75 凝胶对纳豆激酶进行进一步的分离纯化。

凝胶的预处理：称取一定量的Sephadex G-75 凝胶，加入100倍的0.2 mol/L p H7.5 磷酸盐缓冲液后恒温水浴加热，逐渐升高温度至近沸，缓慢搅拌持续2 h后取出，冷却至室温即可。此法既可以杀菌消毒，同时可以排除凝胶内的气泡。

凝胶过滤层析：首先向凝胶柱中加入约1/3 柱高的缓冲液，打开层析柱出口，当有液体流出时关闭出口，以排除层析柱下层支撑滤片下空隙里的气泡。然后将溶胀好的凝胶和缓冲液按3:1 的比例混匀成的凝胶浆边搅拌边缓慢、连续沿玻璃棒加入层析柱中（此过程必须一次完成，不能间断，否则柱面不平影响分离效果），当凝胶加到柱顶端后，打开柱底出口加快装住过程，然后用约3倍柱体积的缓冲液洗脱平衡凝胶柱。打开凝胶柱下端出口，当缓冲液平面与凝胶面相平时关闭出口，将离子交换层析中有纳豆激酶酶活的洗脱液缓慢加入柱中，当酶液全部渗入凝胶中，缓慢加入约4cm 高的缓冲液后开始洗脱。收集洗脱液。

3、SDS-PAGE 电泳检测

将凝胶过滤层析中的洗脱液收集后，进行SDS-PAGE 电泳检测。

将样品浓缩，与样品缓冲液（20μL+5μL）在离心管内混合均匀，100 ℃沸水浴中加热5 min，待冷却至室温后将20μL 样品注入点样孔中；连接好电极，调整电压为40 V，电泳约30 min 至分离胶，然后重新调整电压为100 V，电泳约 2 h 至溴酚蓝靠近凝胶的底部，关闭电源，电泳结束，得到电泳图，若得到单一的纳豆激酶蛋白条带，表明分离得到的纳豆激酶已经达到电泳纯。

五、成品制作

将上述得到的高纯度的纳豆激酶溶液用孔径的10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，再将得到的浓缩液经真空冷冻干燥后得到纳豆激酶粉末。

也可采用冷冻浓缩的方法对溶液进行浓缩，和可采用喷雾干燥的方法得到纳豆激酶干粉。