免疫组化-切片

免疫组化——切片

包埋

1、剪取小鼠的整个耳部组织放入1XHBSS中，解剖出颞骨，放入4%PFA中固定（1ml

16%PFA+3ml 1XPBS），在颞骨的顶端打孔，用注射器分别从圆窗、椭圆窗处注射4%的PFA，shake 1-2h,4°过夜

2、如果小鼠大于8天，把颞骨放入0.5M EDTA中脱钙1-3天

P8-P15，1天

P15-P30，2天

大于P30，3天

3、1X PBST洗3次，每次3分钟

4、把颞骨转入15%的蔗糖溶液中，真空1h,4°过夜

5、把颞骨放入20%蔗糖溶液中，真空1h，之后转入30%蔗糖溶液中，真空1h，4°过夜

6、把颞骨放入50% 30%蔗糖溶液+50% OCT中，真空1h,4°过夜

7、把颞骨放入30% 30%蔗糖溶液+70% OCT中，真空1h,把颞骨放入15% 30%蔗糖溶液+85%

OCT中，真空1h,把颞骨放入100% OCT中，调整位置，圆窗、椭圆窗着地，真空1h,4°过夜

8、把放入100%OCT的颞骨继续真空1h,调整位置，放入冰冻切片机中速冻20min,再放入-80°

冰箱。

9、切片,切好的片子先放入-20°，过夜，再放入4°

实验前一天准备好玻片：用10%的多聚赖氨酸涂玻片，放在实验桌上晾干。

提前半小时调冰冻切片机：刀片温度和机内温度调至-20°，切片子时刀片要用新的，切好的片子在切片机的玻璃上烤30min-1h.当天切的片子一般第二天才可以用。

染色

1、挑选切好的片子，在staining box中用PBST洗涤3次（为防止sample脱落，每次都是先倒入PBST再放片子，洗完片子，用无纸屑的纸巾擦干玻片之后再加试剂）

2、用液体蜡画方格，先画出整体轮廓，再分成每个小格，每个小方格内加blocking medium

约50μl，RT,封闭1-2h（为了防止blocking medium挥发，湿盒里加有水）

4、把一抗加入PBT-1中vortex，每个sample 50ul ，4°overnight（蜡笔画的方格容易脱落，

每次加入试剂之前都要再重新画方格，玻片放在湿盒里，湿盒中加有水，以防一抗挥发）

3、PBST洗涤3次/5min

4、把二抗加入PBT-2中，每个sample 50ul ,1h（此步骤在黑暗的环境下操作，以防荧光淬

灭，玻片放在加有水的湿盒中）

5、PBST洗3次/5min,擦干（不要让sample过于干燥）

6、每个sample加半滴DAKO

7、盖上盖玻片，用指甲油封片。

1、100ml 16%PFA配制：称取

16g PFA加到84ml的1X PBS中

2、1L 0.5M EDTA的配制：186.1g EDTA溶于ddH2O中，调节PH至8.0，定容至1L

3、1000ml PBST的配制：10ml 10%Triton-100+990ml 1XPBS

4、300ml 30%蔗糖配制：90g蔗糖+210ml ddH20

5、10%Triton-10配制：500ml 1XPBS+56ml Triton-100 一抗：

SOX2 1:200

GATA3 1:1000

MYO7A 1:1000

二抗：

Cy5 1:200

FITC 1:400

TRIC 1:400